2021, Vol. 29
2. 重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所, 重庆 401329
2. Vegetable and Flower Research Institute, Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 401329, China
辣椒(Capsicum annuum)是我国第二大蔬菜作物，但其产值和效益居蔬菜之首[1–2]。疫病是影响辣椒生产的主要病害之一[3]，我国自1940年首次在江苏发生辣椒疫病以来[4]，西北[5–6]、东北[7]、西南[8–9]、东部沿海[10]等多个省份辣椒种植区都有此病发生。目前普遍的辣椒疫病防治方法是化学杀菌[11]，然而，辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)易产生抗药性，并且长期使用化学药剂容易对土壤造成污染，不利于辣椒生产可持续发展。培育抗病品种是解决疫病危害的最理想措施，但常规育种田间筛选工作量大、周期长，同时还受到环境影响。随着生物技术的迅速发展，采用抗疫病分子标记辅助选育能够大大提高育种效率[12–14]。
目前已开发出大量与辣椒抗疫病相关的分子标记[15–16]，然而，由于辣椒疫病抗性遗传机理复杂，利用不同抗性材料开发出的抗性相关分子标记在不同种质上差异较大，因此，针对不同的辣椒疫病抗性材料筛选出适宜的分子标记，是开展分子标记辅助抗疫病育种的前提条件。重庆是加工型辣椒的主产区和集中消费区之一[17]，然而，重庆冬、春两季雨水较多，夏秋两季高温高湿，加上辣椒连年种植，极易引起疫病的大面积发生，给辣椒稳定高产带来了巨大隐患[9]。因此，本研究以63份重庆加工型辣椒种质资源为主要材料，对已报道的12个辣椒抗疫病相关分子标记进行了筛选，以期为加工型辣椒疫病抗性资源鉴定和抗疫病品种选育提供参考。
1 材料和方法 1.1 试验材料65份辣椒(Capsicum annuum)种质材料由重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所保存，其中PI201234-1和Early Calwonder分别为疫病抗性和感病对照材料，其余63份种质材料为加工型辣椒，H201406-1、H201606-1、H201604-3、H201604-4、H201604-9-1、H201605-1-1、H201605-8-1、H201607-7和H201607-8等9份种质材料为利用花药培养技术创制的DH系, 另外54份材料为经多代提纯获得的高代自交系。
参照张世才等[18]的方法, 从重庆石柱、綦江等辣椒主产地患病辣椒植株上分离并保存。
1.2 病原菌接种及抗性鉴定挑选饱满一致的辣椒种子播于装有育苗基质的50孔穴盘中，穴盘下放一塑料托盘以便保湿。待幼苗长至5~6片真叶时，在距离辣椒幼苗根系约1 cm处基质中用手术刀切一条1 cm长的缝隙，取含1.0× 104 CFU/mL的辣椒疫霉菌(生理小种为race 3)混合孢子悬浮液3 mL注入缝隙中，接种期间适时浇水，保持土壤湿度接近饱和状态，室内温度28℃~30℃，光照12 h/d。10 d后参照NY/T2060.1-2011《辣椒抗疫病鉴定技术规程》调查疫病发病情况，对辣椒幼苗疫病进行分级评价。
1.3 疫病抗性分子标记筛选参照前人[19–25]报道的12个辣椒疫病抗性相关的分子标记设计引物(表 1)，其中RGA-STS1200[19]为STS标记(共显性)，WDY[20]和OpD04[22]为SCAR标记(显性), E73[23]为EST-SSR标记(共显性), GZH[21]为AFLP标记(显性)，其余7个标记为SSR标记(共显性)。以辣椒基因组DNA为模版，进行PCR扩增，PCR反应总体系为10 μL，包含5 μL 2× Es Taq Master-Mix (康为世纪)，0.5 μL DNA模版(100 ng/μL)，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L), ddH2O补足体积。PCR反应程序：94℃预变性5 min; 94℃变性30 s、55℃~62℃退火30 s、72℃延伸30 s~2 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，具体引物序列和PCR退火温度见表 1。扩增后的PCR产物利用3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
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表 1 分子标记的引物信息 Table 1 Primer information of molecular marker |
室内接种疫霉病菌后进行发病情况调查。结果表明，65份材料中鉴定出高抗材料8份，包含DH系材料5份和高代自交系3份，其中2份DH系材料(H201604-4和H201607-7)未发现任何植株感病; 抗病材料9份；中抗材料33份和感病材料15份(表 2)。对照材料PI201234被鉴定为抗性，而Early Car- wondery在所有材料中对疫病菌表现最敏感, 说明接种鉴定准确率较高。
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表 2 疫病抗性鉴定情况 Table 2 Identification of Phytophthora blight resistance |
12对引物扩增结果表明(图 1)，ZL6203、ZL6726和E73引物在65份材料中能扩增出差异条带, OpD04、GZH引物的扩增结果不稳定，其余7对引物在65份材料中都能扩增出目标条带，但无差异条带。
