金线莲(Anoectochilus roxburghii)是兰科(Orchidaceae)开唇兰属植物，其主要活性成分有金线莲苷^[1]、黄酮^[2]、多糖^[3]等，具有降血糖^[4]、保肝^[5]和抑制肿瘤^[6]等功效，是福建道地中药材。金线莲对生境条件要求苛刻且胚发育不全，须与菌根真菌共生，才能萌发，种子自然条件下萌发率低，野生资源濒临灭绝。虽然，近年来经过科研工作者的努力，金线莲在组织培养和人工栽培的关键技术上取得重大突破^[7–8]，但是，长期的无性繁殖，也造成了金线莲品质的退化，因此，开展金线莲有性杂交育种研究已经迫在眉睫。花器官是植物有性繁殖器官，有关金线莲花器官发育已有少量的研究报道。邢丙聪等^[9]筛选了23条金线莲的WRKY转录因子，其中ArWRKY5和ArWRKY20基因在叶芽期、花芽期和开花期的花中表达量都显著高于根、茎、叶, 可能具有调控花发育的功能。陈育青等^[10–12]利用电子显微镜观察了金线莲花药发育过程的形态、钙离子、多糖和脂滴的分布特征。

YABBY家族转录因子是一类植物特有转录因子，在植物生长、发育和形态发生中发挥重要作用，包含有N端C2C2锌指结构域和C端类似HMG框的螺旋-环-螺旋的YABBY结构域^[13]。目前已经从拟南芥(Arabidopsis thaliana)^[14]、水稻(Oryza sativa)^[15]、荷花(Nelumbo nucifera)^[16]、人参(Panax ginseng)^[17]、小桐子(Jatropha curcas)^[18]、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)^[19]、毛果杨(Populus trichocarpa)^[20]等作物中分别鉴定出6、8、9、16、7、11、12个YABBY基因。双子叶植物YABBY基因家族被分为CRABS CLAW (CRC)、FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/ YABBY3 (YAB3)、INNER NO OUTER (INO)、YABBY2 (YAB2)和YABBY5 (YAB5)等5个亚家族，单子叶植物被分为4个亚家族，缺少YAB5亚家族^[21]。

CRC亚家族基因与心皮发育、蜜腺形成、花分生组织终止、果实发育和叶片中脉形成有关，同源基因在不同作物间存在功能差异。豌豆(Pisum sativum)的PsCRC基因调控心皮的融合、蜜腺的发育^[22]。玉米(Zea mays)的drl1和drl2是花分生组织决定和花器官发育所必需的^[23]。黄瓜(Cucumis sativus)的CsCRC^G通过转录激活CsARP1，从而增强细胞扩增，正向调节果实伸长^[24]。目前，未见金线莲CRC基因的相关研究报道。

鉴于CRC亚家族基因在植物花器官、果实和叶片发育过程发挥重要作用，本研究在前期福建种源金线莲全长转录组测序的基础上，筛选克隆了1条CRC基因的CDS序列，并开展生物信息学分析、亚细胞定位以及不同器官表达分析，以期为进一步验证基因功能奠定基础。

试验材料为福建种源金线莲(Anoectochilus roxburghii)种植苗，种植于福建省农业科学院亚热带农业研究所温室大棚；亚细胞定位材料为本氏烟草(Nicotiana benthamiana)。

取开花期金线莲健康植株，分别取根、茎、叶、花、叶中脉和叶外缘组织，液氮速冻后-70 ℃保存。利用湖南艾科瑞生物工程有限公司的SteadyPure植物RNA提取试剂盒(货号：AG21019)和Evo M-MLV反转录试剂盒(货号：AG11706)提取总RNA和合成单链cDNA。

根据金线莲全长转录组数据获得的基因序列, 设计扩增全长CDS引物ArABBY-F和ArABBY-R (表 1)。以根、茎、叶和花混合的cDNA为模板, 进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸2 min。胶回收目的条带，连接载体pMD18T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆进行测序。测序结果用DNAMAN V6比对, 提取比对正确克隆的质粒，命名为18T-ArCRC。

表 1(Table 1)

表 1 引物 Table 1 Primer 引物 Primer 序列 Sequence (5′~3′) 功能 Function ArABBY-F GGATCCATGGAGCTGGGCTCTCCATT CDS克隆 ArABBY-R CTCGAGCTTGTCATTCCATGCGATGCT bby-F CCAAGCCAGACATTCCTCAC qPCR bby-R ACTTGGACCGCTACTGTTGG ArACT1 AGATGAGGCACAGTCCAAGA qPCR ArACT2 GCTGGAACATTGAAGGTCTC

