2024, Vol. 32
钙离子(Ca2+)作为植物体内的一种第二信使, 在时空上的浓度变化形成钙信号。钙信号在振幅、频率和定位上具有特异性，是连接体内外刺激与细胞响应及基因表达的关键信号之一[1]。
作为一类最重要的Ca2+感受器，钙调素(calmo-dulin, CaM)是真核生物特有、高度保守且广泛存在的Ca2+结合蛋白，具有4个能与Ca2+结合的EF-hand[2–3]。当Ca2+与CaM结合时，CaM分子发生构象变化, 继而与靶标结合而传递钙信号[1]。能与CaM结合的靶标称为钙调素结合蛋白(CaM-binding protein, CaMBP), 根据与CaM结合时是否需要Ca2+，可以将其分为Ca2+依赖型和Ca2+不依赖型[5]。据Poovaiah等[6]估计，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中至少有500个CaMBP。
在植物中，CaM也是一类极为重要的第二信使, 参与生长发育和对外界刺激响应的调节[6]。拟南芥中共有7个CaM基因，编码4种经典CaM亚型(CaM1/4、CaM2/3/5、CaM6和CaM7)[7]；不同蛋白间只有少数几个氨基酸残基不同[8]。CaM处于高度选择压力下来保持高水平的保守型，可能是植物体需要同时转录多个基因来保持高的基因表达水平, 或者是CaM家族具有各自不同的特定功能[9]。因此，确定不同CaM基因的结构及功能的异同, 对于阐明CaM家族的进化意义和同种型基因之间功能关系有重要意义[8]。
植物细胞中存在大量由不同数目内含子间隔而形成的断裂基因，一个基因在不同时空或在不同内外刺激时产生不同mRNA，进而产生不同蛋白的方式称为选择性剪接(alternative splicing, AS)，可导致基因功能的多样性[10]。拟南芥中的AS类型有内含子保留(约40%)、选择性5′或3′剪接位点(约23%)、外显子跳过(约8%)及少量其他类型[11–12]。AS的功能大致分为：(1) 增加蛋白的多样性；(2) 改变蛋白的修饰位点；(3) 干扰性小肽的负调节效应；(4) 调节转录因子的活性[13]。由拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)可知，AtCaM5的核苷酸序列存在2个内含子，有2种不同的剪接方式，第2个内含子中含有终止密码子。如果第2个内含子保留，则会使翻译提前终止，产生149个氨基酸残基的CaM5.1; 如果第2个内含子被剪切，则产生含有181个氨基酸残基的CaM5.3。
IQM家族是一个含有IQ基序的CaMBP家族[14]。我们前期研究表明，拟南芥钙调素结合蛋白IQM3 (IQ-motif containing protein 3)可以在酵母细胞中与包括CaM5.1在内的CaM亚型成员结合，但是不能与CaM5.3结合。CaM5的选择性剪接产生2种类型的蛋白，推测他们具有不同的功能，因此, 进一步分析CaM5.3的结构和蛋白质结合活性的关系十分必要。
1 材料和方法 1.1 材料本研究所用CDS由拟南芥野生型Col的RNA反转录cDNA扩增得到，pGBKT7质粒、pGADT7质粒、大肠杆菌DH5α、酵母菌AH109均为实验室保存；逆转录酶、高保真Taq酶、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自TaKaRa宝生物工程(大连)公司，同源重组酶购自南京诺唯赞公司，引物合成和测序服务由上海生工生物公司完成。
1.2 方法 1.2.1 载体构建首先，在拟南芥数据库中，根据基因编号查询CDS，设计相关引物(表 1)。其次，以拟南芥cDNA为模版，先用高保真Taq酶进行扩增，再用同源重组酶将扩增产物与经EcoR I线性化载体进行同源重组，分别得到pGBKT7-IQM3和pGADT7-CaM1-7。最后，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，送生工生物公司完成测序，提取质粒备用。
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表 1 本研究所用克隆引物序列 Table 1 Cloning primer sequences used in this research |
