2025, Vol. 33
桂花(Osmanthus fragrans)是木犀科(Oleaceae)木犀属常绿植物，为中国传统的十大名花，历来深受文人雅士的喜爱。桂花资源丰富，利用价值高[1–3]。依据花期、花色和叶色可将桂花分为五大品种群, 即金桂品种群、银桂品种群、丹桂品种群、四季桂品种群和彩叶桂品种群[4–6]。长期以来，学者们对桂花开展了大量研究工作，在育种[7]、生理[8]、生化[9–10]等方面均取得了一定的进展。然而不同桂花品种存在花色、花香和叶色差异, 其形成原因尚不清楚，作用机制也未得到更深层次的探讨。
随着生物技术的快速发展，越来越多的观赏植物进入分子生物学的时代。分子生物学相关技术作为一种解决传统育种和栽培技术在花色、花香和抗逆性调控等方面的辅助工具，在提高植物育种效率和种质改良方面发挥着重要作用。桂花作为具有极高价值的观赏植物，其分子生物学方面的研究亦有许多报道但至今没有系统的总结。基于现已发表的文献，本文将从桂花全基因组、转录组、蛋白组以及功能基因研究等几个方面总结桂花分子生物学研究的重要进展，并探讨目前存在的问题和今后重点研究的方向，以期为后续桂花相关研究工作提供参考。
1 桂花全基因组研究 1.1 全基因组测序植物全基因组测序是指通过基因组学的方法揭示植物的遗传蓝图以及群体水平上的基因差异变化。2000年，在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)成为第1个公开全基因序列[11]之后，随着测序技术的快速发展和测序成本的降低，越来越多的植物全基因信息相继公开。2018年，南京林业大学率先对桂花品种‘日香桂’(‘Rixiang Gui’)进行了全基因组测序，共获得45 542个基因，其中95.68%的基因被功能注释[12]。这是桂花全基因组的首次报道，为科研人员从分子水平上理解桂花基因的结构、组成和功能提供了全新的视野。随后，另一桂花品种‘柳叶金桂’(‘Liuye Jingui’)的全基因组被报道[13]。这2个高质量桂花品种全基因组数据的公布将有利于其遗传改良和分子生物学问题的深入研究。
1.2 全基因组基因家族分析桂花全基因组的公布为其在分子水平上的研究奠定了基础和信息支撑。基于全基因组数据，研究人员对不同类型的基因家族进行了分析，主要涉及花香、花开放和非生物胁迫。
(1) 花香相关基因家族分析。桂花香气浓郁, 沁人心脾，其香气物质受到基因的调控。部分与花香相关的基因家族进行了研究，鉴定出WRKY基因家族的154个基因，并对8个OfWRKYs基因进行了不同组织表达量检测，其中OfWRKY139的表达模式与单帖类化合物相关，暗示其在调节桂花芳香族化合物合成中具有潜在的作用[14]。在对MYB基因家族分析的过程中共确定212个OfMYBs基因, 而在花器官中有表达的只有3个基因：OfMYB1R70、OfMYB1R114和OfMYB1R201[15]。对P450基因家族分析表明，共计鉴定出276个基因，其中OfCYP142与芳樟醇合成基因OfTPS2的相关性最高，瞬时表达和稳定转化的结果表明，OfCYP142可以增加桂花香气中重要挥发性有机化合物芳樟醇的含量[16]。
(2) 花开放相关基因家族的分析。开花是观赏植物生命周期中至关重要的发育阶段[17]。而生长素与植物生长发育的许多方面有关，尤其在花开放过程中起着关键作用[18–19]。生长素反应因子(ARFs)是生长素介导途径中的重要蛋白。Chen等[20]从桂花ARF基因家族中检测分析出50个基因，进一步比较了花朵开放不同阶段的表达谱以及ARFs与内源IAA水平的关系，推测OfARFs是通过生长素介导途径参与花开放的过程。在对XTH基因家族的分析中共鉴定出38个OfXTHs基因，其中OfXTH24/OfXTH27/OfXTH32/OfXTH35的表达显著增加，推测这些基因可能通过对环境温度变化的响应，参与细胞扩增或细胞壁弱化从而调控花开放[21]。有研究表明，植物花瓣衰老过程中乙烯含量会上升，在桂花ACO基因家族中共鉴定出122个基因，其中OfLYG006223、OfLYG007706、OfLYG007045和OfLYG035696等4个成员在开花后期上调表达，暗示这些基因参与调控桂花花瓣的衰老[22]。
