2025, Vol. 33
表1(Table 1)
茶鲜叶中，水分约占75%，干物质约为25%。茶叶的化学成分中无机物占3.5%~7.0%，有机物占93.0%~96.5%[1]。茶叶的化学组成与品质(香气、滋味)、生长发育、新陈代谢等密切相关，其直接或间接来自鲜叶中积累的代谢物有芳香类、多酚类、色素、茶氨酸、皂苷、生物碱等。研究表明，茶鲜叶的化学组成受品种、季节、栽培条件等调控，目前经分离鉴定的已知化合物有700多种[2]。利用代谢组学手段，可分析不同茶树品种代谢产物的组成, 揭示该品种品质形成的代谢基础，为茶树遗传改良提供新思路奠定基础。
代谢组学是继转录组、基因组学、蛋白组学之后又一门新兴的学科[3]，是系统生物学的重要组成部分，主要是将某种生物(细胞或组织)内所有小分子代谢物(包括黄酮、糖醇类化合物、有机酸、氨基酸、脂类等)变化作为研究对象，并对其进行定性、定量的多种统计分析。目前植物代谢组学主要采用MS和NMR两大分析平台，检测方法从最初的靶向代谢组分析与非靶向代谢组分析扩展为广泛靶向的代谢组分析，分析技术主要有高效液相色谱质谱联用、气相色谱质谱联用、核磁共振、毛细血管电泳技术等，适合高通量、广覆盖地分析大量样本，能准确、全面、有效地比较样本间的代谢物质差异，综合解析差异代谢物的代谢途径[4]。气相色谱/质谱联用(GC-MS)非靶向代谢组技术是最为成熟的色谱-质谱联用技术之一，由于其灵敏度高、重现性好, 具有大量标准代谢物谱图库，且成本相对低廉等特点，适合分析相对分子量小(1000 Da以内)、热稳定性好、沸点低的代谢物；液相色谱质谱联用(LC-MS)非靶向代谢组技术，适合分析挥发性差、热稳定性差、弱极性或中等极性的代谢物。在茶产业的种植、加工、饮用等多个环节中，利用代谢组学全面了解内含物质的变化规律，揭示形成原理。通过分析大样本量的多组分，从色谱数据的对齐到鉴定出具有明显差异的代谢物，处理速度快[5]。
茶叶品质的形成与茶树品种密切相关，杂交育种仍是茶树品种选育和创制育种新材料的主要途径，然而茶树因异花授粉、高度杂合、结实率低且世代周期长等特点，导致遗传学的研究非常滞后, 相关遗传理论研究进展缓慢。研究不同遗传背景下茶树母本与子代主要品质性状的遗传与变异，并进行杂种优势分析，可为新品种的选育奠定基础。茶树新品系‘春绿’为福建省农业科学院茶叶研究所用杂交育种法得到的[以‘福云6号’(Camellia sinensis ‘Fuyun 6’)为母本，‘早春毫’(C. sinensis ‘Zaochunhao’)为父本]，小乔木，中叶类，特早生，具有产量高、抗逆性强、适应性广，制绿茶花香显，滋味醇爽的特点。前期通过田间性状调查，发现新品系‘春绿’与母本‘福云6号’有许多农艺性状相似，如树形均是小乔木，生长势均强，均为早芽品种，叶片形态均表现叶身内折且叶缘无或极弱、新梢芽绒毛有且均较密，一芽三叶长、宽均中等且接近等。与父本‘早春毫’相比新梢萌发期晚3~5 d，白毫显现程度及芽头肥壮程度、叶齿锐度均不如父本。经前期观察，‘春绿’各表观性状大部分均偏向母本，仅有如叶齿、叶长、花冠等性状与父本相似。基于此，为了探明母本与子代主要品质性状的遗传和变异，本研究利用LC-MS和GC-MS非靶标代谢组学联合分析新品系‘春绿’与母本‘福云6号’品种间的差异性代谢物，筛选出品种对应的代谢标志物，为新品种的选育提供参考依据。
1 材料和方法 1.1 材料试验于2020—2021年在福建省福安市社口镇茶叶研究所基地完成。以‘春绿’和对照种母本‘福云6号’的10月龄扦插苗为材料，采用盆栽沙培，每盆栽2株，栽种20盆，于自然温、光条件下培养(保证栽培条件完全相同)。沙子用干净的河沙，盆用陶土花盆(高20 cm，底部直径20 cm，顶部直径30 cm), 每盆装入6 kg的沙子，沙子使用前用去离子水洗净、晾干备用。营养液参照林郑和等[6]配制，完全营养液包含3 mmol/L NH4NO3、0.5 mmol/L Ca(H2PO4)2、1.0 mmol/L K2SO4、0.5 mmol/L CaCl2、0.6 mmol/L MgSO4、46 μmol/L H3BO3、9 μmol/L MnSO4、9 μmol/L ZnSO4、2 μmol/L CuSO4、2.6 μmol/L Na2MoO4和30 μmol/L Fe-EDTA。移栽后1周内浇水，之后依次施用1/4营养液2周，施用1/2营养液2周，施用全营养液。营养液每次施用约500 mL，每周3次，2021年春季(3月20日)进行取样、检测。叶片统一采集嫩稍(一芽二叶)，迅速放入液氮中，用于GC-MS和LC-MS测定。