CaM5.1-CTDCML10载体的构建：先用引物9和10扩增CaM5.1的CDS，再用引物17和18扩增CML10的CTD，然后用引物9和10，对上述扩增产物的混合物进行重叠延伸PCR扩增，最后用同源重组将产物克隆到pGADT7载体。
1.2.2 IQM3蛋白毒性和转录自激活性分析利用醋酸锂(LiAc)法制备酵母AH109感受态细胞备用。将pGBKT7-IQM3单独转化酵母感受态细胞，涂布于SD/-Trp培养基上以分析IQM3的毒性；将pGBKT7-IQM3和pGADT7同时转化酵母感受态细胞，涂布于SD/-Leu/-Trp培养基上，随后挑单菌落涂布于SD/-His/-Leu/Trp/-Ade营养缺陷培养基以分析IQM3的转录自激活性分析。
1.2.3 酵母双杂交试验将pGBKT7-IQM3分别与pGADT7-CaM1.1/2.1/3.1/4.1/5.1/5.3/6.1/7.1/CaM5.1-CTDCML10同时转化酵母感受态细胞，涂布于SD/-Leu/-Trp营养缺陷培养基，随后挑单菌落涂布于SD/-His/-Leu/Trp/-Ade/+X-α-gal营养缺陷培养基，30 ℃倒置培养4~5 d。实验重复3次。
1.2.4 生物信息学分析利用Snapgene (4.2.4)软件中的“Align protein sequence”-Clustal Omega方法对CaM1.1/2.1/3.1/4.1/5.1/5.3/6.1/7.1的氨基酸序列进行比对，序列按照CaM家族进化树亲缘关系排序(1/4、6、7、2/3/5)。
因为在已发表的蛋白数据库PDB (protein data bank) (https://www.rcsb.org/)中未找到CaM5.3的空间结构，所以在预测的蛋白数据库Alpha Fold Protein Structure Database (https://alphafold.ebi.ac.uk/)查找, 结果表明，CaM5.1和CaM5.3的Uniprot ID分别为Q682T9和F4IVN6。
2 结果和分析 2.1 IQM3蛋白毒性和转录自激活性分析要利用某蛋白进行酵母双杂交实验，首先必须确定其是否具有毒性和转录自激活活性。因此，构建pGBKT7-IQM3载体，进行IQM3蛋白毒性及自激活活性分析。图 1: A可见，pGBKT7-IQM3的转基因酵母能在SD/-His中生长，说明IQM3蛋白没有毒性。图 1: B可见，空载体pGADT7和pGBKT7-IQM3的转基因酵母不能在SD/-His/-Leu/Trp/-Ade/上生长，提示IQM3没有自激活活性。因此，pGBKT7-IQM3可用于酵母双杂交分析。
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图 1 IQM3毒性(A)和自激活分析(B)。SD/-Trp: 缺Trp的培养基；SD/-TLHA/: 缺Trp、Leu、His和Ade的培养基。下同 Fig. 1 Toxicity detection (A) and self-activation (B) of IQM3 protein. SD/-Trp: -Trp medium; SD/-TLHA/: -Trp-Leu-His-Ade medium. The same below |
拟南芥IQM家族的6个成员都含有1个IQ基序[15]，在酵母和植物细胞中IQM1通过IQ基序与CaM5.1结合[16]。为了确定该家族的另一成员IQM3是否也具有CaM结合活性，进行IQM3与CaM家
族不同成员的酵母双杂交试验。结果表明，在SD/-Leu/-Trp培养基中，所有的组合均能形成菌落(图 2)，说明共转化成功；在SD/-His/-Leu/Trp/-Ade/+X-α-gal培养基中，除pGBKT7分别与pGADT7-CaM1.1/2.1/3.1/4.1/5.3/6.1/7.1/CaM5.3的组合(未展示)和pGBKT7-IQM3/pGADT7-CaM5.3组合没有形成菌落外，其他组合形成了菌落且变蓝色，说明IQM3能在酵母中与CaM1.1/2.1/3.1/4.1/6.1/7.1/结合。
