喙核桃(Annamocarya sinensis)是胡桃科(Juglandaceae)喙核桃属的单种属植物，其因果实的顶端具鸟喙状尖头而得名，是第三纪古热带孑遗植物^[1–3]。喙核桃是《国家重点保护野生植物(2021版)》中的国家二级保护物种，也是《中国植物红皮书》中的濒危等级物种^[4–5]。喙核桃从植株到果实均具有较高的利用价值，其树皮和外果皮均可提取单宁; 果壳能制作活性炭；种仁含油率较高，可应用在食用和工业方面；其木材纹理清晰，光泽亮丽, 常用于制作家具或乐器^[6–7]。喙核桃在全世界仅在中国西南部(广西、贵州、云南三省极为狭窄的几个区域)和越南北部有分布，野外分布范围极其狭窄且植株数量稀少，是一种高价值的濒危树种^[8–9]，对其进行研究和保护是目前亟待进行的重要任务。

目前国内外学者对喙核桃的形态^{[1, 10]}、分类^[11–12]、群落结构^[13]、繁育方法^[14]、营养成分^[7]、光合特性^[15]等方面已进行了部分研究，在分子遗传学方面，Manos等^[16]通过分子和形态数据进行了分子系统发育分析；Ji等^[17]利用云南省西畴县的喙核桃样品组装了喙核桃完整的叶绿体基因组，并利用新一代测序技术得出了喙核桃叶绿体基因组完整序列; 史艳财等^[18]对喙核桃ISSR-PCR反应条件的建立与优化，这些研究均为喙核桃的遗传多样性研究奠定了坚实基础。Zhang等^[8]对喙核桃进行了遗传多样性和种群结构分析，但研究对象仅限于分布于贵州省三都县、云南省富宁县和麻栗坡县的喙核桃群体，而广西作为喙核桃的主要分布地之一，该区域内喙核桃的种群遗传多样性还未见报道，由于喙核桃本身繁育困难，自我更新能力弱，且植株和栖息地均遭到严重的人为破坏，致使广西喙核桃极度濒临灭绝^[8–9]。Spielman等^[19]认为，大多数稀有物种的种群在随机事件导致种群灭绝之前往往已经受到遗传因素的影响，对于濒危物种来说，丰富的遗传变异是其长期生存的重要因素。因此，开展广西喙核桃遗传多样性研究对其资源保护具有重要意义。本文采用SSR (simple sequence repeat)标记对喙核桃进行遗传多样性研究，分析致濒原因，为广西喙核桃遗传资源保护和迁地保护提供建议，同时为后续喙核桃资源评价、良种选育、种苗繁育和回归引种等工作奠定坚实基础。

2022年对广西地区内4个喙核桃野生种群进行采样，采样信息见表 1，4个种群共采集样品47份。采集样品时选择完整无病虫害的叶片放入密封袋中，立即向密封袋中加入足量的变色硅胶，对叶片进行干燥保存，每份样品做好标签，并对采样点进行GPS定位。植物样品由广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所韦霄研究员鉴定为喙核桃(Annamocarya sinensis)。

表 1(Table 1)

表 1 喙核桃种群的采样信息 Table 1 Sampling information of Annamocarya sinensis populations 种群 Population 采样点 Sampling site 经度(E) Longitude 纬度(N) Latitude 数量 Number JX 来宾市金秀县 Jinxiu County, Laibin City 110°05′ 24°04′ 12 DL 河池市东兰县 Donglan County, Hechi City 107°21′ 24°22′ 9 LC 河池市罗城县 Luocheng County, Hechi City 108°34′ 24°54′ 16 YF 桂林市永福县 Yongfu County, Guilin City 110°01′ 24°49′ 10

表 1 喙核桃种群的采样信息 Table 1 Sampling information of Annamocarya sinensis populations

使用改良的CTAB法^[20]对喙核桃叶片进行DNA提取，提取的DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度，使用Nanodrop 2000微量分光光度计检测所提取的DNA浓度和质量，检测合格的DNA样品于–20 ℃冰箱中保存，用于后续实验。