(3) 非生物胁迫相关基因家族分析。桂花在生长发育过程中会遭受各种各样的非生物胁迫，如冷胁迫、干旱胁迫和盐胁迫[23–25]。在长期进化过程中，桂花形成了抵御非生物胁迫的能力。近年来，有关桂花非生物胁迫基因家族的分析也有报道，尤以抗寒方面居多。通过对桂花bHLH基因家族成员进行分析, 鉴定出206个基因，其中，OfbHLH120/OfbHLH128/OfbHLH163的表达水平在低温处理下有明显的上调或下调, 表明这些基因可能直接参与调控桂花响应低温反应[26]。另一项研究表明，在桂花NAC基因家族成员中共鉴定出119个基因，其中OfNAC49和OfNAC59在整个冷处理过程中均被显著诱导并高水平表达，可作为今后桂花抗寒性改良的候选基因[27]。在桂花HSF基因家族成员中确定了46个基因, OfHSFs可不同程度地受冷胁迫诱导，值得注意的是OfHSF11和OfHSF43的表达都有恢复到冷处理前水平的趋势[28]。此外，最近的一项研究表明, 在ZAT基因家族中确定的38个成员，烟草瞬时过表达的结果表明OfZAT35基因是耐冷性的负调控因子[29]。
除了冷胁迫之外，盐胁迫和干旱胁迫方面的基因家族分析也有报道。在对桂花GT基因家族分析中共确定了56个基因，值得注意的是，在不同的胁迫诱导过程中，OfGTs基因表现出多种共表达模式；瞬时表达OfGT3/OfGT42/OfGT46基因后，MDA含量降低，暗示这些基因可以提高桂花的耐盐性[30]。此外，一项关于CCCH基因家族的分析共鉴定出66个基因，其中有5和13个基因分别在盐胁迫和干旱胁迫中有表达，表明这些基因在响应非生物胁迫中具有重要作用[31]。
2 桂花转录组研究转录组是指特定条件下细胞内所有转录产物的集合[32]。和基因组不同，转录组测序可以提供一系列信息，包括基因结构域功能注释、可变切割、转录测序、差异基因表达分析和基因功能分类[33–34]；还可以推断未知基因的功能，揭示相关基因的调控机制。随着生物技术的快速发展，转录组学在桂花研究中应用越来越广泛，主要涉及花色、花香、花开放、叶色以及果实发育等方面。
2.1 花色相关转录组测序花色是桂花重要的观赏性状。桂花的花色由类胡萝卜素主导，因花瓣中类胡萝卜素含量多少而呈现乳白、浅黄、黄、金黄、橙、橙红等色[4, 35–36]。而类胡萝卜素含量的变化会受到代谢途径中关键酶基因的调控[37]。在‘早银桂’(‘Zao Yingui’)和‘橙红丹桂’(‘Chenghong Dangui’)花朵的转录组测序中共鉴定出237个参与类胡萝卜素和类黄酮合成的候选基因[38]。通过对‘堰红桂’(‘Yanhong Gui’)花瓣的转录组测序以及类胡萝卜素含量的测定分析，最终确定了15个与‘堰红桂’花瓣着色相关的关键基因[39]。以四季桂‘金玉台阁’(‘Jinyu Taige’)为实验材料，对初花期和盛花期花朵进行转录组测序，鉴定得到9个类胡萝卜素合成基因[40]。此外，最近一项有关不同桂花品种花色的转录组研究表明，类胡萝卜素含量和组成的差异使花瓣呈现出多样化的颜色，OfNCED3、OfDXS2、OfCCD1、OfGGPPS2、OfDXR3、OfBCH2和OfCCD4的表达水平是调节类胡萝卜素积累的关键因素[41]。上述工作为了解桂花花色形成的分子机理提供了参考。