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图 2 IQM3与CaM家族成员的酵母双杂交分析。SD/-TL: 缺Trp和Leu的培养基；SD/-TLHA/+X-α-Gal：缺Trp、Leu、His和Ade，含X-α-Gal的培养基。1~7分别为pGBKT7-IQM3与PGADT7-CaM1、CaM2、CaM3、CaM4、CaM5.3、CaM6、CaM7。下同 Fig. 2 Yeast two-hybrid analysis of IQM3 and CaM family members. SD/-TL: -Trp-Leu medium; SD/-TLHA/X-α-Gal: -Trp-Leu-His-Ade/+X-α-Gal medium. 1-7 are pGBKT7-IQM3 combined with PGADT7-CaM1, CaM2, CaM3, CaM4, CaM5.3, CaM6, CaM7, respectively. The same below |
为了探究CaM5.3不能和IQM3结合的原因, 进行了相关生物信息学分析。在拟南芥数据库中获取CaM5的2个剪接体所编码的氨基酸序列：CaM5.1和CaM5.3 (未发现命名为CaM5.2的剪接体)，与从该数据库获取CaM家族其他成员的氨基酸序列进行比对(图 3)。结果表明，CaM5.3在第4个EF-hand末端还有1个由32个氨基酸残基组成的C-末端序列(C-terminal domain, CTD)，其余序列与CaM2.1、CaM3.1和CaM5.1完全相同。因此，CaM5.3的CTD可能是阻碍CaM5.3与IQM3结合的原因。
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图 3 拟南芥CaM家族氨基酸序列的同源性比对。红框: EF-hand保守区; *: 高度保守区; ∶: 相似序列。 Fig. 3 Homology alignment of amino acid sequences of CaM family in Arabidopsis thaliana. Red box: EF-hand conserved region; *: Highly conserved sequences; ∶: Similar sequences. |
为了进一步分析CaM5.3的特异性，有必要了解其空间结构，但在最主要收集已发表的蛋白质结构数据库PDB (https://www.rcsb.org/)中未找到该蛋白的空间结构。因此，利用Alpha Fold Protein Structure Database (https://alphafold.ebi.ac.uk/)进行预测。从图 4可见，预测的CaM5.1的构象与PDB中报道的该蛋白的构象相似，整个蛋白呈哑铃型，其N-端及相邻的2个EF-hand、C-端及相邻的2个EF-hand分别位于哑铃的两“铃”，中央的α-螺旋形成两铃的“柄”；CaM5.3与CaM5.1相比，C-端多出了CTD。推测这个CTD的存在可能影响该蛋白的构象，进而影响与IQM3的结合。
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图 4 CaM5.1 (A)与CaM5.3 (B)的三维结构预测图。pLDDT: 预测的lDDT-Cα值，每个残基的局部置信度，pLDDT越高，置信度越高，pLDDT低表示该区域可能是独立的非结构域。 Fig. 4 Predicted 3D structures of CaM5.1 (A) and CaM5.3 (B). pLDDT: Predicted value of lDDT-Cα, local confidence for each residue, the higher pLDDT the higher confidence, and low pLDDT indicates that the region may be an independent non-domain. |
CML10是一个与CaM家族同源性较高的CML家族成员，其结构与CaM5.3相似，除具有4个EF-hand外，其C-末端也有1个CTD，由45个氨基酸残基组成(图 5)，该序列影响CML10与磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase, PMM)的结合[17]。CML10的CTD与CaM5.3的CTD同源性较低，其可以用于替换CaM5.3的CTD，验证CaM5.3的CTD是阻碍CaM5.3与IQM3在酵母中结合的原因。因此，将CML10的CTD连接到CaM5.1的CDS的C-末端(图 5)，构建pGADT7-CaM5.1-CTDCML10载体, 与IQM3进行酵母双杂交分析(图 6)。