随机挑选1份喙核桃样品进行简化基因组测序, 由于简化基因组测序分析得到的SSR位点较少，所以去除了上游和下游引物长度不是20 bp的位点、引物扩增片段长度小于110 bp的位点，并在余下的位点中每隔一段距离，随机选择1个位点作为引物筛选的备选引物，共选择了96对进行引物多态性筛选。引物筛选阶段采用的扩增方法是接头引物法，所有引物都共用1条荧光接头引物，荧光标记为FAM。选取8个样本对96对引物进行多态性验证，经筛选得到9对引物，再选取8个样本对9对引物进行复筛获得6对扩增稳定、多态性良好的SSR引物(表 2)用于47份样品的遗传多样性检测。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部合成。

表 2(Table 2)

表 2 SSR引物 Table 2 SSR primer information 位点 Locus 重复单元 Repeat unit 上游引物(5′~3′) Upstream primer 下游引物(5′~3′) Downstream primer 目的片段(bp) Destination fragment HHT010 (TA)6 CATGTTTCAATTCTGGCTGC CGTTTCCAATCCCGGTTAAT 112 HHT033 (AT)6 GAGGATCGGCACTGAGATTC TTGCTTTTCTTGCATTTTGG 133 HHT039 (CCA)6 TATTACCCACCACCACCACC AGTGGCCAAGCAGAACATTT 125 HHT054 (CT)9 GCCCACTGTTCAACCAGAAT GGCAGGCAGAAACCATACTC 119 HHT058 (TC)7 GCCAATCTCCTCTCGTTCAG AGTGAGTGCGTAGTGTGCGT 181 HHT078 (TC)7 GGCGCTACCTTCCTTCTCAT CAAATACGTTCCTGAATGCG 121

表 2 SSR引物 Table 2 SSR primer information

在Veriti 384 PCR仪上进行PCR扩增反应，反应体系为(10 μL)：DNA (20 ng/μL) 1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL，ddH₂O 3.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min；然后95 ℃变性30 s，62 ℃~52 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸30 s，运行10个循环，每个循环下降1 ℃；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，运行25个循环；最后72 ℃末端延伸20 min，4 ℃保存。荧光PCR扩增完成后，取2 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，合格后按照样本上机检测浓度要求，对各荧光PCR产物进行稀释，得到浓度均一的荧光PCR产物。取荧光PCR产物1.0 μL，GeneScan™ 500 LIZ 0.5 μL，Hi-Di™ Formamide 8.5 μL将样品和试剂加至上机板中，参照ABI 3730xl上机操作流程进行荧光毛细管电泳检测。

使用GeneMarker分析软件进行基因型数据的读取，并导出Excel基因型原始数据和PDF分型峰图文件。使用GenAlEx version 6.501软件计算SSR位点和种群的遗传多样性指标，包括观测等位基因数(number of observed alleles, Na)、有效等位基因数(number of effective alleles, Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity, He)、Shannon信息指数(Shannon’s information index, I)、固定指数(fixation index, F)、基因流(gene flow, N_m)和遗传分化系数(genetic differentiation coefficient, F_st)等。使用Convert 1.3.1进行数据转换，使用ADZE 1.0计算种群的等位基因丰富度(allelic richness, A_R)和私有等位基因丰富度(private allelic richness, P_A)。使用Powermarker v3.25计算所有位点多态性信息指数(polymorphism information content, PIC)。使用STRUCTURE 2.3.4对47份样品进行群体结构分析，设置K=1~4，Burn-in周期为10 000，MCMC (MarkovChain Monte Carlo)设为100 000，每个K值运行20次，运行的结果使用STRUCTURE HARVESTER算出最佳ΔK值(即为最佳群体分组情况)。根据最佳K值作图，使用CLUMMP和DISTRUCT软件制图。使用GenAlEx version 6.501进行分子方差分析(AMOVA)。使用Powermarker软件计算各群体间的遗传距离，使用UPGMA方法进行聚类分析，绘制环状聚类图和树状聚类图。

