2021, Vol. 29
2. 福建省农业科学院科技服务处, 福州 350003
2. Institute of Technology Services, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China
番石榴(Psidium guajava)，又名芭乐、拔子、喇叭果、鸡屎果等，为桃金娘科(Myrtaces)番石榴属热带果树，原产于热带美洲[1]，在我国广泛种植于海南、云南、广西、广东、福建、台湾等地区。番石榴果实清甜脆爽，香气独特，含有较丰富的蛋白质、维生素A、维生素C等营养物质和磷、钙、镁等微量元素[2]，以及果胶、生物碱、类黄酮、三萜类、皂苷等生物活性物质[3–4]。番石榴叶则含有三萜、黄酮、鞣质、倍半萜、挥发油等多种结构类型的化学成分[5–10]。其果、叶具有抗氧化、抗菌、抗腹泻、保肝、降血糖、降血脂、降血压、抗心血管疾病和抗肿瘤等功效[11–14]。
目前，对番石榴功效的研究主要集中于番石榴叶的活性成分和生物活性。Deguchi等[15]的临床试验表明，番石榴叶茶能显著降低糖尿病患者餐后血糖水平、血清中胆固醇和甘油三酯的含量。Pongsak等[16]的研究表明番石榴叶提取物中的黄酮类物质, 如桑色素-3-O-来苏糖苷、桑色素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷等，对体内肠道细菌的抗菌效果良好。Rizzo等[17]报道，番石榴叶中杂萜类成分guajadial、psidial A、psiguadial A和psiguadial B对抑制小鼠乳腺癌细胞的生长非常有效，且比临床化疗药物对机体的毒性更低。Ojewole[18]的研究表明盐敏感的高血压大鼠在静脉注射番石榴叶提取物后，其血压和心率均显著降低。
番石榴种植过程中因修剪、疏果等措施会产生叶和幼果等副产物，大量的叶和幼果多被种植户丢弃。已有研究表明这2种副产物均具有很高的药用价值，可作为药材。相对于番石榴叶，对幼果的研究还较少，对不同品种及其叶和幼果的活性成分的比较研究更少。本文以4个番石榴品种叶和幼果为研究对象，测定其提取物的酚类和黄酮含量、清除自由基能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并对提取物的酚类成分进行分析，旨在筛选活性较强的番石榴品种及其副产物(叶和幼果)，为番石榴充分开发利用提供参考依据。
1 材料和方法 1.1 材料和仪器材料 番石榴(Psidium guajava)叶和幼果于2018年10月采自福建省农业科学院亚热带农业研究所闽台种质资源圃。供试品种有‘珍珠’、‘水蜜’、‘红宝石’和‘西瓜’。每个品种随机选取9株健康植株采集健壮叶和谢花后30 d的幼果，每3株叶或幼果混合成1个样品，即每个品种的叶与果实均设3个重复。表儿茶素、槲皮素、根皮苷、杨梅苷、咖啡酸、异阿魏酸、阿魏酸、鞣花酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品购于北京索莱宝科技有限公司，纯度均≥98%。
仪器 Waters Acqutiy UPLC H-Class超高效液相色谱、Xevo TQ-S三重四级杆质谱(美国Waters公司)；CR22N高速冷冻离心机(日本HITACHI公司); UPW-20N超纯水机(北京历元电子仪器有限公司); BS110S分析天平(德国Sartorius集团)；PC650超声波细胞破碎仪(上海皓庄仪器有限公司); RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); GZX-9246 MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司); L5S紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)。
1.2 方法叶和幼果提取物的制备 将采集的叶和果实(切块)置于60℃烘干，用粉碎机粉碎，过80目筛, 将粉末与体积分数60%乙醇按1∶20 (m/v)混合, 用超声波破碎仪超声提取30 min，功率为200 W, 连续超声时间3 s，超声间隔时间4 s。提取液用高速冷冻离心机5 170×g离心15 min，取上清液待测。
酚类、黄酮含量测定 参照Xu等[19]的方法测定。酚类含量测定以没食子酸为标准品，建立线性回归方程y=0.0018x-0.0032 (0~300 μg/mL, R²=0.999 5), 式中，y为吸光值，x为没食子酸质量浓度(μg/mL)。酚类含量以1 g干叶或幼果中所含的相当于没食子酸的质量表示，单位为mg/g。黄酮含量测定以芦丁为标准品，建立线性回归方程y=0.0026x–0.0047 (0~ 300 μg/mL, R²=0.998 8), 式中, y为吸光度值，x为芦丁质量浓度(μg/mL)。黄酮含量以1 g干叶或幼果中所含的相当于芦丁的质量表示，单位为mg/g。
