木兰科(Magnoliaceae)植物具有很高的观赏及药用价值，但由于人类过度开发利用所导致的生境退化和丧失，以及木兰科植物自身繁殖能力下降, 濒危物种日渐增多。对濒危植物的保护不能仅局限于自然保护区的就地保护，20世纪70年代，世界自然保护联盟(IUCN)开始鼓励对濒危植物进行迁地保护。迁地保护是防止物种灭绝不可或缺的辅助手段，为野外物种灭绝事件提供了重要备份^[1]。迁地保护一方面可以降低物种灭绝的风险, 另一方面也为保护生物学的基础研究、科普教育和种群回归、引种和生境修复提供材料^[2–3]。

木兰科植物濒危外因的研究主要包括群落特征、生境破坏等，内因研究则主要关注开花、传粉、大小孢子发育、结实等繁殖生物学内容^[4]。含笑属(Michelia)植物传粉生物学方面的系统研究较少，野外种群的石碌含笑(M. shiluensis)和深山含笑(M. maudiae)的传粉者都较单一^[5–6]。

石碌含笑可作为观赏树种用于城市绿化美化、生态环境改善，拥有较强固碳能力^[7]，却因人为干扰和破坏，野生数量日渐稀少，是国家Ⅱ级重点保护野生植物^[8]，IUCN将其列为濒危物种^[9]。虽然石碌含笑的种群数量稀少，地理分布区域狭窄，生境破碎化严重，种群间空间距离较远，基因流受限, 物种的进化潜力受到很大影响^[6]，但其遗传多样性高、分化程度低，因此石碌含笑的数量下降可能是人为干扰而非近亲繁殖或遗传漂变^[9]。石碌含笑的叶片和枝条富含精油^[7]，可分离出16个倍半萜类化合物^[9]。此外，石碌含笑的叶片解剖特征、生长特性、组织培养方法也有研究^[10–13]。

本研究开展迁地保护下石碌含笑的开花生物学及繁殖特性研究，了解该物种的有性生殖过程, 从生殖生物学角度探索其可能存在的濒危原因。

1 材料和方法 1.1 材料与研究地点

石碌含笑为木兰科含笑属常绿乔木，是中国特有的珍稀濒危物种，零散分布于海南吊罗山，鹦哥岭、南高岭、保梅岭和五指山等地^[14]。本研究于2022年2月—11月在海南省儋州市天香木兰园(海南大学木兰学院，19.49° N，109.68° E；海拔132~148 m)，选取圃地仅有的2株(1号和2号)开花植株进行, 树龄均超20 a，生长良好。

试验期间儋州市区域降雨量1148 mm，平均气温25.29 ℃，平均湿度83.05%，儋州市年均气温差较小，且夏季多发强对流雨，属于典型热带海岛季风气候。

1.2 方法

开花物候及开花动态的观察   2022年4月至11月对圃地栽培的石碌含笑1号植株的花期、果期进行观测与记录。因石碌含笑开花持续时间较长(约1.5个月)，以整株1%的花朵开放记为始花期, 约10%的花朵开放记为盛花期，约90%的花朵凋谢记为末花期。根据花期花蕾发育、花被片和雄蕊形态的变化，将幼蕾至幼果细分为12个阶段，其中Ⅰ~Ⅳ为蕾期、Ⅴ为花蕾露色期、Ⅵ~Ⅶ为花初开期、Ⅷ~Ⅸ为花盛开期、Ⅹ为花末期、Ⅺ~Ⅻ为幼果期。测量石碌含笑各时期花被片、雄蕊群、雌蕊群的直径及高度，每时期5朵，取平均值，重复3次。

花粉活性测定   选用经预实验筛选，萌发率最稳定的培养基(蔗糖100 g/L+硼酸200 mg/L+ CaCl₂ 400 mg/L)，在温度25 ℃、湿度90%的人工气候箱中暗培养6 h后，显微镜下计算萌发率。采集石碌含笑不同时期花朵各10朵，及时带回实验室。取下花药，平摊于干燥器内的硫酸纸上遮阴干燥。待花药开裂散出花粉，去除花药收集花粉，用硫酸纸分装干燥密封，置于冰箱备用。以花粉管长度长于花粉直径1倍以上视为萌发。于40×显微镜下随机选取3个视野进行观察，每个视野花粉数不低于30粒，每个时期重复测量3次。萌发率(%)=萌发花粉数/总花粉数×100%。