对筛选出的6对引物进行多态性分析(表 3)，其中，Na共19个，最小的2个，最大的6个，平均每个位点为3.167个。Ne最大为2.612，平均每个位点为1.656。I平均为0.616。Ho为0.106 (HHT033)~ 0.574 (HHT054)，平均为0.303。He最小为0.137 (HHT033)，最大为0.617 (HHT039)，平均0.345。PIC最大为0.536 (HHT039)，最小为0.128 (HHT033), 平均为0.306。6对引物的F为-0.153 (HHT054)~ 0.333 (HHT058)，平均为0.112。6对引物中HHT054和HHT078存在显著差异(P < 0.001)。位点HHT039的多态性较高(He=0.617，I=1.014)。

表 3(Table 3)

表 3 SSR引物的多态性 Table 3 Polymorphisms of SSR primers 位点 Locus Na Ne I Ho He PIC F HHT010 2 1.184 0.291 0.170 0.156 0.143 –0.094 HHT033 2 1.159 0.264 0.106 0.137 0.128 0.224 HHT039 3 2.612 1.014 0.457 0.617 0.536 0.260 HHT054 6 1.993 0.982 0.574 0.498 0.450 –0.153*** HHT058 3 1.540 0.575 0.234 0.351 0.296 0.333 HHT078 3 1.446 0.572 0.277 0.308 0.280 –0.103*** 平均 Mean 3.167 1.656 0.616 0.303 0.345 0.306 0.112 标准差 St Dev 1.472 0.558 0.324 0.178 0.189 0.149 Na: 观测等位基因数; Ne: 有效等位基因数; I: Shannon信息指数; Ho: 观测杂合度; He: 期望杂合度; PIC: 多态性信息指数; F: 固定指数; ***: P < 0.001。下同 Na: Number of observed alleles; Ne: Number of effective alleles; I: Shannon’s information index; Ho: Observed heterozygosity; He: Expected heterozygosity; PIC: Polymorphism information content; F: Fixation index; ***: P < 0.001. The same below

表 3 SSR引物的多态性 Table 3 Polymorphisms of SSR primers

对4个喙核桃野生种群进行遗传多样性分析(表 4), 4个野生种群的Na为1.667~2.667，种群JX最低, YF最高，平均为2.125。Ne最高的是种群DL，最低的是LC，平均1.581。I平均为0.477，最高的是种群YF, 最低的是JX。Ho最高为种群YF，最低为LC, 平均0.310。种群JX的He最低，YF最高，平均为0.286。A_R最高的是种群YF，JX最低，平均1.677。P_A最高的是种群DL，最低的是JX，平均为0.194。4个种群的F均小于0，说明4个种群的杂合体过剩。综合来看，4个喙核桃野生种群中，YF的遗传多样性水平最高(He=0.339，I=0.598)，JX最低(He=0.247，I=0.379)。

表 4(Table 4)

表 4 喙核桃群体间的遗传多样性 Table 4 Genetic diversity among Annamocarya sinensis populations 种群 Population Na Ne I Ho He AR PA F DL 2.167 1.777 0.514 0.315 0.305 1.747 0.294 –0.016 JX 1.667 1.531 0.379 0.278 0.247 1.524 0.093 –0.120 LC 2.000 1.424 0.416 0.263 0.253 1.576 0.155 –0.054 YF 2.667 1.593 0.598 0.383 0.339 1.863 0.232 –0.136 Mean 2.125 1.581 0.477 0.310 0.286 1.677 0.194 –0.084 AR: 等位基因丰富度; PA: 私有等位基因丰富度。 AR: Allelic richness; PA: Private allelic richness.