清除自由基能力测定 参照前人[19–21]的方法测定提取物对DPPH·、ABTS+、HO·的清除能力。
α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 参照邱珊莲等[22]的方法测定。
1.3 UPLC-MS/MS分析酚类成分色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温: 40℃；流速：0.2 mL/min；进样体积：4 μL；流动相A：5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱(洗脱程序：0~5 min, 90%~10% A；5~6 min, 10% A；6~8 min, 10%~50% A；8~9 min, 50%~90%；9~10 min, 90% A)。
质谱条件 离子源：电喷雾离子化源(ESI)正负模式；离子源温度：120℃；扫描方式：多级反应监测(MRM)；毛细管电压：3.0 kV (正模式)、1.5 kV (负模式)；脱溶剂气温度：500℃ (正模式)、450℃ (负模式)。质谱参数见表 1。
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表 1 对照品的质谱参数和线性关系 Table 1 Mass spectrometry parameters and linear regression equation of standards |
对照品溶液制备和测定 精确称取表儿茶素、槲皮素、根皮苷、杨梅苷、咖啡酸、异阿魏酸、阿魏酸、鞣花酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品，用色谱纯甲醇配制成1.0 mg/mL的对照品储备液。精确量取对照品储备液，用甲醇配制成系列质量浓度梯度为0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL的混合对照品溶液。以峰面积(y)对其质量浓度(x, μg/mL)进行线性回归，得到回归方程。
供试样品制备 称取8 g叶或幼果粉末，超声提取液在50℃下减压旋蒸除去乙醇，将浓缩液真空冷冻干燥，称量并记录冻干粉质量。准确称取50 mg冻干粉，用甲醇定容到50 mL，配制成1 mg/mL的溶液，过0.22 μm有机相滤膜，取滤液待测。
1.4 数据处理试验数据采用Excel 2007进行线性回归分析; 采用SPSS 22.0统计软件进行相关性和单因素方差分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著；采用OriginPro 8.6软件作图。
2 结果和分析 2.1 提取物中酚类与黄酮含量4个番石榴品种叶的酚类、黄酮含量均高于幼果(表 2)，叶的酚类含量为148.08~165.98 mg/g，幼果为15.98~34.85 mg/g；叶黄酮含量为90.33~99.30 mg/g，幼果为9.27~25.03 mg/g。叶酚类含量依次为‘珍珠’ > ‘红宝石’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’，‘珍珠’和‘红宝石’间无显著差异，但显著高于‘水蜜’和‘西瓜’；幼果酚类含量依次为‘红宝石’ > ‘珍珠’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’，‘红宝石’显著高于其余3个品种。叶黄酮含量依次为‘红宝石’ > ‘水蜜’ > ‘珍珠’ > ‘西瓜’，‘红宝石’和‘水蜜’间无显著差异，但显著高于‘珍珠’和‘西瓜’；幼果黄酮含量依次为‘红宝石’ > ‘珍珠’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’，‘红宝石’显著高于其余3个品种。‘珍珠’和‘红宝石’叶的酚类和黄酮含量优势明显，‘红宝石’幼果的酚类和黄酮含量优势明显。
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表 2 番石榴叶和幼果的酚类和黄酮含量 Table 2 Contents of phenols and flavonoids from leaves and young fruits of guava |
