2. 深圳市中国科学院仙湖植物园, 广东 深圳 518004
2. Fairy Lake Botanical Garden, Shenzhen & Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518004, Guangdong, China
秋海棠为秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属(Begonia)植物的统称,为世界第四大盆花。因其种类繁多、叶形叶斑丰富多样、可花叶兼赏等优点,部分品种在室内盆栽和园林绿化中大量应用,园艺产值巨大,被视作21世纪最具开发价值的类群之一[1]。花香挥发性成分作为植物与外界交流的一类信号,不仅对害虫的生物防治和植物育种具有重要意义[2],而且对人体健康有一定的作用[3],还可应用到食品、制药、化妆品等领域中[4]。然而,花香这一重要的品质指标常被育种者忽视[5],因此,明确秋海棠花释放的香气成分,阐明香气成分与花香类型的关系,并探明秋海棠属植物特征香气的来源,对于秋海棠花香育种及其开发利用具有重要指导意义。
关于秋海棠属植物的系统发育学[6]、组培快繁[7]、杂交育种[8]、药理活性[9]等方面已有不少报道,但关于秋海棠属植物香气成分的研究仅有少量报道。杜文文等[10]对4种秋海棠的香气成分进行了分析和鉴定,指出假厚叶秋海棠(B. pseudodryadis)花朵更加突出果香气味,中华秋海棠(B. grandis)花朵则更加突出草香气味,柳叶秋海棠(B. fuchsioides)花朵兼有果香、甜香气味,里氏秋海棠(B. listada)花朵则具有花香、果香和甜香气味。丁友芳等[11]对盛花期的香花秋海棠(B. handelii)雄花及其变种铺地秋海棠(B. handelii var. prostrata)雌花和红毛香花秋海棠(B. handelii var. rubropilosa)雄花的挥发性香气成分进行分析,表明铺地秋海棠和红毛香花秋海棠香气成分较接近,富含具有清香、甘甜气息的芳樟醇氧化物等物质;香花秋海棠花中醛类物质含量最高,具有淡焦甜香气。芳香植物挥发性成分的鉴定,是植物资源多样性评价及开发利用、新品种培育的基础[12]。挥发性化合物的组成和含量不仅在不同物种间存在较大差异,在种间和品种间同样有着较大差异[13],目前仅有7种秋海棠花香成分的报道,难以揭示秋海棠属植物的种间差异。秋海棠属植物中还有不少带有香味的种或品种可继续深入研究其挥发性成分,以挖掘出优良的香花秋海棠种质资源。因此,本研究拟利用顶空-固相微萃取(HS-SPME)方法结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析3种秋海棠鲜花的挥发性成分,旨在阐明不同秋海棠属植物间挥发性成分的差异,进一步揭示主要香气成分的差异,以期为秋海棠新品种选育和深度开发利用提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 试验材料丽纹秋海棠(Begonia kui)、鸟叶秋海棠(B. ornithophylla)和巴萨罗斯秋海棠(B. barsalouxiae) 3种秋海棠均为雌雄异花同株植物,经东莞植物园冯欣欣博士和仲恺农业工程学院郭微教授鉴定后,引种栽植于广东省广州市仲恺农业工程学院白云校区。于2023年4月,选取生长良好、无病虫害的3种秋海棠盛花期雄花鲜花进行试验,采集后立即进行分析。
1.2 试验仪器与方法主要试验仪器:Agilent 7980A-5975C气相质谱联用仪、色谱柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 µm);萃取装置:SPME手动进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取针头、德国IKA艾卡RCT Basic加热型磁力搅拌器、金属浴装置。