表 4 喙核桃群体间的遗传多样性 Table 4 Genetic diversity among Annamocarya sinensis populations

4个种群的分子方差分析结果表明，种群间的遗传变异占20%，种群内的遗传变异占80%。对种群间的遗传分化系数和基因流进行分析(表 5)，结果表明，LC和DL种群间的遗传分化系数为0.202，2个群体间达到了高度分化水平，其他种群间的遗传分化系数为0.058~0.137，达到中度分化水平。4个种群间的基因流为0.986~4.084，其中LC和DL种群间的基因流最小，为0.986，为中度基因交流水平，而其他种群间的基因流为1.580~4.084，均达高度基因交流水平，其中YF和DL种群间的基因流最大(2.489)。

表 5(Table 5)

表 5 喙核桃群体间的基因流(上三角)和遗传分化系数(下三角) Table 5 Gene flow between populations (upper triangle) and coefficient of genetic differentiation (lower triangle) of Annamocarya sinensis 种群 Population DL JX LC YF DL 1.584 0.986 2.489 JX 0.136 1.580 2.314 LC 0.202 0.137 4.084 YF 0.091 0.097 0.058

表 5 喙核桃群体间的基因流(上三角)和遗传分化系数(下三角) Table 5 Gene flow between populations (upper triangle) and coefficient of genetic differentiation (lower triangle) of Annamocarya sinensis

对47份样品进行Structure遗传结构分析，根据似然值最大原则，当K=3时，ΔK最大(图 1)。从图 2可知，4个种群的47份样品均混合了3个亚群，且每个亚群所占比例相接近，样本植株间存在不同程度的基因交流，遗传背景丰富。

图 1(Fig. 1)

图 1 最佳类群数(K)与推断值(ΔK)的变化趋势 Fig. 1 Trend of the rational groups number (K) and estimated value (ΔK)

图 2(Fig. 2)

图 2 喙核桃的Structure分析结果(K=3) Fig. 2 Structure analysis results of Annamocarya sinensis (K=3)

对4个种群进行UPGMA聚类分析，由图 3可见，YF和LC最先聚在一起，这2个种群的遗传距离最近，其次与JX相聚，最后相聚的是DL，但综合来看，4个种群的遗传距离均较近。

图 3(Fig. 3)

图 3 喙核桃4个种群的UPGMA聚类 Fig. 3 UPGMA cluster of 4 populations of Annamocarya sinensis

对47份样品进行UPGMA聚类分析，由图 4可见，47份样品无法按种群精确划分，但大致可分为3类, 第1类包含了7份JX样品、5份DL样品和2份YF样品；第2类包含了9份LC样品；第3类包含了8份YF样品、7份LC样品、5份JX样品和4份DL样品。可见4个种群的47份样品分类时相互混杂，这也说明了4个种群遗传距离近，基因交流较为频繁。

图 4(Fig. 4)

图 4 喙核桃47份样品的UPGMA聚类结果 Fig. 4 UPGMA cluster of 47 samples of Annamocarya sinensis

SSR标记在植物遗传多样性分析方面应用较为广泛，使用SSR分子标记方法对喙核桃遗传多样性进行分析，能揭示喙核桃的多样性和遗传变异，为喙核桃的资源保护和选育提供参考^[21–23]。本研究使用SSR分子标记对喙核桃种群遗传多样性进行分析, 结果表明，Shannon信息指数为0.477，期望杂合度为0.286，低于其他濒危物种(He=0.42)^[24]；比同科的珍稀濒危植物胡桃楸(J. mandshurica)的Shannon信息指数(0.748 8)和期望杂合度(0.363 3)^[25]低。也低于Zhang等^[8]对分布于贵州省三都县、云南省富宁县和麻栗坡县的70个喙核桃样品(He=0.582)。可见本研究中喙核桃种群的遗传多样性水平较低，这或许是因为广西喙核桃种群较小，且现存的喙核桃植株遭受到严重的人为破坏，人为砍伐和破坏可能会导致喙核桃生境片段化，进而导致种群内个体数量减少，使种群内本就不高的遗传多样性越来越低^[26]。