在0.05~0.40 mg/mL范围内，4个番石榴品种叶和幼果提取物对DPPH·的清除率与提取物质量浓度成线性量效关系(表 3)。叶提取物对DPPH·的清除能力均显著高于幼果，清除能力表现为‘珍珠’ > ‘红宝石’ > ‘西瓜’ > ‘水蜜’，‘珍珠’与‘红宝石’间无显著差异，‘珍珠’显著高于‘水蜜’和‘西瓜’；幼果提取物对DPPH·的清除能力表现为‘红宝石’ > ‘珍珠’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’，与幼果的酚类和黄酮含量的变化规律一致，幼果对DPPH·的清除能力在品种间均存在显著差异，‘红宝石’幼果有显著优势。‘珍珠’叶提取物对DPPH·的清除能力最强。
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表 3 番石榴叶和幼果提取物的清除自由基能力 Table 3 Free radicals scavenging activities of leaves and young fruits extracts from guava |
在0.10~0.50 mg/mL范围内，4个番石榴品种叶和幼果提取物对ABTS+的清除率与提取物质量浓度成线性量效关系(表 3)。叶提取物对ABTS+的清除能力均显著高于幼果，清除能力表现为‘珍珠’ > ‘红宝石’ > ‘西瓜’ > ‘水蜜’，‘珍珠’与‘红宝石’间无显著差异；幼果提取物对ABTS+的清除能力表现为‘红宝石’ > ‘珍珠’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’，品种间均存在显著差异。‘珍珠’叶提取物对ABTS+的清除能力最强。
2.4 对HO·的清除能力在0.10~0.50 mg/mL范围内，4个品种番石榴叶和幼果对HO·的清除率与提取物质量浓度成线性量效关系(表 3)。叶提取物对HO·的清除能力均显著高于幼果，清除能力为‘珍珠’ > ‘红宝石’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’；幼果提取物对HO·的清除能力为‘红宝石’ > ‘珍珠’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’。8个样品中，‘珍珠’叶提取物对HO·的清除能力最强。
2.5 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用4个番石榴品种叶和幼果提取物质量浓度与抑制率均呈对数函数关系，呈抛物线形曲线(表 4)。根据IC50可知，4个品种叶和幼果提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均高于阳性对照组阿卡波糖(IC50为3 133.47 µg/mL)，叶提取物显著高于幼果，叶提取物的抑制活性表现为‘珍珠’ > ‘水蜜’ > ‘西瓜’ > ‘红宝石’，白肉番石榴高于红肉；幼果提取物表现为‘红宝石’ > ‘西瓜’ > ‘珍珠’ > ‘水蜜’，红肉番石榴显著高于白肉。‘珍珠’叶提取物的抑制活性最强。
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表 4 番石榴叶和幼果提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性 Table 4 Inhibitory activity on α-glucosidase of extracts from leaves and young fruits of guava |
从表 5可见，番石榴叶和幼果的酚类、黄酮含量与清除DPPH·、ABTS+、HO·能力均呈极显著的正相关性(P < 0.01, 0.909 5≤r≤0.920 0; P < 0.01, 0.921 9≤r≤0.931 8)，与α-葡萄糖苷酶抑制活性具有显著的正相关性(P < 0.05, r=0.787 0; P < 0.05, r=0.804 1)。
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表 5 番石榴叶和幼果中酚类、黄酮含量与生物活性的相关性 Table 5 Correlation between the biological activities and contents of phenols and flavonoids in guava leaves and young fruits |
10种对照品的UPLC-MS/MS总离子流图见图 1。对4个番石榴品种叶和幼果提取物的酚类成分进行测定，所含的酚类成分相似，但含量存在差异(表 6)。‘珍珠’和‘水蜜’叶中主要酚类成分含量为槲皮素- 3-O-葡萄糖苷 > 金丝桃苷 > 鞣花酸 > 杨梅苷; ‘红宝石’叶为槲皮素-3-O-葡萄糖苷 > 杨梅苷 > 金丝桃苷 > 鞣花酸；‘西瓜’叶为槲皮素-3-O-葡萄糖苷 > 金丝桃苷 > 杨梅苷 > 鞣花酸。‘珍珠’幼果中主要酚类成分含量为杨梅苷 > 根皮苷 > 槲皮素-3-O-葡萄糖苷 > 金丝桃苷；‘水蜜’幼果为根皮苷 > 表儿茶素 > 槲皮素-3-O-葡萄糖苷 > 金丝桃苷；‘红宝石’幼果为根皮苷 > 表儿茶素 > 杨梅苷 > 金丝桃苷；‘西瓜’幼果为槲皮素-3-O-葡萄糖苷 > 金丝桃苷 > 杨梅苷 > 表儿茶素。可见，除根皮苷外，叶的各酚类成分含量均显著高于幼果。
