2024, Vol. 32
2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室, 海南热带农业资源研究院海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室, 海口 571101
2. Key Laboratory of Natural Products Research and Development of Li Folk Medicine of Hainan Province Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences & Key Laboratory for Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Hainan Province, Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Haikou 571101, China
金钗石斛(Dendrobium nobile)是兰科(Orchidaceae)石斛属植物，具有较高的药用价值和观赏价值，是我国传统中药材，有着“千金草”的美誉。石斛属植物在我国药用历史悠久，最早记录于《神农本草经》之中，与灵芝等同属于珍贵中药材。金钗石斛是石斛中主流药用品种之一，生长于海拔480~1 700 m山地疏林中的树干和沟谷岩壁之上，在我国主要分布于贵州、海南、云南等地[1]。《中国药典》中记录金钗石斛具有益胃、清热的功效。现代药理研究表明金钗石斛具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖等活性[2–4]。金钗石斛所含化学成分多样，主要有生物碱、倍半萜、联苄和多糖等[5]。本研究组前期对金钗石斛乙醇提取物乙酸乙酯部分进行了化学成分研究，分离得到倍半萜、生物碱、芴酮、木质素等类型的化合物[6–8]。为进一步研究金钗石斛的化学成分，本研究对金钗石斛乙醇提取物正丁醇部分进行分离，共得到3个化合物，并通过波谱技术进行结构鉴定, 同时对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制活性测试。
1 材料和方法 1.1 材料试验样品于2018年4月采于海南省海口市石山镇，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所黄圣卓博士鉴定为兰科石斛属金钗石斛(Dendrobium nobile)，凭证标本(HUANG00021)存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。
1.2 仪器与试剂安捷伦1260分析型高效液相色谱仪(美国Agi- lent公司)；安捷伦1260半制备型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Bruker AV-500型超导核磁仪(德国Bruker公司)；质谱仪(Bruker amazon SL公司); 旋光仪MCP 5100 (奥地利Anton Paar有限公司); CA- 1111冷却水循环装置(上海爱朗仪器有限公司); BSA- 100A自动部分收集器(上海青浦沪西仪器厂); 旋转蒸发仪(德国Heidolph Laborota公司)；METT-LER TOLEDO ME204精密和分析天平[万分之一，梅特勒-托力多仪器(上海)公司]；柱层析硅胶G (H, 200~ 300目, 60~80目, 青岛海洋化工厂)；凝胶Sephadex LH-20 (德国Merck公司)，ELX-800酶标仪(美国Bio- Tek公司)。实验所用常规试剂均为分析纯。
1.3 提取与分离金钗石斛干燥茎(13.0 kg)粉碎后用乙醇浸提3次，提取液经浓缩后与水1׃1制成悬浊液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压浓缩后得到相应萃取物。将正丁醇萃取物(126.5 g)经硅胶减压柱色谱，以氯仿-甲醇[100׃1→0׃1，V/V (下同)]混合溶剂进行梯度洗脱，经薄层层析(TLC)检测, 合并后得到16个流份(Fr.1~Fr.16)。选取Fr.3 (24.7 g)流份用ODS反相柱，甲醇׃水(10׃90→100׃0)进行梯度洗脱，得到15个流份(Fr.3.1~Fr.3.15)；Fr.3.3 (4.0 g)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇为流动相)洗脱后得到6个流份(Fr.3.3.1~Fr.3.3.6)；Fr.3.3.2 (67.9 mg)经硅胶柱色谱(氯仿׃甲醇=25׃1→15׃1)梯度洗脱得到化合物2 (8.2 mg)以及3个流份(Fr.3.3.6.1~Fr.3.3.6.3); Fr.3.3.6.2 (15.6 mg)经半制备HPLC (C18柱，15%甲醇-水为流动相，流速4 mL/min，检测波长为210 nm)纯化得到化合物1 (1.8 mg，tR=14.1 min)。Fr.1 (7.5 g)经ODS反相柱色谱，以甲醇׃水(10׃90→100׃0)进行梯度洗脱，得到12个流份(Fr.1.1~Fr.1.12)；Fr.1.8 (321.9 mg)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇为流动相)洗脱后得到4个流份(Fr.1.8.1~Fr.1.8.4)；Fr.1.8.2 (133.2 mg)经硅胶柱色谱(氯仿׃甲醇=30׃1→5׃1)梯度洗脱得到化合物3 (2.0 mg)。化合物1~3的结构见图 1。