2.2 花香相关转录组测序桂花花朵形小量繁，花香独特迷人，深受人们的喜爱。因其香味独特，一直以来花香是桂花研究的热点。相关研究表明，萜类化合物(芳樟醇、芳樟醇衍生物、香樟烯、香樟烯衍生物、肉桂烯、顺式氧化芳樟醇和反式氧化芳樟醇)是桂花香气的主要挥发物[9–10, 42–43]，在香气形成中发挥着重要作用。对‘日香桂’初花期、盛花期和末花期的花朵进行转录组测序，在萜类代谢途径中发现了一些与花香合成相关的候选基因(OfMYB1、OfMYB6、OfWRKY1和OfWRKY3)[44]。通过转录组测序筛选出4个与已知萜类化合物具有高度同源性的候选OfUGTs基因(OfUGT85A82、OfUGT85A83、OfUGT85AF3和OfUGT85A84)[45]。在对4个阶段桂花花朵的转录组测序中，分析并鉴定了2个候选基因(OfTPS1和OfTPS2)，qRT-PCR结果表明它们在开花期表达量最高，暗示其参与了桂花萜类化合物的合成[46]。对30份不同桂花品种的转录组测序中发现12个转录因子在不同桂花品种的芳樟醇合成途径中发挥重要作用[47]。此外，有些研究不仅鉴定出与花色相关的基因，并且确定了与花香相关的基因。如，在‘早银桂’和‘橙红丹桂’花的转录组测序中共鉴定出167个参与花香调控的基因[38]。在‘金玉台阁’初花期和盛花期花朵转录组测序中，鉴定到3个香味合成的基因[40]。以上研究有助于挖掘桂花花香的关键调控基因，揭示桂花花香的分子调控机制，对今后桂花花香分子育种有一定的指导意义。
2.3 花开放相关转录组测序根据不同品种的开花习性，桂花开放有一年一次和一年多次2种开放型。温度是决定其开花的主要因素[48]。关于桂花开放的分子研究也有相应报道。如在不同温度(19 ℃和23 ℃)处理下的桂花转录组测序中发现细胞壁代谢、植物激素信号转导通路和转录因子表达水平差异较大，一些基因可能参与了花瓣细胞在开放过程中对相对低温的响应[49]。此外，分别对‘四季桂’(‘Sijigui’)和‘堰红桂’不同时期的花芽进行转录组测序，其中3个基因(OfFT、OfTFL1和OfBFT)在花开放过程中有差异表达，进一步的研究表明OfSPL8是OfFT和OfBFT共同的上游转录因子，在连续开花调控中起着重要作用[50]。上述结果为研究桂花花朵开放的分子机制提供了新的思路。
2.4 叶色相关转录组测序2012年，木犀属品种国际登录中心正式确立了彩叶桂品种群，这是继桂花四大品种群之后的第五个品种群[5]。目前，桂花叶色的研究主要是以彩叶桂品种为对象，叶色变异的产生通常伴随着叶绿素含量的下降及类胡萝卜素与叶绿素比值的升高。彩叶桂叶色变异的分子机制十分复杂，主要涉及叶绿素代谢、类胡萝卜素代谢和光合作用等途径[51]。通过分析‘银碧双辉’(O. fragrans ‘Yinbi Shuanghui’)不同发育阶段的叶片转录组数据，共有5个基因(OfHSFA2、OfNFYC9、OfTCP20、OfWRKY3和OfWRKY4)被确定为候选基因[52]。另有一项关于‘虔南桂妃’(O. fragrans ‘Qiannan Guifei’)红色、黄绿色和绿色叶片的转录组学研究表明，7个结构基因(OfCHS、OfCHI、OfF3H、OfDFR、OfANS、OfGT和Of3AT)在红叶中高度表达，推测它们可能促进了叶片红色的消退[53]。上述研究为彩叶桂品种叶色形成机制提供了新的认识。
2.5 果实发育相关转录组测序长期以来，桂花的研究主要集中在花和叶上, 对果实的研究较少。在桂花果实发育的过程中，果皮颜色逐渐由绿色变为紫色，果肉质地逐渐软化。研究人员对不同发育阶段(绿色、半绿半紫和全紫色)的桂花果实进行了转录组测序，认为α-亚麻酸代谢和类胡萝卜素代谢途径可能是桂花果实发育过程中的重要途径；其中OfLOX、OfAOS和OfOPR的上调可能是α-亚麻酸积累的原因，而OfZISO、OfLCYE、OfLCYB和OfZEP下调可能是类胡萝卜素含量降低的原因，从而导致果实颜色逐渐由绿色变为紫色[54]。这些结果为进一步研究桂花果实发育提供了新的依据。
