目前，药用石斛属(Dendrobium)植物有40多种, 其中铁皮石斛(D. officinale)是栽培面积最大的种类, 其干燥茎是珍贵的药材，素有“药中黄金”之称^[1]。铁皮石斛含有多糖、芪类、联苄类、生物碱等化学成分, 多糖具有调节免疫力和调节肝细胞活性的药理作用, 生物碱具有抗氧化、抗癌和神经保护的药理作用，其他化合物具有抗氧化、抗癌和提高免疫力的药理作用^[2-3]。铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热、明目强身等功效^[1]，其提取物具有抑制肝癌细胞增殖、生津改善干燥症、促进头发生长等多种药用价值^[4-6]。

印度梨形孢(Piriformospora indica)是一种根部内生真菌，可定殖多个厚垣孢子于多种植物的根系中，促进植物的生长和发育，增强植物对胁迫的抵抗力，提高作物产量。其可缩短水稻(Oryza sztiva)、玉米(Zea mays)、烟草(Nicotiana tabacum)等种子的萌发时间，同时明显提高种子的萌发率和生长速率^[7]，对甘蔗(Saccharum officinarum)、辣椒(Capsicum annuum)、甘蓝(Brassica oleracea)、向日葵(Helianthus annuus)、番茄(Lycopersicon esculentum)、吊兰(Chlorophytum comosum)等有明显促进生长的作用^[8-9]，也能促进纹瓣兰(Cymbidium aloifolium)的生长和增加假马齿苋(Bacopa monniera)的生物量^[10-11]。印度梨形孢能促进兰科幼苗的生长^[12]，但尚未有提高兰科种子萌发率的报道。鉴于印度梨形孢对植物种子萌发和幼苗生长发育的作用，我们推测印度梨形孢可能对铁皮石斛种子萌发和原球茎生长产生积极影响，以期后续能推进印度梨形孢生物菌肥的研发，提高铁皮石斛的品质和产量。

铁皮石斛(Dendrobium officinale)种子和原球茎由江苏同人生物科技有限公司牟永花女士惠赠，为来自浙江省雁荡山地方种选育的‘同人1号’品种; 印度梨形孢(Piriformospora indica)菌种由德国耶拿大学Ralf Oelmüller教授和台湾大学叶开温教授惠赠，本实验室保存，在PDA培养基上活化待用。

培养基  铁皮石斛种子萌发培养基为MS+ 10 g/L香蕉粉+8 g/L琼脂；原球茎生长培养基为1/2MS+100 g/L马铃薯+8 g/L琼脂，pH均调至5.8。

种子萌发试验  将无菌的铁皮石斛种子放置到MS液体培养基(无糖)中，充分摇匀，制作成种子悬浮液，浸泡30 min，吸取1 000 μL均匀播种于铺有无菌滤纸的萌发培养基上。用接种器取边缘活力强的印度梨形孢菌丝体，在培养基中间添加3 mm带有印度梨形孢的琼脂块，对照为同样大小的不含印度梨形孢的PDA琼脂块。每处理20个培养皿, 3次重复。铁皮石斛种子萌发阶段划分参照吴慧凤等^[13]的方法。

种子萌发阶段划分  铁皮石斛种子在萌发培养基上吸水膨胀，种皮透明，完整，为阶段0; 30 d左右进入阶段1，种胚膨大，转绿；60 d左右进入阶段2，种子突破种皮，种子开始萌发；出现原生组织为阶段3；长出第1片叶为阶段4；长出第2片叶为阶段5 (图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 铁皮石斛种子萌发过程。A:阶段0; B:阶段1; C:阶段2; D:阶段3; E:阶段4; F:阶段5。 Fig. 1 Seed germination process of Dendrobium officinale. A: Stage 0; B: Stage 1; C: Stage 2; D: Stage 3; E: Stage 4; F: Stage 5.

原球茎生长  每个培养瓶里放置6个原球茎, 呈圆形排列。在培养基中间添加3 mm带有印度梨形孢的琼脂块，对照为同样大小的不含印度梨形孢的PDA琼脂块。每处理60个培养瓶，3次重复。

随机选取处于第2阶段铁皮石斛种子，先用无菌水冲洗3次，用10% KOH浸泡16 h，再用无菌水冲洗3次，再用1% HCl浸泡30 min，然后用0.05%台盼蓝染色7~10 min后用无菌水冲洗3次。在显微镜下观察印度梨形孢是否定殖，使用正置显微镜拍照。

印度梨形孢与铁皮石斛原球茎共培养7、10、15 d时随机选取原球茎，用无菌水冲洗3次，徒手纵切成厚度为0.05~0.1 cm的小片。取生长40 d的原球茎的根，用无菌水洗涤3次，徒手纵切根系成长1 cm，厚度0.05~0.1 cm的小段，用上述方法处理后观察印度梨形孢在原球茎阶段的定殖情况。