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图 5 CaM5.1、CaM5.3、CML10、CaM5.1-CTDCML10蛋白的基序组成 Fig. 5 Motif composition of CaM5.1, CaM5.3, CML10 and CaM5.1-CTDCML10 |
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图 6 CaM5.1、CaM5.3和CaM5.1-CTDCML10分别与IQM3的酵母双杂交。1: pGBKT7-53/pGADT7-T，阳性对照；2: pGBKT7/pGADT7，阴性对照；3: pGBKT7-IQM3/pGADT-CaM5.1; 4: pGBKT7-IQM3/pGADT-CaM5.3; 5: pGBKT7-IQM3/pGADT-CaM5.1-CTDCML10。 Fig. 6 Yeast two-hybrid of IQM3 with CaM5.1, CaM5.3 and CaM5.1-CTDCML10. 1: pGBKT7-53/pGADT7-T, positive control; 2: pGBKT7/pGADT7, negative control; 3: pGBKT7-IQM3/pGADT-CaM5.1; 4: pGBKT7-IQM3/pGADT-CaM5.3; 5: pGBKT7-IQM3/pGADT-CaM5.1-CTDCML10. |
在SD/-TLHA/X-α-Gal培养基中，阳性对照能正常生长且变蓝色(图 6: 1)，阴性对照pGBKT7分别与pGADT7-CaM5.1/5.3/5.1-CTDCML10的组合均不能形成菌落(未展示)；IQM3仅能在酵母中与CaM5.1发生相互作用(图 6: 3)，不能与CaM5.3 (图 6: 4)和CaM5.1-CTDCML10发生相互作用(图 6: 5)。这表明在CaM5.1的C-端增加CML10的CTD会阻碍所得重组蛋白与IQM3在酵母中的结合，提示CaM5.3不能与IQM3结合的原因与CaM5的CTD有关。
3 讨论和结论本研究表明，拟南芥CaM5的2个不同剪接体CaM5.1和CaM5.3具有不同的生化功能，在酵母中，CaM5.1能与IQM3结合，而CaM5.3不能与IQM3结合。生物信息学分析表明，CaM5.3比CaM5.1多出1个由35个氨基酸残基组成的CTD，可能阻碍CaM5.3与IQM3的结合。在CaM5.1的C-末端接上CML10的CTD干扰了所得重组蛋白与IQM3的结合，证实CaM5.3的CTD阻碍了其与IQM3的结合。可见，拟南芥CaM5的可变剪接方式影响其蛋白结合活性。
当CaM与Ca2+结合，会使CaM中EF-hand的2个α螺旋角度变为垂直，进而引起CaM分子表面特性发生改变，形成易于CaMBP结合的疏水表面和疏水穴[18]。当EF-hand没有与Ca2+结合时，CaM的N-端会维持关闭状态，不能与CaMBP结合；而C-端会在半开和关闭的状态间变化，从而还能与CaMBP结合[19–20]。左娜等[21]归纳总结CaM与CaMBP的相互作用主要是依靠疏水作用力，而非静电作用力。因此，CaM5.3不能与IQM3发生蛋白质间相互作用的主要原因可能是CaM5.3末端CTD在空间结构上阻挡了CaM5.3C-末端结构域的疏水表面或疏水作用力。而IQM3是一个钙不依赖的CaMBP[15], 因此推测，在没有Ca2+的情况下，CaM5.3的N-末端结构域维持关闭状态，C-末端的CTD阻挡了IQM3与CaM5.3的结合。CaM5.3的CTD改变了CaM5.3的靶蛋白的种类，使CaM5.3具有不同于常规CaM的生物功能。
尽管本研究从生化水平上揭示了CaM5.1和CaM5.3这2种剪接体具有不同的蛋白结合活性, 但是CaM5基因的可变剪接的生物学功能未知，进一步研究可聚焦于CaM5.1和CaM5.3在植物体内的时空表达、细胞定位以及与CaM5.1和CaM5.3特异结合蛋白及其信号通路的分析。
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