1.2 试剂标样儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸、茶氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸、缬氨酸、谷氨酸、色氨酸、苏氨酸、牡荆素、异牡荆素、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-芸香苷、山柰酚-3-芸香苷、山柰酚-3-半乳糖苷、山柰酚-3-葡萄糖苷等标准品美国Sigma公司；茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯、茶黄素-3, 3′-没食子酸酯等标准品购于武汉ChemFaces公司。
1.3 气相色谱-质谱分析准确称取60 mg样品，放入1.5 mL的离心管中，依次加入2颗小钢珠，360 μL的预冷甲醇和40 μL的内标(l-2-氯-苯丙氨酸0.3 mg/mL，甲醇配置)，在–80 ℃冰箱中放置2 min，放入研磨机中研磨(60 Hz，2 min)，从研磨机中取出，超声提取30 min。加入200 μL的氯仿，混匀，加入400 μL的水，混匀, 超声提取30 min。4 ℃，10 000×g，离心10 min，取200 μL的上清液装入玻璃衍生瓶中。质控样本(quality control, QC)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC的体积与样本相同，用冷冻浓缩离心干燥器挥干样品，向玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液(15 mg/mL)，涡旋震荡2 min后，于震荡培养箱中37 ℃ 90 min进行肟化反应。将样品取出后再加入80 μL的含1%三甲基氯硅烷的三氟乙酰胺衍生试剂和20 μL的正己烷，涡旋震荡2 min后，于70 ℃反应60 min。取出样本后，在室温放置30 min，进行GC-MS代谢组学分析。
色谱条件：DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm× 0.25 μm, Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, USA)，载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)，流速1.0 mL/min, 进样口的温度为260 ℃。进样量1 μL，不分流进样，溶剂延迟5 min。程序升温：柱温箱的初始温度为60 ℃，保持0.5 min；以8 ℃/min升温至125 ℃；4 ℃/min升温至210 ℃；5 ℃/min升温至270 ℃；10 ℃/min升温至305 ℃，保持3 min。
质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围：m/z 50~500。
1.4 液相色谱-质谱分析称取60 mg样本，加入内标(l-2-氯苯丙氨酸, 0.3 mg/mL；甲醇配置) 20 μL，800 μL的甲醇-水(7:3, V: V)；加入2个小钢珠，在-20 ℃放置2 min预冷，加入研磨机(60 Hz，2 min)；冰水浴超声提取30 min，–20 ℃过夜静置；在4 ℃ 11 000×g离心10 min, 用注射器吸取150 μL的上清液，使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，–80 ℃下保存，直到进行LC-MS分析。