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图 1 10种对照品(2 μg/mL)的UPLC-MS/MS总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatogram of standards (2 μg/mL) by UPLC-MS/MS |
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表 6 番石榴叶和幼果提取物中的酚类组分含量(mg/kg) Table 6 Contents (mg/kg) of phenolic constituents extracted from guava leaves and young fruits |
酚类和黄酮是抗氧化和降血糖的重要活性物质。从广泛性来说，黄酮类物质属于酚类中的一员, 但其具有C6-C3-C6的特殊分子结构[23]。已有研究表明番石榴叶和果中均含有酚类和黄酮类物质，但不同品种及不同部位间的含量差异较大。郑必胜等[24]报道广东主栽的‘红心番石榴’的酚类、黄酮含量和抗氧化活性显著高于‘珍珠’、‘白玉珍珠’和‘胭脂红’品种，且果皮中的含量远高于果肉。侯峰[25]报道广州地区番石榴叶中黄酮含量为73.5~133.4 mg/g, 平均100.5 mg/g；幼果8.6~12.3 mg/g，平均9.9 mg/g，叶中黄酮含量约是幼果的10倍。本文测定了4个番石榴品种叶和幼果的酚类和黄酮含量，结果表明不同品种间、叶与幼果间的酚类和黄酮含量均具有显著差异。UPLC-MS/MS分析结果表明4个番石榴品种的叶提取物中主要酚类成分均为槲皮素-3- O-葡萄糖苷、金丝桃苷、杨梅苷、鞣花酸。‘珍珠’、‘水蜜’、‘红宝石’幼果提取物中主要酚类成分为根皮苷、表儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、金丝桃苷、杨梅苷，而‘西瓜’幼果提取物不含根皮苷。槲皮素- 3-O-葡萄糖苷、金丝桃苷、杨梅苷是叶和幼果共有的主要酚类成分，而鞣花酸则为叶片特有的酚类成分，在幼果中未检出。根皮苷是‘珍珠’、‘水蜜’和‘红宝石’幼果的主要酚类成分，也是10种酚类成分中唯一1种在幼果中的含量高于叶片的成分。番石榴叶中大部分酚类成分的含量均显著高于幼果。
3.2 酚类、黄酮含量与清除自由基能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性的关系本研究测定了4个番石榴品种叶与幼果提取物对3种自由基(DPPH·、ABTS+、HO·)的清除能力和对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，结果均表明‘珍珠’叶提取物的活性最强，各品种叶提取物的活性均显著高于幼果。Chen等[26]也报道番石榴叶提取物的抗氧化作用强于果。相关性分析结果表明，番石榴叶和幼果提取物的清除自由基能力与酚类、黄酮含量呈极显著正相关(P < 0.01)，α-葡萄糖苷酶抑制活性与其呈显著正相关(P < 0.05)。曹双[27]报道番石榴抗氧化能力指数与其酚类、黄酮含量具有显著相关性。我们前期研究表明，同为桃金娘科的树葡萄(Myrciaria cauliflora)不同成熟度果实中总酚和总黄酮含量与抗氧化能力呈显著正相关[28]；罗广华等[29]报道从植物中分离的鞣酸对
4个番石榴品种叶提取物的酚类和黄酮含量、清除自由基能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性均显著高于幼果。叶提取物酚类成分均包含表儿茶素、槲皮素、根皮苷、杨梅苷、咖啡酸、异阿魏酸、阿魏酸、鞣花酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。除鞣花酸外，大部分存在于叶中的酚类在幼果中也有检出，叶酚类成分的含量均明显高于幼果(根皮苷除外)。4个品种中，‘珍珠’叶酚类含量最高，提取物对DPPH·、HO·、ABTS+等3种自由基的清除能力和对α-葡萄糖苷酶抑制活性最强，因此，‘珍珠’番石榴叶用于开发抗氧化剂及α-葡萄糖苷酶抑制剂最具优势。
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