表 1 引物 Table 1 Primer

利用Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在线搜索和预测蛋白的保守结构域和理化性质。用MEGA 6.0软件^[25]构建系统进化树(Neighbor-Joining Tree, Bootstrap 1000)。

ArCRC亚细胞定位分析委托北京启迪利泰科技有限公司完成。构建pSuper1300-35S-ArCRC-GFP重组质粒并转化农杆菌GV3101，与含有pCAMBIA 1300-35S-Histone-mcherry质粒(细胞核定位蛋白)的农杆菌GV3101以1:1体积比混合，选取生长状态良好的烟草，放于白色荧光灯下1 h, 选择倒3和倒4叶片下表面注射，暗培养48 h后激光共聚焦显微镜(Lecia sp8, 德国)下观察叶片，并捕捉荧光信号获取图像。

用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切质粒18T-ArCRC和pGEX-4T-1，经胶回收、连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取阳性克隆质粒，获得重组原核表达质粒pGEX-4T-ArCRC。将pGEX-4T-ArCRC转化大肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)，诱导表达参照林江波等^[26]的方法，蛋白分子量标准使用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的三色预染蛋白质分子量标准(10~ 180 kD) (货号：20351ES72)。Western blot检测参考教杨等^[27]的方法，一抗和二抗分别为鼠抗GST单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。

用Primer Premier 5.0软件设计ArCRC基因引物bby-F和bby-R，产物长度110 bp，以Actin作为内参基因^[28]，引物为ArACT1和ArACT2。以金线莲的根、茎、叶、花、叶中脉和叶外缘的第1链cDNA作为模板，荧光定量PCR试剂盒为湖南艾科瑞生物工程有限公司的SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(货号：AG11701)，具体操作参照林江波等^[29]方法进行，仪器为Roche LightCycler 96。以茎的表达量作为参考因子，采用2^–ΔΔCT法计算基因相对表达量。

以金线莲根、茎、叶和花混合的cDNA为模板，利用引物ArABBY-F和ArABBY-R进行PCR扩增，获得1条约580 bp的特异性条带(图 1)。目的条带测序结果表明克隆到ArCRC基因的开放阅读框, 长度为576 bp (GenBank登录号OR394646)，编码191个氨基酸。ProtParam预测ArCRC蛋白的分子量为21.514 kD，理论等电点为9.16，不稳定系数41.12，属于不稳定蛋白。

图 1(Fig. 1)

图 1 PCR电泳结果。M: DNA marker 2000; 1, 2: ArCRC基因全长CDS。 Fig. 1 PCR products by electrophoresis. M: DNA marker 2000; 1 and 2: CDS of ArCRC.

Protein BLAST在线搜索比对，ArCRC蛋白在5~144氨基酸具有YABBY superfamily保守结构域，E-value为1.06×10^–56，在107~150氨基酸含有HMG-box­_SF superfamily保守结构域，E-value为4.74× 10^–4 (图 2)。

图 2(Fig. 2)

图 2 ArCRC蛋白保守结构域 Fig. 2 Conserved domains of ArCRC protein

把金线莲ArCRC蛋白与8个水稻和6个拟南芥的YABBY蛋白进行聚类分析，结果表明(图 3)，ArCRC与水稻的OsDL和拟南芥的AtCRC聚为一类，亲缘关系最近，属于CRC亚家族，因此将基因命名为ArCRC。

图 3(Fig. 3)

图 3 ArCRC与水稻和拟南芥YABBY蛋白聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of ArCRC and YABBY proteins in rice and Arabidopsis

将ArCRC蛋白与植物细胞核定位Marker在烟草叶片中共定位，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，ArCRC与植物细胞核定位Marker定位一致(图 4)，说明ArCRC定位于细胞核。

图 4(Fig. 4)

图 4 ArCRC蛋白在烟草叶片下表皮细胞中的亚细胞定位。标尺=25 µm Fig. 4 Subcellular localization of ArCRC protein in lower epidermal cells of tobacco leaves. Bars=25 µm