喙核桃种群间的遗传分化系数为0.120，达到中高度分化，基因流为2.173，种群间的遗传分化程度较高，且存在一定程度基因交流。罗城种群(LC)与东兰种群(DL)的遗传分化达高度分化水平(F_st= 0.202)，这2个种群间的基因交流为中度水平(N_m= 0.986)。张智勇^[26]认为喙核桃与核桃(J. regia)在形态上表现出相似性，如风媒花、雌雄同株异花、雌雄异熟等，推测其与核桃类似具有自交不亲和现象, 但尚未有其繁育系统的研究报道。喙核桃一般以单株形式存在或稍多几棵成群分布，地理距离可能会影响其种群间基因交流从而引起种群遗传分化，特别是地理距离较远的种群间，如罗城种群(LC)与东兰种群(DL)(距离约136.56 km)、靖西种群(JX)与东兰种群(DL)(距离约279.18 km)。

另外，本调查在永福、东兰等地发现喙核桃单株下有相当数量的不同年份果实，但在周围却没有发现任何植株和幼苗，说明其种子的萌发率很低, 与张智勇^[26]的调查结果一致，预示喙核桃存在着自交衰退现象，并导致种子萌发率低。因此，喙核桃可能是由于种群小，且自身繁育困难，种子萌发率低，因而促进了群体内的遗传漂变的发生，也可能会影响种群间的遗传分化水平。

分子方差分析表明种群间的遗传变异占20%, 个体内的遗传变异占80%，遗传变异主要来源于种群内。张智勇^[26]的研究表明87%的遗传变异来自于种群内，13%的差异来自于种群间。对不同地区喙核桃的研究结果一致，说明喙核桃群体的主要遗传变异存在于种群内，所以在进行整体遗传多样性保护的基础上还应加大力度筛选优良植株进行保护, 并进行传粉生物学和种苗繁育研究，挖掘更多的群体内的遗传变异。

UPGMA和Structure的分析结果均表明4个喙核桃种群的样品无法按地理位置精确划分，但大致可分为3类，各类中各种群的喙核桃样品相互混杂，遗传背景丰富，种群间均质化明显，推测可能是广西现存的各种群的起源祖先种群相同，但由于历史进化过程中发生了生境片段化，从而造成了现存的多个分散种群，这可能会导致喙核桃的长期适应性进化能力降低，增加在变迁环境中因随机事件而灭绝的风险^[27]，因此在进行喙核桃种群保护时建议建立保护小区，对喙核桃植株进行保护的同时对栖息地环境进行保护，以避免喙核桃无法适应变化的环境而灭绝。

遗传多样性能体现物种进化潜力以及适应环境变化的能力，物种的遗传多样性水平越高，适应环境变化的能力越强，反之越弱^[28]。由于广西喙核桃的遗传多样性非常低，对环境的适应能力较低, 环境的改变极易引起喙核桃遗传多样性的丢失，甚至是灭绝。因此，对喙核桃和原生境进行就地保护是遗传多样性保护的首要任务，所以应将广西所有喙核桃种群建立保护小区以达到保护种群植株及生境的目的。在4个种群中，永福种群的遗传多样性水平最高，在进行保护时应作为重点保护种群。另外，喙核桃的主要遗传变异存在于群体内，应加强对喙核桃优良种质资源的筛选并进行迁地保护, 加强喙核桃的种苗繁育、传粉生物学等相关基础研究，攻克繁育瓶颈问题，繁育更多的优质种苗。由于野生喙核桃野生更新能力低，建议加强回归引种工作，通过增加种群的植株数量来缓解自交衰退问题，从而保护和提高广西喙核桃种群的遗传多样性。