石蜡切片制作   采集花蕾后用FAA溶液固定, 脱水包埋后莱卡RM 2016切片机切片，番红-固绿染色，封片后Nikon Eclipse E100光学显微镜下观察, Nikon DS-US成像系统扫描后于Case Viewer软件挑选视野。

MTT染色  取少许花粉于载玻片上，加1滴噻唑蓝(MTT)染液，用牙签轻轻搅拌均匀，静置30 min后显微镜下观察花粉形态。

柱头可授性测定   选取Ⅱ~Ⅻ期的柱头各3枚，浸入含有联苯胺-过氧化氢反应液的凹面载玻片中，置于光学显微镜低倍镜下观察其可授性。反应液颜色和气泡形成是判断柱头可授性的重要指标，柱头与反应液反应一段时间后，若柱头周围的反应液呈现蓝色并伴有气泡形成，说明其具可授性^[15]。若呈现蓝色并伴有大量气泡形成，说明柱头具有极强可授性, 以+++表示；若变色较为明显或者有大量气泡产生，说明柱头具有较强的可授性, 用++表示；若轻微变色或有少量气泡产生，说明柱头具有可授性，用+表示；若没有变蓝或者无气泡产生时，说明柱头不具有可授性，用-表示。

繁育系统测定   人工授粉试验主要在天香木兰园1号植株进行。对不同时期的花蕾进行去雄、人工授粉，硫酸纸套袋，6个月后统计座果率和结籽率。(1) 同株异花授粉：取1号植株不同时期的花粉，授于同株不同时期的柱头，处理38朵；(2) 同株同花授粉：取出Ⅴ和Ⅵ期花蕾的花药，硅胶快速干燥后收集花粉，人工授粉于同朵花柱头上，套袋，处理15朵；(3) 异株异花授粉：采集海南圃地2号植株和中国科学院华南植物园(23.10° N，113.21° E；海拔24~130 m) 3号植株的花粉，对1号植株Ⅴ、Ⅵ期的柱头进行人工授粉，各处理10朵；(4) 自然结实：随机选择健康花蕾挂牌，不作任何处理, 仅统计结实情况，观察500朵；(5) 无融合生殖：人工去除雄蕊，保留雌蕊，套袋，处理10朵；(6) 属内种间授粉：采集陕西省西安植物园(34.21° N, 109.03° E)结实正常的红花深山含笑(M. maudiae var. rubicunda)、阔瓣含笑(M. cavaleriei var. platypetala)、黄心夜合(M. martini)花粉和海南天香木兰园的紫花含笑、诗琳通含笑(M. sirindhorniae)花粉，授于1号植株Ⅵ时期的柱头，套袋，每处理10朵。测量5朵完全开放的花朵直径，取平均值，重复3次, 结合开花行为，按照Dafni^[15]标准进行繁育系统评判。

1.3 数据分析

数据均用Excel 2010进行整理，使用SPSS 26.0软件进行数据分析，使用Adobe Photoshop 2021软件处理图片。采用单因素方差分析法对花被片、雄蕊群、雌蕊群的直径和高度、花粉离体萌发率进行分析，统计数据均用平均值±标准误表示。

2 结果和分析 2.1 开花物候及开花动态观察

花器官的形态特征 从图 1可见，石碌含笑花具佛焰苞3~5枚，外2~4枚具白色平伏柔毛, 最后1枚佛焰苞绿色革质，无毛。花被片肉质，白色, 8~10枚，3轮，倒卵圆形，长3.0~4.5 cm，宽1.5~2.5 cm; 雄蕊98~102枚，长2.0~2.5 cm，花丝紫红色，花药乳黄色，侧向开裂；雌蕊群黄绿色，长1.4~2.1 cm，心皮39~47个，卵圆形，长2.5~4.0 mm, 每心皮胚珠8个；盛开时，雌蕊群平均高出雄蕊16.1 mm。