分析仪器为Nexera UPLC超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 µm)；柱温：45 ℃；流动相：A-水(含0.1%甲酸)，B-乙腈(含0.1%甲酸)；流速：0.35 mL/min；进样体积：2 μL。
1.5 茶叶感官审评方法依据国标《茶叶感官审评方法》(GB/T 23776—2018)，由5名熟练评茶人员进行密码审评。对外形、汤色、香气、滋味和叶底5项因子分别进行审评术语描述及评分。
1.6 数据处理及分析利用软件SIMCA-P 11.5进行数据分析。对所测定的数据按VIP (variable importance the projection) > 1.0初步筛选含量差异代谢物，再采用DPS软件进行方差分析，确定差异代谢物含量变化的幅度。
2 结果和分析 2.1 感官品质通过2021—2023年连续3年制茶品质得分，表明‘春绿’制绿茶综合得分(3年平均)比母本‘福云6号’高1.36分，‘春绿’制茶品质明显超过母本‘福云6号’。
2.2 主成分分析从图 1可见，该组原始试验数据(GC-MS和LC-MS)所得在2个主成分PC1、PC2中呈现良好，GC-MS的第一主成分的贡献率为60.4%，第二主成分的贡献率为14.8%，2种贡献率和为75.2%。从样品分布散点图可见，2个品种的大多数信息都可以得到很好的区分，并且R2X=0.818 > 0.5，说明拟合性好，能够直观地反映样本间的相似或差异性。LC-MS的第一主成分的贡献率为45.7%，第二主成分的贡献率为11.7%，2种主成分的贡献率和为57.4%, R2X= 0.648 > 0.5，这2个品种完全分离。
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图 1 ‘春绿’新品系代谢物主成分分析(PCA)散点图。A: GC/MS检测; B: LC/MS检测。FY6H: ‘福云6号’; CL: ‘春绿’。下同 Fig. 1 Principal component analysis (PCA) scatter plot of new strain 'Chunlv'. A: Detected by GC/MS; B: Detected by LC/MS; FY6H: 'Fuyun 6'; CL: 'Chunlv'. The same below |
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表 1 感官品质审评表(2021—2023年) Table 1 Sensory quality evaluation from 2021—2023 |
利用GC-MS检测‘春绿’，经峰面积校准后共得到89种化合物离子，最终鉴定出50种差异显著化合物，仅9个上调，41个下调，其中绿原酸含量差异最大，比‘福云6号’显著下调。利用LC-MS检测，经峰面积校准后共得到1 741种化合物离子，最终鉴定出297种差异显著代谢物，其中176个上调, 121个下调，其中咖啡碱差异最大，显著上调。
2.4 显著差异代谢物的KEGG通路富集分析通过KEGG通路分析对‘春绿’和‘福云6号’进行差异代谢物通路富集，以Q-value≤0.05进行差异代谢物的筛选。通路富集分析表明GC-MS共检测出50个显著差异代谢产物，分布在57条代谢途径中(图 2)。其中差异代谢物富集前5条通路分别为黄酮和黄酮醇生物合成、类黄酮生物合成、精氨酸生物合成、ABC转运体、淀粉和蔗糖代谢等。LC-MS共检测出297个显著差异代谢产物，分布在36个代谢途径中，其中富集前5条通路依次为类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、ABC转运蛋白。另外咖啡因代谢、玉米素生物合成等也有大量的差异物参与。