2.6 其他转录组测序由于桂花愈伤组织增殖效率低，不定芽分化困难，目前还未成功建立组织培养和再生体系。虽有桂花愈伤组织再分化的相关报道，但一直未能成功复制[55]。基于此，笔者所在的研究团队选取不同生长阶段的桂花愈伤组织进行了转录组测序，共鉴定了47 340个基因，其中包括1 798个先前未被鉴定的与愈伤组织发育有关的基因[56]。通过转录组和内源激素含量关联分析，确定了5个关键基因(OfSRC2、OfPP2CD5、OfARR1、OfPYL3和OfEIL3b)，这为桂花愈伤组织增殖的分子机制研究提供了新思路。
综上，通过对桂花花色、花香、花开放、叶色、果实发育等相关性状进行转录组测序，可以快速从特定通路上挖掘出调控桂花重要性状的功能基因, 大大缩短了筛选关键基因的试验周期，也为揭示其作用机制奠定了坚实基础。
3 桂花蛋白组学研究植物细胞在执行相关生物功能时会表现出一定的规律，而蛋白质组是基因表达的直接产物, 有助于揭示植物特殊形态或性状的机制。关于桂花蛋白组学研究相对较少。在桂花花瓣衰老过程中，37.6 kD多肽的表达与花瓣衰老负相关，而63.1、57.5和51.5 kD多肽的表达与花瓣的衰老正相关, 暗示了这些蛋白在桂花花瓣衰老中的功能差异[57]。有研究表明乙烯处理诱导了1条63.4 kD特异性蛋白质条带，暗示可能与衰老有关的基因调控表达相关[58]。最近一项关于桂花雌蕊蛋白质组学的研究表明，共有428种不同功能的蛋白丰度发生了显著变化，这些差异表达蛋白主要分布在糖代谢、次生代谢和信号级联反应中[59]。
4 桂花功能基因研究桂花相关功能基因的研究主要集中在花色和花香方面。研究表明OfWRKY3和OfCCD4在丹桂和银桂不同花期的花瓣中表达趋势相同，而GUS活性检测表明OfWRKY3与OfCCD4启动子相互作用，初步揭示了桂花花瓣中β-紫罗兰酮的生物合成[60]。另有报道表明转录因子OfERF61在桂花花瓣中的表达模式与OfCCD4基本一致，酵母单杂交和电泳迁移实验表明，该基因与OfCCD4启动子结合，刺激OfCCD4表达，从而调控桂花花瓣中β-紫罗兰酮的合成[61]。研究人员克隆了基因OfTPS5，烟草瞬时表达显示OfTPS5可催化形成芳樟醇，由此推测其在桂花萜类香气形成中发挥重要作用[62]。对OfMYB1R47瞬时超量表达本氏烟草并测定挥发性物质，结果表明β-紫罗兰酮等芳香物的含量均发生了明显变化[63]。最近的研究表明，桂花R2R3-MYB转录因子OfMYB21与芳樟醇合成酶基因OfTPS2具有高度的协同作用，相关实验表明，OfMYB21直接结合OfTPS2启动子并激活其表达，对芳樟醇的生物合成起到正向调节作用[64]。此外，将基因OfNCED3稳定转化烟草，阳性植株中类胡萝卜素含量显著低于对照，同时通路上相关基因的表达量明显上调, 表明OfNCED3能降解类胡萝卜素，从而使桂花花瓣的颜色发生变化[65]。
关于花色[66–67]、花香[68–69]和低温调控[70–71]的信号通路均有报道，基于现有数据初步绘制了桂花相关信号通路。其中，桂花花色主要是类胡萝卜素代谢途径。首先GGPP在PSY酶的作用下形成八氢番茄红素，接着在LCY的作用下合成叶黄素和玉米黄素，而玉米黄素和β-类胡萝卜素在CCD的催化下最终形成脱辅基类胡萝卜素，这一过程可能由OfERF61、OfWRKY3和OfMYB43调控(图 1: A)。桂花花香主要是单帖类物质，而萜类物质的合成途径主要是MEP途径。MEP途径涉及多步酶促反应, 首先磷酸烯醇式丙酮酸+4-磷酸赤藓糖合成3-磷酸甘油醛+丙酮酸，接着在DXS和DXR的作用下生成IPP，IPP在GPPS的作用下形成GPP，最后在TPS的作用下形成单萜，这一过程可能由OfMYB1等多个基因调控(图 1: B)。桂花逆境方面的研究很少, 主要是低温，涉及ABA通路。首先ABA合成ABA受体蛋白(PYB、PYL和RCAR)，接着这些受体蛋白在PP2C的催化下合成SnRK2，这一过程可能由OfbHLH120等多个基因调控(图 1: C)。