开花动态和花蕾分期   海南天香木兰园栽培的石碌含笑2月初现蕾，4月中旬初花，4月底盛花，5月中旬末花，单花开放时间持续3~4 d (图 2)。花蕾期(Ⅰ~Ⅳ阶段)，被3~5枚佛焰苞包被, 呈绿色扁球形；Ⅴ阶段最后一枚佛焰苞开始裂开，露出白色肉质花被片，此时花被片腹面开始分泌粘液，雌蕊群尚被花被片完全包被。将最后一枚佛焰苞脱落(Ⅵ时期)记为0 h，花被片高度自此显著降低；4 h进入Ⅶ时期，雌蕊群伸出花被片，花药开裂，散出花粉，花被片展开至最大开花直径的50%，花被片直径显著高于Ⅳ、Ⅴ时期，呈圆球形；6 h进入Ⅷ时期，此时雄蕊松散，雌蕊群不再伸长; 16 h进入Ⅸ时期，花被片继续张开，呈扁球形, 此时雌蕊群完全伸出花被片，雌蕊伸长速度减慢；Ⅹ时期雄蕊开始褐化、柱头变黑色，雄蕊群直径显著减小, 花径至最大；72~96 h进入Ⅺ时期，花被片脱落；Ⅻ时期仅剩雌蕊群(幼果)留于枝头(表 1，图 3)。

访花昆虫   迁地到海南圃地的石碌含笑在花期仅观察到2种访花昆虫(图 4: A, B): 西方蜜蜂(Apis mellifera)和隧蜂(Halictus sp.)，其中西方蜜蜂约占访花者总数的95%，隧蜂占5%。野外观察到石碌含笑的访花昆虫主要为金龟总科(Scarabaeoidea)的甲虫，如鳃金龟(Melolonthidae)等(图 4: C, D)。访花昆虫由花被片间的空隙或雌蕊与花被片间的空隙进入花腔内取食花粉，取食结束再钻出飞走。访花者多出现在Ⅵ~Ⅷ期花上，早上6:00—10:00访花者数量逐渐增多，10:00后减少，12:00—15:00略增，15:00后逐渐减少，至18:00后未观察到蜂类访花。

2.2 花粉活性

离体萌发结果表明，开花前的Ⅲ~Ⅴ期，花粉萌发率保持在45.26%~56.28%，Ⅵ期达最高，为66.96%，Ⅶ期花粉活力迅速下降，仅为Ⅵ期的一半。

花药石蜡切片结果表明，Ⅱ期已形成小孢子, Ⅲ~Ⅳ期约有50%的花粉发育完全，Ⅴ~Ⅵ期花粉粒已完全发育成熟，是收集花粉的最佳时期(图 5)。

Ⅱ~Ⅲ期的花药经硅胶干燥，小孢子可快速发育为成熟花粉，在离体培养时萌发。

2.3 柱头可授性

采用联苯胺-过氧化氢反应检测柱头的可授性。Ⅱ~Ⅲ期的柱头紧贴雌蕊群，有少量气泡产生，柱头颜色变化不明显，表明柱头无可授性；Ⅳ~Ⅴ期个别柱头开始外卷，有较多气泡产生，柱头颜色变为浅蓝色，表明柱头开始具备可授性；Ⅵ期柱头外卷幅度增大，分泌大量粘液，气泡丰富、颜色加深；Ⅶ期气泡快速且密集，柱头颜色为蓝紫色，表明Ⅵ、Ⅶ期柱头可授性最强；Ⅷ时期气泡多但颜色变淡，说明此时柱头可授性降低；Ⅸ~Ⅻ期柱头不再分泌粘液，气泡逐渐减少且柱头无明显颜色变化，表明柱头已无可授性(表 2)。人工授粉结果表明，Ⅵ期柱头结籽率为22.93%，高于Ⅴ期，说明Ⅵ期是柱头最佳可授期(表 3)。