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图 2 差异代谢物的通路富集图。A: GC-MS; B: LC-MS。 Fig. 2 Pathway enrichment map of differential metabolites. A: GC-MS; B: LC-MS. |
结合多元统计分析OPLS-DA的VIP值和单变量统计分析t检验P值来筛选‘春绿’和‘福云6号’的显著差异代谢物，筛选标准为VIP≥1且T-test P < 0.05。根据筛选标准，利用GC-MS和LC-MS共鉴定出有显著差异的代谢物347种，分为生物碱类、儿茶素类、氨基酸、黄酮醇糖苷类、香气糖苷、二聚儿茶素类、酚酸类、有机酸类、酯类、糖类和其他等11类。
对比分析表明(图 3)，‘春绿’中大部分的生物碱类物质都显著增加，如咖啡碱、茶碱含量在‘春绿’新品系中与‘福云6号’相比分别增加了2.2和2.5倍。5′-脱氧腺苷显著增加，其含量为‘福云6号’的490倍之多，仅5-甲硫腺苷减少(为‘福云6号’的40%)，腺苷显著下降。儿茶素类代谢物中，‘春绿’鲜叶大部分的儿茶素单体都显著下降，其中包括表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、儿茶素等，均下降了1倍以上，仅阿夫儿茶素-3-3′-双没食子酸显著增加(约增加了35倍)。氨基酸类差异代谢物中，精氨酸增加了2.6倍、l-丙氨酸增加了1.2倍，l-谷氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸都显著增加，仅色氨酸、苏氨酸、甘氨酰酪氨酸下降。
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图 3 差异代谢物的热图分析。A: GC-MS; B: LC-MS; 1~6分别为6个重复，代谢物后的数字表示与对照的差异倍数，+: 增加，-: 减少。 Fig. 3 Heat map of differential metabolites. A: GC-MS; B: LC-MS; 1-6 represent 6 repetitions, respectively; Data followed metabolite are the multiple of increase (+) or decrease (-). |
56个黄酮糖苷或黄酮醇糖苷类差异较大，其中24个代谢物显著上调，32个代谢物显著下调(图 4)。差异较大的有山柰酚-7-O-葡萄糖苷、根皮苷、芒柄花素-7-葡萄糖甙、木麻黄-6-O-A-d-葡糖苷、异红镰霉素龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-鼠李糖苷、薄荷异黄酮甙、槲皮素-3, 7-鼠李糖苷、山柰酚-3, 6葡萄糖-1-2鼠李糖苷、芦荟大黄素-8-葡萄糖苷、堪非醇3-新橙皮糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、吡喃葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木麻黄-6-O-A-d-葡糖苷。没食子酰葡萄糖、芸香苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、2, 6-二没食子酸葡萄糖、金缕梅单宁、没食子酸-3-O-葡萄糖苷、异野樱黄苷、异落叶松脂素-9′-O-beta-d-吡喃葡萄糖苷、氰甙、水杨酸-β-葡萄糖苷、杨梅素-7-6-没食子酰葡萄糖等显著下调。
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图 4 潜在生物标志物的OPLS-DA散点分析(PC1 > 0.1或PC1 < -0.1)。A: GC-MS；B: LC-MS。 Fig. 4 Scatter analysis of potential biomarkers OPLS-DA when PC1 > 0.1or PC1 < -0.1. A: GC-MS; B: LC-MS. |