SPME条件:称取丽纹秋海棠约0.35 g、鸟叶秋海棠约0.15 g,剪碎后分别转移至15 mL顶空螺纹瓶中;称取巴萨罗斯秋海棠约0.20 g,整朵放入15 mL顶空螺纹瓶中。随后把顶空瓶放置于磁力搅拌器上加热至50 ℃的金属浴装置中10 min,然后使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空螺纹瓶,顶空萃取30 min。萃取完成后,将萃取头插入色谱仪进样口进行解吸,解吸温度250 ℃,解吸时间3 min。每个样品重复3次。
GC-MS条件:参照梁晓莉等[14]方法。GC条件:色谱柱HP-5MS (30 m×0.25 mm ID×0.25 μm膜厚), 载气为高纯氦气(99.999%),进样口温度250 ℃,不分流进样。程序升温:起始温度40 ℃,保持0 min,然后以3 ℃/min升至80 ℃,保持0 min;再以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min。MS条件:电离方式EI; 电子能量70 eV;传输线温度250 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;扫描质量范围35~500 amu。
1.3 数据分析定性分析采用NIST08.L标准谱库分析秋海棠花的挥发性成分,并结合相关文献以及人工解析等方法进一步鉴定及筛选。定量分析通过面积归一化法计算各成分的相对百分含量。使用Excel 2019软件对挥发性成分的数量和相对百分含量进行统计分析,采用Origin 2021软件进行韦恩图、堆积柱状图和主成分分析(PCA),用Metabo Analyst 5.0软件进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。
2 结果和分析 2.1 不同秋海棠花挥发性成分定性分析采用HS-SPME-GC-MS技术对3种秋海棠属植物的雄花进行检测鉴定分析(表 1)。从3种植物共鉴定出97种挥发性成分,可分为8大类,其中包括21种萜烯类、22种醇类、11种酯类、7种醛类、6种酮类、8种烃类、6种杂环类及16种其他类化合物。鸟叶秋海棠鉴定出的挥发性成分最多,达56种;其次是巴萨罗斯秋海棠、丽纹秋海棠,分别鉴定出44和30种挥发性成分。在丽纹秋海棠中,其他类化合物成分种类最多,有8种,其次是醇类有7种,杂环类有6种;在鸟叶秋海棠中,萜烯类和醇类化合物成分种类最多,分别有15种和13种, 其次是酯类有7种;在巴萨罗斯秋海棠中,醇类化合物成分种类最多,有12种,其次是萜烯类有9种,杂环类和其他类均有5种。
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表 1 3种秋海棠挥发性成分及相对含量(%) Table 1 Volatile components and relative content (%) in three Begonia species |
对鉴定到的97种挥发性成分进行差异分析(图 1), 结果表明,丽纹秋海棠有13种特有成分, 巴萨罗斯秋海棠有24种,鸟叶秋海棠最多,有36种。97种挥发性成分中有9种在3种秋海棠雄花中均能检测到,分别是醇类2种(2-乙基己醇和1-壬醇)、酯类2种[癸酸乙酯和2,4,4-三甲基戊烷-1,3-二基双(2-甲基丙酸酯)]、醛类1种(壬醛),杂环类4种(六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷和十二甲基环六硅氧烷)。
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图 1 3种秋海棠挥发性成分韦恩图分析 Fig. 1 Venn diagram analysis of volatile components in three Begonia species |