石碌含笑柱头可授性最强的阶段为柱头刚伸出花被片到被片展开为最大花径50%的Ⅵ、Ⅶ时期，此时柱头上肉眼可见湿粘的分泌物。粘液不仅让花粉更易粘在柱头上，还可给花粉提供萌发所需的养分和环境，这一现象与多数木兰科植物一致。蕾期和花被片展开至最大直径之后柱头无黏液，可授性均较弱。因此，授粉前可根据柱头粘液分泌的情况快速辨别柱头是否有活性，增加人工授粉的成功率。王亚玲^[16]的研究也证实了这一观点。

2.4 繁育系统确定

统计了同株同花、同株异花、异株异花、种间异花、自然结实和孤雌生殖授粉座果情况。同株同花、同株异花和自花授粉座果率均为0。而在异株异花授粉中，1号树Ⅴ、Ⅵ期与2号树座果率达到100%，但1号与3号树座果率为0，推测这2株树均为来自同一母本的嫁接个体。1号树Ⅵ期结籽率为22.93%，高于Ⅻ期(9.44%)。在属内种间授粉中，石碌含笑Ⅻ期(♀)与诗琳通含笑(♂)杂交座果率为10%，自然座果率为1.6%，与其他含笑属种类杂交均无结实(表 3)。这表明石碌含笑不存在无融合生殖，异株异花授粉亲和，同花授粉和同株异花授粉不亲和，与含笑属其他种类有生殖隔离。

石碌含笑花平均直径为3.3~4.5 cm；柱头位置均高于雄蕊群，二者在空间位置上明显分离；柱头在花开前即具可授性，但柱头可授期与花粉散出时间有重合。根据Dafni^[15]的划分标准，石碌含笑杂交指数(OCI)为4，繁育系统为部分自交亲和、异交、需要传粉者。Dafni^[15]法计算的繁育系统结果与人工授粉结果不完全一致，OCI显示部分自交亲和，但人工授粉表明石碌含笑自交完全不亲和。

3 讨论和结论 3.1 石碌含笑开花时花器官的动态

木兰科多数植物开花时，花被片的运动仅表现为向外展开和闭合，如紫花含笑、华盖木(Pachylarnax sinica)、广玉兰(Magnolia grandiflora)^[17–18]。本研究结果表明石碌含笑花被片和雌蕊群的运动轨迹较多数木兰科植物更为复杂。石碌含笑花药开裂散粉的同时，花被片和花型均发生不同程度的变化。首先是花被片中部开始向外凸起，上缘降低，但始终罩着雄蕊群使其不露出花外；雌蕊群同时伸长，最终完全探出花被片外。石碌含笑花被片隆起降低上缘高度结合雌蕊群伸长的运动，最终实现雌蕊群完全伸出花被片外。花型由椭圆形变为圆球形，最终呈扁球形，花内空间逐渐增大，利于雄蕊群展开散粉，给传粉昆虫提供充足的取食、交配等活动所需的空间。石碌含笑花期恰逢海南雨季，花被片始终包被雄蕊群，有效避免自花传粉的同时，还可以防止雨水冲刷花粉，吸引昆虫在球形花冠内停留更长时间，与Barret等^[19]、阮成江等^[20]和Gottsberger^[21]的研究结果一致。

3.2 木兰科的生殖隔离

为避免近交衰退，植物发展了诸如雌雄异熟、雌雄异位、镜像花柱、异长花柱、自交不亲和等多种促进异交的形态和生理机制^[22]。木兰科植物的主要生殖隔离方式为雌雄异位、雌雄异熟等时空隔离，如落叶木莲(Manglietia decidua)^[23]、广玉兰^[17]、红花山玉兰(Lirianthe delavayi)^[24]等，柱头空间位置高于雄蕊，且柱头早于花粉成熟。花药和柱头空间距离的增加亦可降低花粉落在自身柱头上的概率, 减少自交发生的比例。