将转化了pGEX-4T-ArCRC的大肠杆菌BL21 (DE3), 37 ℃诱导表达3 h后进行SDS PAGE分析蛋白表达。GST蛋白分子量为26 kD，ArCRC蛋白分子量为21.514 kD，pGEX-4T-ArCRC融合蛋白分子量为47.514 kD。从图 5可见，与诱导前相比，诱导后的E. coil菌液出现1条约47.514 kD的差异条带。蛋白表达产物用GST标签的单克隆抗体进行Western blot检测，诱导表达的蛋白与GST单克隆抗体在47.514 kD处有明显的杂交条带，未诱导的无条带，结果说明ArCRC基因被成功诱导表达。

图 5(Fig. 5)

图 5 SDS-PAGE电泳和Western blot检测。M: Marker (10~180 kD); 1: 诱导前; 2: 诱导后。 Fig. 5 SDS-PAGE electrophoresis and western blot detection. M: Marker (10-180 kD); 1: Pre-induction; 2: After induction.

利用qRT-PCR检测ArCRC基因的表达模式, 结果表明(图 6)，ArCRC基因在金线莲的根、茎、叶和花中都能检测到表达，花的表达量最高，其次是叶，分别是茎表达量的301.29和57.88倍，达极显著差异；花的表达量是叶片的5.21倍，达极显著差异; 茎和根的表达量很低，差异不显著。ArCRC基因在叶片中脉的表达量显著高于叶片外缘。

图 6(Fig. 6)

图 6 ArCRC基因在金线莲器官中的相对表达量。柱上不同大、小写字母分别表示差异极显著(P < 0.01)和差异显著(P < 0.05)。 Fig. 6 Relative expression of ArCRC in organs of Anoectochilus roxburghii. Different capital and small letters upon column indicated significant difference at 0.01 and 0.05 levels, respectively.

YABBY基因家族是高等植物特有的一类转录因子，主要参与调控植物花器官和叶片发育，CRC是其中的一类亚家族。拟南介AtCRC基因是心皮和蜜腺发育的主要决定因素，CRC功能缺失导致心皮未融合、蜜腺缺失^{[13, 30]}。水稻DL (DROOPING LEAF)基因与拟南芥CRC是同源异型基因，主要和水稻叶片中脉的形成和花的发育相关，水稻DL基因功能缺失突变，心皮同源转化为雄蕊，叶片中脉缺失^[31–32]。本研究从金线莲中克隆了ArCRC基因编码区序列，编码的氨基酸序列含有YABBY superfamily和HMG-box_SF superfamily保守结构域，属于不稳定蛋白，本氏烟草瞬时表达确定ArCRC定位于细胞核。将重组原核表达质粒pGEX-4T-ArCRC导入大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后, Western blot进一步验证，获得与预测大小一致的GST-ArCRC融合表达蛋白，说明ArCRC基因可以在大肠杆菌中正确表达。序列进化分析表明ArCRC与水稻的OsDL和拟南芥的AtCRC聚为一类，属于CRC亚家族。推测ArCRC与水稻的OsDL和拟南芥的AtCRC具有相似的功能。

CRC基因在植物中的表达具有组织特异性。番茄SlCRCa基因在花瓣和雄蕊中高度表达，响应赤霉素处理，通过影响细胞分裂和细胞扩张来负调控果实和花器官大小^[33]。小桐子JcCRC基因仅在花器官中检测到表达^[18]。巴西橡胶树HbCRC1基因在叶片中高表达，且在叶片发育过程呈略微上调趋势，HbCRC2基因在雌花中高表达，在叶片中不表达^[19]。水稻DL基因在叶原基的中心区域和心皮原基表达，促进叶片中脉的形成和心皮的发育^[32]。为了预测金线莲ArCRC基因在金线莲生长发育过程中潜在的功能，本研究利用荧光定量PCR分析了ArCRC基因在不同器官中的表达水平，ArCRC基因在花中表达量最高，其次是叶片，且叶中脉表达量显著高于外缘，花的表达量是叶片的5.21倍，推测金线莲ArCRC基因在金线莲花器官发育中发挥功能，同时还参与调控叶片中脉的形成。

综上，从金线莲中克隆出YABBY家族转录因子CRC亚家族的ArCRC基因，编码191个氨基酸。金线莲ArCRC基因含有YABBY superfamily和HMG-box_SF superfamily保守结构域，属于YABBY家族的CRC亚家族。ArCRC是细胞核定位的转录因子，在金线莲花和叶中脉高表达，表明ArCRC可能在金线莲花发育和叶中脉形成中发挥重要功能。