从表 1可见,丽纹秋海棠雄花中30种挥发性成分占总挥发性成分含量的100.00%,鸟叶秋海棠的56种挥发性成分占99.77%,巴萨罗斯秋海棠的44种挥发性成分占99.57%。丽纹秋海棠中挥发性成分含量较高的是十甲基环五硅氧烷(31.84%)、十二甲基环六硅氧烷(15.21%)、八甲基环四硅氧烷(8.31%)、十二甲基二氢六硅氧烷(7.40%),占总含量的62.76%;鸟叶秋海棠中挥发性成分含量较高的是2-乙基己醇(15.27%)、芳樟醇(12.45%)、十甲基环五硅氧烷(10.47%)、D-香茅醇(9.53%)、十二甲基环六硅氧烷(9.08%)、(E)-β-金合欢烯(6.77%),占总含量的63.57%;巴萨罗斯秋海棠中挥发性成分含量较高的是芳樟醇(21.90%)、2-乙基己醇(12.66%)、十甲基环五硅氧烷(9.53%)、1-辛烯-3-醇(8.17%)、十二甲基环六硅氧烷(5.77%)、顺式氧化芳樟醇(4.99%),占总含量的63.03%。
从图 2可见,醇类和杂环类为3种秋海棠属植物雄花挥发性化合物的主要组成成分,占总含量的70%以上。丽纹秋海棠挥发性成分含量较高的是杂环类(60.14%)、醇类(16.72%)和其他类(11.48%),没有萜烯类和烃类化合物;鸟叶秋海棠挥发性成分含量较高的是醇类(46.90%)、杂环类(23.60%)和萜烯类(13.88%);巴萨罗斯秋海棠挥发性成分含量较高的是醇类(56.09%)和杂环类(21.36%)。
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图 2 3种秋海棠挥发性成分类型分析 Fig. 2 Types of volatile components in three Begonia species |
丽纹秋海棠醇类化合物含量较高的是辛醇(4.11%)、1-辛烯-3-醇(4.06%)和肉桂醇(3.85%);鸟叶秋海棠含量较高的是2-乙基己醇(15.27%)、芳樟醇(12.45%)和D-香茅醇(9.53%);巴萨罗斯秋海棠含量较高的是芳樟醇(21.90%)、2-乙基己醇(12.66%)和1-辛烯-3-醇(8.17%)。
丽纹秋海棠、鸟叶秋海棠和巴萨罗斯秋海棠杂环类化合物含量最高的是十甲基环五硅氧烷,分别为31.84%、10.47%、9.53%,其次是十二甲基环六硅氧烷和八甲基环四硅氧烷,分别为15.21%、9.08%、5.77%和8.31%、2.34%、4.16%。
丽纹秋海棠其他化合物含量较高的是十二甲基二氢六硅氧烷(7.40%);鸟叶秋海棠含量较高的是十二甲基五硅氧烷(4.98%);巴萨罗斯秋海棠含量较高的是N,N-二甲基对甲苯胺(4.60%)。
鸟叶秋海棠萜烯类化合物含量较高的是(E)-β-金合欢烯(6.77%)、罗勒烯(1.92%)和月桂烯(1.12%);巴萨罗斯秋海棠含量较高的是β-柏木烯(1.55%)、月桂烯(1.23%)和β-石竹烯(0.65%)。鸟叶秋海棠烃类化合物含量较高的是α-姜黄烯(0.29%);巴萨罗斯秋海棠含量较高的是环辛烷(1.30%)。
丽纹秋海棠醛类化合物含量较高的是3-甲基-1-戊醛(2.49%)、肉桂醛(2.22%)、壬醛(1.22%);鸟叶秋海棠含量较高的是壬醛(0.92%);巴萨罗斯秋海棠含量较高的是十六醛(2.15%)和壬醛(0.62%)。
丽纹秋海棠酯类化合物含量较高的是2,4,4-三甲基戊烷-1,3-二基双(2-甲基丙酸酯)(2.08%)和乙酸桂酯(1.34%);鸟叶秋海棠含量较高的是苯乙酸, a,3,4-三[(三甲基甲硅烷基)氧基]-三甲基甲硅烷基酯(1.44%)和癸酸乙酯(0.79%);巴萨罗斯秋海棠含量较高的是溴乙酸正辛酯(0.73%)。
丽纹秋海棠酮类化合物仅有香叶基丙酮(0.42%);鸟叶秋海棠含量较高的是香叶基丙酮(1.86%)和β-紫罗酮(1.06%);巴萨罗斯秋海棠含量较高的是3-辛酮(0.93%)。
2.3 主成分分析本研究对3种秋海棠属植物雄花中挥发性化合物相对含量大于2%的组分进行主成分分析(PCA),结果表明97种挥发性有机物中有23种含量大于2%的组分。由图 3可知,第一主成分(PC1)贡献率达48.2%,第二主成分(PC2)贡献率达29.7%,累计贡献率达到77.9%,可有效反映原始数据的信息。其中,辛醇(27)、2,4,4-三甲基戊烷-1,3-二基双(2-甲基丙酸酯) (50)、肉桂醛(58)、十二甲基环六硅氧烷(80)、十二甲基二氢六硅氧烷(90)等对PC1为正影响;芳樟醇(29)、2-乙基己醇(24)、顺式氧化芳樟醇(28)、十六醛(59)、N,N-二甲基对甲苯胺(88)等物质对PC1有着负影响;1-辛烯-3-醇(23)、(2Z)-2-辛烯-1-醇(26)等物质对PC2为正影响,D-香茅醇(38)、苯乙醇(30)等对其为负影响。