自交不亲和在有花植物中是常见的阻止自交、促进异交的机制^[22]，但木兰科植物具备自交不亲和这一生理隔离机制的种类只占极少数。多数木兰科种类生理隔离机制尚不完备，同花或同株异花间授粉或多或少能结实^{[17, 25–27]}。落叶木莲同花自交不亲和，同株异花却有较高结实率^[22]。但石碌含笑这种同株同花和同株异花授粉均完全不能结实的严格生理隔离，木兰科中未见报道。

木兰科多数种类不仅属内种间杂交完全亲和^[27], 如台湾含笑×深山含笑、台湾含笑×阔瓣含笑^[28]、云南含笑(M. yunnanensis)×灰岩含笑(M. calcicola)^[29]等，近缘属间杂交也容易成功，如紫玉兰(Yulania liliiflora)×金叶含笑、紫玉兰×云南含笑^[27]。本次人工杂交试验中，石碌含笑仅与同期开花的诗琳通含笑有1.5%的结籽率且萌发的杂交幼苗生长力弱，与同属其他几种杂交均不能结实，存在明显的生理隔离。

由于石碌含笑柱头的可授期和花粉的散粉期有长达12 h的重叠，活性均在Ⅵ期达到最佳，所以其生殖隔离完全依赖空间隔离(雌雄异位)和生理隔离(自交不亲和)，表现为完全异交授粉类型。石碌含笑依赖严格的自交不亲和的生理隔离机制，有效避免了自交的发生。

3.3 木兰科植物开花动态与主要传粉昆虫的协同作用

木兰科主要有2类传粉昆虫，一类是体型较小的甲虫，另一类是蜂类。由甲虫传粉的木兰科植物常雌蕊先熟，甲虫通过咬食鲜美多汁的花被片，于花开放前进入花内，在柱头和雄蕊群间进行取食或交配等活动，帮助木兰科植物授粉。如卵叶木兰(Magnolia ovata)的访花昆虫为金龟总科^[21]，西畴含笑(M. coriacea)的传粉昆虫为叶甲科(Chrysomelidae)^[30]。由蜂类传粉的种类在花被片开放花粉散出后，柱头仍具活性，蜂类可以携带花粉顺利访问雌蕊完成授粉，如火力楠(M. macclurei)等^[32]。

木兰科植物并非只吸引其中一类传粉昆虫，许多种类可以同时被2类昆虫传粉，如紫花含笑^[18]。野外观察到石碌含笑的传粉昆虫只有1种鞘翅目鳃金龟科甲虫，迁地保护条件下观察到的石碌含笑传粉昆虫主要为蜂类，石碌含笑柱头和花粉同时进入最佳可授期，柱头显著高于雄蕊，更适合蜂类传粉。

3.4 石碌含笑的濒危原因及迁地保护的意义

石碌含笑野外以吊罗山种群保护最好，以相对集中的小群落分布，林下可见幼龄种苗^[14]。据本课题组未发表的野外调查结果, 吊罗山现存石碌含笑仅296株。在其他分布地，如鹦哥岭、南高岭、保梅岭、五指山等地仅有5~7株散生单株，且主要以中树(7.5 cm≤胸径≤22.5 cm)和成年大树(胸径≥22.5 cm)为主，林下罕见自然更新的种苗^[14]。

森林砍伐造成的石碌含笑种群个体急剧下降, 散生木、孤立木增多，加之石碌含笑同花及同株异花授粉不能结实，植株间距离若超过传粉昆虫的活动范围，势必造成无效授粉而无法结实，最终导致林下更新失败，这是石碌含笑濒危的重要原因。因此，对于石碌含笑的保护，尤其是野外个体少的居群，可通过人工辅助异株授粉，增加结实，或将迁地保护的人工繁殖个体回归野外，维持有效种群规模，促进林下自然更新。

本研究通过对石碌含笑的开花生物学特性、繁育系统及迁地环境中传粉过程的研究有利于制定合理有效的迁地保护策略，对木兰科其他濒危植物的迁地保护具有借鉴意义和参考价值。

致谢 海南大学林学院罗西、许丽丽、陈英转、陈仕铭同学在人工授粉过程中提供支持, 冯雪萍、张哲老师给予技术指导和论文润色，一并感谢。