香气糖苷类代谢物中，芳樟醇3, 6-樱草糖苷、葡萄糖香草醛苷、八角茴香、苯甲醇樱草糖苷、香草酸4-O-β-d-葡萄糖苷在‘春绿’新品系叶片中都显著增加。这些糖苷类是醇系香气物质的重要前体, 在各自糖苷酶作用下，水解出芳樟醇、苯甲醇等令人愉悦的具有花果香、甜花香香型特征的重要香气物质，对茶叶香气品质起着重要的作用。
二聚儿茶素类中，‘春绿’鲜叶中，原花青素B2、表儿茶素-4α-8-表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素-4β-8-表没食子儿茶素没食子酸酯显著下降，而表阿夫儿茶素-3, 3′-双没食子酸(是‘福云6号’的36.3倍)、原花青素B1、原花青素B5显著增加。酚酸类物质中，绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸等均显著下调，其含量差异分别达490、24.2、4.75倍。其余苯甲酸、吲哚丙烯酸、哌啶酸等25个酚酸类代谢物质都显著下降，仅有苯丙酮酸、4-羟基肉桂酸、八-羟基辛酸、油酸等11个代谢物显著增加。有机酸中除柠檬酸(增加了1.7倍)、2-羟基柠檬酸(增加了1.76倍)显著上调外，其余均显著下调。
2.6 潜在的生物标志物分析潜在的生物标志物分析见图 4。当OPLS-DA的可变贡献(PC1) > 0.2或者PC1 < -0.2时，仅绿原酸和咖啡因为潜在生物标志物。而当PC1 > 0.1或者PC1 < -0.1时，亚麻油酸、油酸、叶绿醇、羟基哌扣立酸、核糖醇、木糖、色氨酸、茶碱、α-氢化胡桃醌、芒柄花黄素7-O-葡糖苷酸、甲基没食子酸、杨梅素-3, 3′-半乳糖苷、儿茶素-3-O-没食子酸酯等为潜在生物标志物。
3 讨论和结论代谢物是植物细胞生化反应的终端最终产物, 能够反映已发生的生化反应，代谢组学基于对代谢物进行定性和定量检测和分析，同时对代谢物的代谢途径及相关网络功能进行解析，相比转录组学、蛋白组学等，代谢组学反映出的变化更接近于生物体的表型[7]。近年来，代谢组学在茶树(Camellia sinensis)研究中的应用越来越受到关注，集中关注原料采摘部位[8–9]、发育阶段[10]、季节和环境因子[11]、产地[12]、加工[13]等因素对茶叶成分和品质的影响。而关于茶树新品系杂交后代与母本代谢组的比较分析较少。胡清财等[14]的研究表明，金观音与其父本铁观音的差异代谢物有499种，其中黄酮、酚酸、脂质是两者的最主要差异代谢物；Wang等[15]对2个茶树杂种(金观音、黄观音)与其亲本(黄旦、铁观音)的非挥发性代谢物差异分析表明，子代中肌苷、鸟苷、腺苷、咖啡因、琥珀酸、己二酸、木糖和没食子酸等含量高于母本或父本；本研究结果表明，‘春绿’与‘福云6号’茶鲜叶代谢差异标志物主要是绿原酸和咖啡碱。绿原酸是一种缩酚酸，是由咖啡酸和奎宁酸缩合而成的酯，属于酚类化合物。由于分子具有邻二酚羟基，因此具有极强的还原性而更易被自由基氧化，从而表现出很好的自由基清除作用和抗脂质过氧化作用。早期发现品质差的茶鲜叶品种中绿原酸含量偏高，而品质较好的茶鲜叶绿原酸含量都偏低，绿原酸含量高可能造成茶叶品质下降[16]。从茶叶审评结果看，‘春绿’制绿茶香气与滋味明显超过‘福云6号’，这也与之相对应。
本研究表明，新品系‘春绿’中大部分的生物碱类物质都显著增加，其中咖啡碱增加2.2倍、茶碱增加2.5倍；大部分的儿茶素单体都显著下降；l-谷氨酸、精氨酸、l-丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸都显著增加。‘春绿’品种中咖啡碱含量显著高于‘福云6号’，成为另1个标志物。咖啡碱是一种生物碱，主要呈现苦味。茶叶中咖啡碱含量一般在2%~4%，但随着茶树生长条件及品种来源的不同会有所不同[1]。咖啡碱是茶叶重要的滋味物质，其与茶黄素以氢键合成后形成的复合物具有鲜爽味[17], 有研究表明，它可同时与其他多种物质具有互作关系，包括与表没食子儿茶素没食子酸酯类混合呈现消隐作用，增强茶氨酸鲜味等[16]。因此咖啡碱含量也常常被看作影响茶叶品质的一个重要因素。‘福云6号’茶树品种加工绿茶滋味比较平淡，香气低，可能是因为本身的咖啡碱、多酚含量低的原因。