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图 3 3种秋海棠主要挥发性成分的PCA分析。数字编号见表 1。 Fig. 3 PCA analysis of main volatile components of three Begonia species. The No. see Table 1. |
3种秋海棠根据主成分的不同,被划分在3个象限中,表明三者的花香成分存在显著差异。鸟叶秋海棠位于PC1负轴和PC2负轴区域,主要香气物质有(E)-β-金合欢烯(12)、十二甲基五硅氧烷(89)、苯乙醇(30)、D-香茅醇(38)、2-乙基己醇(24);巴萨罗斯秋海棠位于PC1负轴和PC2正轴区域,主要香气物质有(2Z)-2-辛烯-1-醇(26)、1-辛烯-3-醇(23)、N,N-二甲基对甲苯胺(88)、十六醛(59)、顺式氧化芳樟醇(28)、芳樟醇(29);丽纹秋海棠位于PC1正轴和PC2正轴区域,主要香气物质有六甲基环三硅氧烷(76)、八甲基环四硅氧烷(78)、N-甲基-β,3,4-三(三甲基硅氧基)苯乙胺(91)、3-甲基-1-戊醛(55)、肉桂醇(41)、十甲基环五硅氧烷(79)、十二甲基二氢六硅氧烷(90)、肉桂醛(58),这些成分可能是造成秋海棠不同香气差异的主要原因。
2.4 关键差异化合物及其香气类型分析为进一步了解3种秋海棠花香中的关键差异化合物,更直观地体现其花香特点,对23种高含量化合物进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA),以推断香气类型。PLS-DA模型中的变量投影重要性值(VIP)可以反映各挥发性化合物的差异贡献度,VIP值越大表明差异贡献程度越大,当VIP值> 1时可认为是重要差异化合物。
从图 4可见,筛选出的15种关键差异花香化合物的相对含量在3种秋海棠间的差异极大,对其香气特征的形成和区分具有重要意义。芳樟醇(29)、十甲基环五硅氧烷(79)和2-乙基己醇(24)的VIP值> 1,作为3种秋海棠雄花的重要差异化合物。丽纹秋海棠的重要差异化合物十甲基环五硅氧烷的贡献率最高,但无嗅味,因此结合有香味的辛醇(27)和肉桂醇(41)这2个含量较高的差异化合物,推断其主要香气类型为蜡香和膏香型。鸟叶秋海棠的重要差异化合物2-乙基己醇的贡献率最高,推断其为柑橘香型。巴萨罗斯秋海棠的重要差异化合物芳樟醇的贡献率最高,推断其为花香型,同时含量较高的1-辛烯-3-醇(23)和N,N-二甲基对甲苯胺(88)也对香气有着一定影响,其中1-辛烯-3-醇具有森林清香的气息,有蘑菇香气混合着薰衣草似的香韵,N,N-二甲基对甲苯胺有着臭鸡蛋味,使得巴萨罗斯秋海棠的嗅感除了花香还掺杂着一股特殊的异味。
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图 4 3种秋海棠主要挥发性成分的PLS-DA分析。A: 丽纹秋海棠; B: 鸟叶秋海棠; C: 巴萨罗斯秋海棠; 化合物编号见表 1。 Fig. 4 PLS-DA analysis of main volatile components of three Begonia species. A: B. kui; B: B. ornithophylla; C: B. barsalouxiae; Compound No. see Table 1. |
大量研究表明,不同物种间的主要挥发性成分的种类和含量存在差异。曹桦等[15]对4种香花型石斛的研究表明,兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)、金钗石斛(D. nobile)、铁皮石斛(D. candidum)的主要挥发性成分为萜烯类化合物;美花石斛(D. loddigesii)为酯类化合物。卢路路等[16]研究表明,山栀子(Gardenia jasminoides)盛开期的醇类化合物含量最高;水栀子(G. jasminoides var. radicans)和重瓣栀子(G. jasminoides var. fortuniana)则以烯烃类化合物含量最高;狭叶栀子(G. stenophylla)的酯类化合物含量较高。