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图 1 ZL6203、ZL6726和E73的扩增结果。M: Marker; 1~27: 27份辣椒。 Fig. 1 Amplification results of ZL6203, ZL6726 and E73 primers. M: Marker; 1-27: 27 pepper varieties. |
结合疫病抗性鉴定情况，对ZL6726、ZL6203和E73标记的筛选效率进行评价。结果表明，不同标记在不同抗性等级区段的筛选效率不同，ZL6203对高抗材料的筛选效率最高，达87.50%，对抗性材料的筛选效率为77.78%，对中抗材料的筛选效率为63.64%, 对感病材料的筛选效率只有33.33%; ZL6726对抗性材料的筛选效率可达100.00%，对感病材料的筛选效率也较高，达66.67%，但对高抗材料的筛选效率只有12.50%；E73筛选抗性材料的效率达到77.78%，筛选高抗材料的效率达62.50%。因此, ZL6203适于筛选高抗、抗性和中抗材料, E73适于筛选抗性和高抗材料，ZL6726适于抗性和感病材料的筛选。
2.4 分子标记在育种中的初步应用以抗疫病材料PI201234为母本，分别以感病材料1031-1-1和1019-1-1为父本，配制杂交组合，获得杂交后代。根据亲本分子标记扩增特点，分别利用筛选出的2对引物(ZL6726和E73)对F2代群体进行检测，结果表明，2对引物均扩增出了特异条带, 能够清晰地分辨出F2群体的分离情况(图 2, 3)。
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表 3 分子标记的筛选效率 Table 3 Screening efficiency of molecular markers |
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图 2 ZL6726对PI201234-1×1031-1-1 F2代的PCR扩增图谱。M: Marker; 1: PI201234-1; 2: 1031-1-1; 3~30: 28个F2代单株。 Fig. 2 PCR amplification profiles of F2 offspring of PI201234-1×1031-1-1 by ZL6726. M: Marker; 1: PI201234-1; 2: 1031-1-1; 3-30: 28 F2 plants. |
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图 3 E73对PI201234-1×1019-1-1 F2代的PCR扩增图谱。M: Marker; 1: PI201234-1; 2: 1031-1-1; 3~30: 28个F2代单株。 Fig. 3 PCR amplification profiles of F2 offspring of PI201234-1×1019-1-1 by E73. M: Marker; 1: PI201234-1; 2: 1019-1-1; 3-30: 28 F2 plants. |
前人已开展了一些利用分子标记鉴定辣椒抗疫病材料的研究，郭爽等[26]利用WDY和OpD04分子标记对35份辣椒高代自交系进行了抗疫病评价, 其中26份材料的分子标记鉴定结果与田间疫病调查结果一致；马寿宾等[27]利用WDY、OpD04、E73和E318等4个分子标记对1份野生辣椒和3份甜椒材料进行了抗疫病鉴定，结果只有OpD04的稳定性和重复性较高；张爱民等[28]用18个抗疫病相关的分子标记对1份高抗和2份高感辣椒材料及其杂交F2代的抗性筛选适用性进行了研究，结果只有GZH标记适于高抗材料和1份高感材料的抗病性鉴定。这些说明辣椒抗疫病分子标记的群体特异性，为分子标记辅助辣椒抗疫病育种提供了重要参考。本研究选取前人开发的12个辣椒抗疫病相关分子标记对63份重庆加工型辣椒种质资源的抗疫病进行评价，结果表明，ZL6203、ZL6726和E73等3个标记能够用于加工型辣椒抗疫病鉴定。同时，本研究还进一步统计了这3个标记对不同抗性材料的筛选效率，即进一步对抗疫病分子标记的筛选范围进行了细化，能够为辣椒抗疫病相关分子标记的选用提供更多参考。
辣椒对疫病的抗性表现十分复杂，存在垂直抗性和水平抗性，或者两种抗性共存，其抗病性遗传方式也呈多样化，表现为单基因遗传、寡基因遗传和多基因遗传。目前还未见报道对疫病免疫的辣椒品种，但越来越多的抗性资源被发掘[29]，代表性抗疫病材料主要有PI201234、CM334和Perennial等，PI201234的抗性由1个显性主效基因控制[25, 30], CM334的抗性至少由2个非连锁的隐性基因控制[31], 而Perennial的抗性为多基因遗传[32]。本研究筛选出的2个分子标记(ZL6203和ZL6726)是从PI201234中开发出来的[25]，E73则是从高抗疫病的甜椒材料N1345中开发出来的，N1345对疫病的抗性由2对加性-显性-上位性主基因控制[23]。这说明重庆加工型辣椒抗疫病遗传特性与这2类材料相似性较高, 主要由单个或2个主效基因控制，其遗传背景相对简单，理论上有利于抗病新品种的培育。另外, 本研究筛选出的8份高抗材料中有5份为DH系材料，说明花药培养技术能够快速稳定疫病抗性基因。利用花药培养技术结合分子标记辅助筛选是目前创制辣椒抗疫病材料的最有效途径之一[13], 随着越来越多的辣椒抗疫病分子标记的开发和应用，辣椒抗疫病育种将会变得越来越精准高效。
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