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图 1 桂花相关性状信号通路。A: 花色; B: 花香; C: 低温; PSY: 八氢番茄红素合酶; PDS: 八氢番茄红素去饱和酶; ZDS: ζ-胡萝卜素去饱和酶; α-LCY: 番茄红素α-环化酶; β-LCY: 番茄红素β-环化酶; CCD: 类胡萝卜素切割双加氧酶; DXS: 5-磷酸脱氧木酮糖合成酶; DXR: 5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶; GPPS: 牻牛儿基焦磷酸合酶; TPS: 萜类合酶; PYR: 4-溴-N-(2-吡啶甲基)-1-萘磺酰胺抗性; PYL: 类似4-溴-N-(2-吡啶甲基)-1-萘磺酰胺抗性; RCAR: ABA受体调控组分; PP2C: 2C型蛋白磷酸酶。 Fig. 1 Signal pathway of Osmanthus fragrans related traits. A: Flower coloration; B: Floral scent; C: Cryogenic; PSY: Phytoene synthase; PDS: Phytoene desaturase; ZDS: ζ-Carotene desaturase; α-LCY: Lycopene α-cyclase; β-LCY: Lycopene β-cyclase; CCD: Carotenoid cleavage dioxygenase; DXS: 1-Deoxy-d-xylulose-5-phosphate aynthase; DXR: 1-Deox-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase; GPPS: Geranyl pyrophosphate synthase; TPS: Terpene synthase; PYR: Pyrabactin resistance; PYL: Pyrabactin resistance-like; RCAR: Regulatory component of ABA receptors; PP2C: Type 2C protein phosphatases. |
桂花是我国特有的观赏植物，四季长青，花香醉人，具有广阔的发展前景。桂花分子生物学研究起步较晚，虽已在花色、花香、叶色等方面取得诸多进展，但仍有许多问题亟待解决。主要表现在：一是桂花品种多，目前仅有‘日香桂’和‘柳叶金桂’公布了全基因组，而其它桂花品种全基因组测序工作的完成更有助于破译桂花的起源与进化问题; 二是桂花组学研究的相关报道以转录组居多，关于其他组学或多组学联合分析仅零星报道, 多组学联合分析可以更好地阐明桂花相关性状的分子机制; 三是桂花高效稳定的遗传转化体系还未建立，导致一些优异基因只能在模式植物中进行功能验证。虽然功能基因在模式植物中的功能验证可以解析内在的调控机制，但桂花本源的基因功能验证更具有说服力; 四是桂花相关性状(观赏性状和抗逆性状)的分子调控机制研究不够深入，仍需加强研究。
目前，分子生物学工程相关技术已较为成熟, 桂花分子生物学相关研究已奠定基础。今后的桂花研究应注重挖掘重要优异基因、突破高效生物育种关键技术、选育突破性新品种和完善分子调控机制这几个方面，从而更好地发挥其应用价值。
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