取铁皮石斛与印度梨形孢共生的种子在体式显微镜下统计萌发率。最早萌发时间参照Stewart等的方法^[14]，参照周雨等的方法^[15]，以阶段3为萌发标准，随机取3个视野统计萌发率。原球茎接种印度梨形孢80 d时，分别测定株高、鲜质量、干质量、叶片数、叶长、叶宽、根数和根长，取9个原球茎统计生物量，重复3次。

原球茎接种印度梨形孢80 d时，选择从下往上第2、3叶片测定叶绿素含量，用紫外可见分光光度计在663和645 nm波长下测定吸光度，参照Arnon的公式计算^[16]。接种印度梨形孢80 d的早上9:00- 11:00，使用Li-6400便捷式光合测定仪，选择从下往上第3片叶测定净光合速率、气孔导度、蒸腾速率，PFD设定为1 000 μmol/(m²·s)，温度(25±1)℃，CO₂浓度(390±10) μL/L，每组测定3株，3次重复。接种印度梨形孢80 d时取原球茎的茎，采用超声提取水溶性多糖，用苯酚-硫酸方法测定多糖含量^[17]。

从图 2可见，印度梨形孢处理的铁皮石斛种子起始萌发时间约22 d，对照约60 d。接种印度梨形孢的种子发育形成的原球茎更绿、更大，生长速度较快；对照种子发育形成的原球茎偏小, 颜色偏黄，生长速度较慢。接种印度梨形孢22 d的铁皮石斛种子萌发率约为31.8%，接种60 d的萌发率约为68.8%，而对照仅为28.6%。这表明印度梨形孢处理的种子萌发提前了约38 d，萌发率提高了40.2%。

图 2(Fig. 2)

图 2 印度梨形孢对铁皮石斛种子萌发的影响 Fig. 2 Effect of Piriformospora indica on seed germination of Dendrobium officinale

与对照相比，接种印度梨形孢的铁皮石斛原球茎的株高、鲜质量、干质量、叶片数、叶长、叶宽、根数和根长均有提高(表 1)，且随接种时间延长持续促进原球茎生长(图 3)。接种80 d的原球茎叶绿素含量比对照高(表 2)，叶绿素a/b则小于对照, 这表明叶片中的叶绿素a、叶绿素b含量比对照的更稳定。

表 1(Table 1)

表 1 接种印度梨形孢80 d的铁皮石斛原球茎的生长特性 Table 1 Growth characters of protocorm of Dendrobium officinale cultured with Piriformospora indica for 80 d 对照Control 处理Treatment 株高Height (cm) 1.667±0.321 2.400±0.173* 鲜质量Fresh weight (g) 0.041±0.004 0.145±0.017** 干质量Dry weight (g) 0.012±0.003 0.034±0.010* 叶片数Number of leaf 4.557±0.510 7.000±1.528* 叶长Leaf length (cm) 0.800±0.058 1.278±0.019** 叶宽Leaf width (cm) 0.306±0.004 0.511±0.019** 根数Number of root 2.778±0.192 4.553±0.387** 根长Root length (cm) 0.745±0.107 1.256±0.154** *: P < 0.05; **: P < 0.01。下表同。 *: P < 0.05; **: P < 0.01. The same is following Tables.

表 1 接种印度梨形孢80 d的铁皮石斛原球茎的生长特性 Table 1 Growth characters of protocorm of Dendrobium officinale cultured with Piriformospora indica for 80 d

图 3(Fig. 3)

图 3 印度梨形孢接种对铁皮石斛原球茎生长的影响。A: 20 d; B: 40 d; C: 60 d; D: 80 d。 Fig. 3 Effect of Piriformospora indica on growth of protocorm of Dendrobium officinale. A: 20 d; B: 40 d; C: 60 d; D: 80 d.

表 2(Table 2)

表 2 接种印度梨形孢80 d的铁皮石斛原球茎叶绿素含量 Table 2 Chlorophyll (Chl) contents of protocorm of Dendrobium officinale cultured with Piriformospora indica for 80 d 对照Control 处理Treatment Chl a (mg/g) 0.225±0.030 0.303±0.016* Chl b (mg/g) 0.115±0.012 0.214±0.029* Chl a/b 1.953±0.743 1.423±0.115* Chl a+b (mg/g) 0.340±0.424 0.517±0.046*

表 2 接种印度梨形孢80 d的铁皮石斛原球茎叶绿素含量 Table 2 Chlorophyll (Chl) contents of protocorm of Dendrobium officinale cultured with Piriformospora indica for 80 d

接种印度梨形孢80 d的铁皮石斛原球茎叶片的光合性能和多糖含量均有提高(表 3)，接种印度梨形孢的原球茎叶片净光合速率比对照显著提高了59.47%，其多糖含量是对照的1.29倍。

表 3(Table 3)