本研究中的3种秋海棠同样存在差异,其中,鸟叶秋海棠与巴萨罗斯秋海棠的主要挥发性成分以醇类化合物为主;丽纹秋海棠的主要挥发性成分为杂环类。在醇类化合物中,芳樟醇和2-乙基己醇为鸟叶秋海棠和巴萨罗斯秋海棠相对含量较高的物质,其中芳樟醇具有甜的、典型的花香、木香香气,并具有新鲜的百合香味,广泛存在于植物精油中,具有抗炎、抗菌、镇静和保护神经等作用[17], 是食品、药品、日化香精行业的重要原料[18];2-乙基己醇有甜味和淡淡的花香,可用作食用香料,也是一种重要的药物中间体,在医药、化工领域有着重要的应用。与前人[10–11]研究比较分析,仅有丽纹秋海棠以杂环类为主要挥发性成分,且本研究的杂环类化合物有5种硅氧烷,其中4种为3种秋海棠的共有成分。而硅氧烷(硅油)作为化妆品的优质原料,有良好的铺展性和护肤功能,与大部分的醇和其他化妆品溶剂有很好的相容性,属于化妆品原料中的合成油脂[19]。由此看出,杂环类物质虽然无香味, 但也具有一定的开发利用价值。
花香香味的形成依靠各种挥发物的相互作用, 不同种间的主要香气物质存在较大差异,其香型主要由拥有较高气味值的挥发物决定。童妍等[20]研究表明8个蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)品种的气味品质差异较大,4个品种的花香香味是由带有玫瑰花香的芳樟醇决定的,3个品种中木质型芳香由α-香柑油烯决定,1个为复合型花香,由桉叶油醇、α-香柑油烯、芳樟醇等物质共同提供。徐慧等[21]指出,在大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)的主要香气成分为苯乙酮和芳樟醇,表现出强烈的花香;黄牡丹(P. lutea)的主要香气成分为α-蒎烯、β-古巴烯和芳樟醇,同样表现出强烈的花香;杨山牡丹(P. ostia)的主要香气成分为罗勒烯、α-蒎烯、十五烷,表现为草香和蜡香。周小理等[22]研究表明,萱草(Hemerocallis fulva)的16个杂交品种中,‘H13’是木香型品种的代表,富含特有的月桂烯、仲辛酮、2-蒎烯;‘H10’是典型的果香型品种,富含罗勒烯;‘H6’是典型的花香型品种,富含苯乙醇;‘H3’是甜香型品种代表,富含金合欢醇。本研究与前人研究一致,3种秋海棠的主要香气物质差异较大,丽纹秋海棠由十甲基环五硅氧烷、辛醇和肉桂醇作为关键差异花香物质,其香气类型为蜡香和膏香型;鸟叶秋海棠由2-乙基己醇作为关键差异花香物质,香气类型为柑橘香型;巴萨罗斯秋海棠由芳樟醇作为关键差异花香物质,香气类型为花香型,但受到1-辛烯-3-醇和N,N-二甲基对甲苯胺的影响,其嗅感为花香中掺杂着一股特殊的异味。通过了解不同花香的关键差异成分,挖掘出不同香型的香花品种,为进一步有效开发利用花香物质、培育具有不同香味的秋海棠新品种提供了理论基础。
本研究采用SPME结合GC-MS对丽纹秋海棠、鸟叶秋海棠和巴萨罗斯香花秋海棠的雄花进行挥发性成分分析。从3种秋海棠花中鉴定出97种挥发性成分,其中9种为3种秋海棠雄花的共有成分。3种秋海棠的主要挥发性成分和含量存在差异,在丽纹秋海棠中鉴定出30种挥发性化合物,以杂环类、醇类和其他类为主;在鸟叶秋海棠中鉴定出56种挥发性化合物,以醇类、杂环类和萜烯类化合物为主;在巴萨罗斯香花秋海棠中鉴定出44种挥发性化合物,以醇类、杂环类和其他类化合物为主。通过对3种秋海棠进行主成分分析发现,3种秋海棠间的主要花香成分存在显著差异,这些成分可能是造成秋海棠不同香气差异的主要原因。通过偏最小二乘判别分析,推断出丽纹秋海棠的香气类型为蜡香和膏香型;鸟叶秋海棠为柑橘香型;巴萨罗斯秋海棠为花香型,由于1-辛烯-3-醇和N,N-二甲基对甲苯胺对巴萨罗斯秋海棠香气的影响,使得其嗅感除了花香还掺杂着一股特殊的异味,这体现了花香香味的形成依靠各种挥发物的相互作用,不同种间的主要香气物质存在较大差异,这些差异可作为区分花香类型的依据。
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