黄酮类物质作为茶树中一类重要的次生代谢物质，是低分子量的多酚化合物，由苯丙氨盐途径合成，广泛存在于植物体中，常见的有黄酮、黄酮醇、黄烷醇、异黄酮、黄烷酮和花青素等几大类, 具有多种功能，如在茶树生长发育过程中参与品质生化、防御机制、抗逆机制[18]；提高对茶树内部营养元素的利用率等[19]。本研究表明新品系‘春绿’与对照母本相比有56个黄酮糖苷或黄酮醇糖苷类差异代谢物，其中24个代谢物显著上调，32个显著下调，特别是根皮苷增加了112.6倍。根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，属于黄酮类中的二氢查尔酮类物质，是由根皮素和配糖体为葡糖苷结合成的苷，糖基水解形成葡萄糖，加之含量高，被许多学者认为是碳水化合物的一种贮藏形式。本研究表明，‘春绿’新品系鲜叶中山柰酚-7-O-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷显著增加。戴伟东等[20]研究认为适制绿茶和红茶的茶树品种茶叶中黄酮醇葡萄糖苷化水平较高，这与本研究结果相类似。黄酮类物质、酚酸含量的差异也被认为是铁观音形成滋味醇厚的重要因素[14]。
‘春绿’鲜叶中大部分的羧酸和衍生物如柠檬酸、哌可酸、2-羟基柠檬酸等显著上调，茶叶中的有机酸作为一种水溶性物质，是茶叶香气和滋味的主要成分之一，约占其干物质总量的3%却影响着茶树体内的物质形成与转化；脂肪类物质在体内的主要生理作用是储能和氧化供能作用[21]，本研究中春绿鲜叶中大部分脂肪酸类物质都显著增加，如羟基茉莉酸、亚麻油酸等，推测春绿茶树品种抗逆性更好。
杂种优势利用是作物杂交育种的有效手段之一，加强茶树目标性状的杂种优势及其形成机理研究对指导茶树育种非常重要。已有研究发现杂交种中普遍存在非加性积累，其中非加性积累较多核苷酸、生物碱、有机酸和单宁等有助于杂交种的正杂种优势。杂交后代(金观音、黄观音)的儿茶素和游离氨基酸含量与母本品种TGY (铁观音)相比具有负杂种优势[15]；罗莉等[22]报道以金萱(♀)和南昆山毛叶茶(♂)及其远缘杂交育成的66株F1代全同胞系茶树的表没食子酸、儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸、咖啡碱和可可碱总量、儿茶素总量、咖啡碱等7个生化指标表现为大于高亲值的正向超亲优势；雷雨等[23]以‘保靖黄金茶1号’为父本，分别以‘福鼎大白茶’、‘安徽1号’和‘碧香早’为母本, 构建3个杂交F1群体，3个组合的水浸出物和茶多酚表现正向中亲优势，咖啡碱表现为不同的正向和负向中亲优势，而氨基酸表现为负向中亲优势且存在偏母性遗传。本研究中咖啡碱表现为负向遗传优势，偏离母性；而氨基酸表现为正向中亲优势，偏母性遗传。这种差异可能是源于双亲间的异质性, 选择遗传差异大的亲本进行杂交才能产生较强的杂种优势。
本研究利用GC-MS鉴定出50种显著差异代谢物质(VIP > 1.0)，主要包含糖类、氨基酸类等，其中绿原酸含量差异最大；而LC-MS鉴定出297个显著差异代谢物质(VIP > 1.0)，主要集中在多酚类、醇酸类、糖类等，其中咖啡碱差异最大。通路富集分析表明，差异代谢物主要富集在黄酮和黄酮醇生物合成途径、精氨酸生物合成途径、不饱和脂肪酸生物合成途径、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化途径等。OPLS-DA的可变贡献分析表明，大多数潜在生物标志物与能量代谢和品质相关。本研究可为‘春绿’品质形成研究提供参考，为‘春绿’品种选育提供理论依据。
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