表 3 共培养80 d时印度梨形孢对铁皮石斛原球茎光合参数和多糖的影响 Table 3 Effect of Piriformospora indica on photosynthetic parameters and polysaccharides of protocorm of Dendrobium officinale cultured for 80 d 对照Control 处理Treatment 净光合速率Net photosynthesis rate [μmol/(m2·s)] 0.802 46±0.125 06 1.979 90±0.686 01* 气孔导度Stomatal conductance [mol/(m2·s)] 0.021 12±0.015 14 0.033 06±0.015 79 蒸腾速率Transpiration rate [mmol/(m2·s)] 0.210 55±0.151 17 0.341 78±0.168 82 多糖Polysaccharide (mg/g) 31.119 36±0.412 19 40.195 80±0.861 24**

表 3 共培养80 d时印度梨形孢对铁皮石斛原球茎光合参数和多糖的影响 Table 3 Effect of Piriformospora indica on photosynthetic parameters and polysaccharides of protocorm of Dendrobium officinale cultured for 80 d

取处于萌发第2~3阶段的种子用台盼蓝染色检测，在显微镜下可观察到印度梨形孢孢子贴着铁皮石斛的种皮，并通过表皮毛进入种子(图 4: E)。

图 4(Fig. 4)

图 4 印度梨形孢在铁皮石斛种子和原球茎中的定殖。A:孢子与原球茎表皮毛接触; B:孢子开始进入原球茎表皮毛中; C:孢子大量进入原球茎表皮毛中; D:孢子定殖到原球茎根中; E:孢子在种子表皮毛中定殖。 Fig. 4 Colonization of Piriformospora indica in seed and protocorm of Dendrobium officinale. A: Spores of P. indica contact with epidermis hairs of protocorm; B: Spores of P. indica begin to enter epidermis hairs of protocorm; C: P. indica spores enter epidermis hairs of protocorm in large numbers; D: P. indica colonized into the root; E: P. indica spores colonize in epidermis hairs of seed.

印度梨形孢与原球茎共生7、10和15 d时，随机选取10个原球茎用台盼蓝染色检测，在显微镜下可见印度梨形孢孢子通过表皮毛进入原球茎组织中(图 4: A~C)。共培养7 d时印度梨形孢孢子接触到处于种子萌发第3阶段的原球茎表皮毛(图 4: A)；共培养10 d时孢子开始进入处于种子萌发第4阶段的原球茎表皮毛中(图 4: B)；到共培养15 d时原球茎处于种子萌发的第4阶段，孢子大量进入原球茎表皮毛中(图 4: C)；共生40 d时原球茎处于种子萌发的第5阶段，可见孢子定殖到原球茎根部细胞内或细胞间(图 4: D)。

姜鹏等提出兰科植物种子萌发阶段和成年兰花阶段有较多的真菌种类与其共生，幼苗阶段的共生真菌种类较少^[18]，真菌可能同时出现在多个时期，也可能只出现在其中的一个时期。本试验证实在铁皮石斛种子和原球茎发育阶段分别接种印度梨形孢，可以达到共生的目的。不同兰科植物对共生萌发真菌的专一性不同，有些植物对特定真菌具有偏好性，有些植物呈现泛化的特征，如火烧兰属植物(Epipactis atrorubens)可与多种真菌共生^[19]。有研究表明，瘤菌根菌属、丝核菌属、角菌根菌属、小菇属真菌可侵染铁皮石斛幼苗，枝孢霉菌、胶膜菌属等真菌可侵染铁皮石斛种子^[20-24]。因此，我们推测促进铁皮石斛种子萌发的真菌可能具有一定的泛化特征，但这仍需更多的试验来验证。

兰科植物种子细小且无胚乳，共生微生物可以促进种子发芽，而且可以使成年植物更好地适应环境压力，通常情况下兰科种子与适宜的内生真菌共生后能够较好萌发^[25]。王亚妮等报道菌根真菌与兰科植物共生时能主动分泌赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸等多种植物激素和生长调节类物质，从而打破细胞休眠，刺激细胞分裂分化，促进兰科植物种子萌发和植株生长^[26]。据报道印度梨形孢侵染大麦(Hordeum vulgare)后，其植物生长素、赤霉素、脱落酸生长激素代谢基因上调表达^[27]。通过镜检，推断印度梨形孢孢子可能是在种子萌发的第0和1阶段粘附种皮，提高铁皮石斛种子的抗逆能力，在第2和3阶段通过表皮毛作用于种子，刺激种子分泌相关生长素，加快种子生长发育。

印度梨形孢可以与被子植物、裸子植物、苔藓植物和蕨类植物共生，提高植物的生物量^[28-33]。据报道印度梨形孢可以促进兰科植物的生长^[34-35]。本研究表明，印度梨形孢在根没有长出时通过表皮毛作用于原球茎，这和种子的侵入方式相同，在根长出后，再次侵入到已经生长为幼苗的原球茎。与对照相比，接种印度梨形孢80 d的原球茎的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、多糖含量和净光合速率均提高，推断印度梨形孢可能是通过增强铁皮石斛叶片的光合性能，从而促进原球茎的生长，提高多糖含量。印度梨形孢对铁皮石斛原球茎具有显著促进生长的作用，而印度梨形孢促进铁皮石斛种子萌发、原球茎生长的作用机制还有待深入研究。