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图 1 化合物1~3的结构 Fig. 1 Structures of compounds 1-3 |
α-葡萄糖苷酶抑制活性 采用PNPG法测定[9]。取100 μL溶于磷酸缓冲溶液(PBS, pH=6.8, 0.1 mol/L)的0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液与10 μL溶于DMSO的待测样品溶液混合摇匀后转移至96孔板中，以金雀异黄酮为阳性对照，阴性与空白组用等体积的DMSO代替待测样品。将96孔板于37 ℃下放置15 min后，待测组加入40 μL PNPG溶液，空白组加入40 μL PBS溶液，于37 ℃下放置15 min后于405 nm处测定吸光度值，计算抑制率。
酪氨酸酶抑制活性 将130 μL溶于磷酸缓冲溶液(PBS, pH=6.8, 0.1 mol/L)的酪氨酸酶溶液(50 U/mL)与20 μL溶于DMSO中的待测样品混合摇匀后转移至96孔板中，以曲酸为阳性对照，阴性与空白组用等体积的DMSO代替待测样品。将96孔板于37 ℃下放置5 min后，待测组加入50 μL酪氨酸溶液，空白组加入50 μL PBS溶液，于37 ℃下放置20 min后于475 nm处测定吸光度值，计算抑制率[10]。
神经保护活性 采用MTT法检测化合物1对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y抗H2O2诱导的氧化应激的保护作用[11]。SH-SY5Y细胞(1.2×104 cells/mL)在37 ℃ 5% CO2条件下，于96孔板中(每孔100 μL), 培养24 h后每孔加入1 μL 100 μmol/L样品液, 以维生素E为阳性对照，阴性对照组加入同等体积的DMSO。培养3 h后加入50 μL 1 000 μmol/L H2O2，正常组加入同等体积的培养基。经8~12 h后加入20 μL MTT，培养4 h后去除上清液，加入100 μL DMSO，振荡摇匀。用酶标仪测定每孔490 nm处的吸光度，以正常组细胞存活率为100%，计算试验组细胞存活率，以%表示。
2 结果和分析 2.1 结构鉴定化合物1 黄色油状，溶于甲醇。[α]25 D+9.0 (c = 0.10, MeOH)。HR-ESI-MS在m/z: 305.136 0给出[M + Na]+峰(计算值为305.135 9)，结合碳谱和氢谱数据(表 1)推测其分子式为C15H22O5。其1H NMR谱图显示出一系列脂肪氢信号，其中包括2个甲基信号[δH 1.54 (3H, s, H-10), 1.02 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-14)], 3个连氧次甲基信号[δH 4.06 (1H, d, J = 3.7 Hz, H-2), 4.69 (1H, dd, J = 5.5, 3.7 Hz, H-3), 5.29 (1H, d, J = 2.9 Hz, H-11)]和1个连氧亚甲基信号[δH 3.52 (1H, dd, J = 11.0, 5.3 Hz, H-13a), 3.43 (1H, dd, J = 11.0, 5.3 Hz, H-13b)]。化合物1的13C-NMR和DEPT谱显示有15个碳信号，包括2个季碳信号[δc 181.2 (C-15), 52.2 (C-1)]，8个次甲基碳信号含3个连氧碳信号[δc 83.8 (C-2), 81.9 (C-3), 48.4 (C-4), 44.8 (C-5), 44.6 (C-6), 64.9 (C-9), 105.8 (C-11), 33.2 (C-12)]，3个亚甲基碳信号包含1个连氧碳信号[δc 33.0 (C-7), 29.4 (C-8), 66.4 (C-13)]以及2个甲基碳信号[δc 32.4 (C-10), 15.2 (C-14)]。根据以上信号可以推测该化合物是一个与已知化合物dendronobilin C[12]结构相似的木防己毒烷型倍半萜[13]，区别仅在于化合物1中少了1个连氧季碳，多了1个次甲基信号[δc 64.9/δH 2.25 (1H, m, H-9)]。根据1H-1H COSY谱中H-9与H-8和H-11有相关信号，HMBC谱中H-9与C-6和C-10有相关信号可以确定化合物1的9位没有羟基。另外，通过1H-1H COSY中谱的相关信号H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H2-7/H2-8/H-9/H-11和H-4/ H-12/H2-13 (H3-14)，以及HMBC谱中H-10与C-1、C-2、C-6和C-9有相关信号，H-11与C-1、C-2和C-8有相关信号，H-14与C-4、C-12和C-13有相关信号, H-3与C-1和C-5有相关信号，H-5与C-15有相关信号可以确定其平面结构如图 2所示。ROESY谱中显示相关信号H-11/H3-10/H-2、H-2/H-14/H-3、H-5/H2-13、H-9/H3-10/H-6，说明H-2、H-3、H-5、H-6、H-9、H3-10和H-11位于分子所在环系平面同侧，而H-4位于另一侧。通过以上数据确定化合物的相对构型(图 1)，命名为2, 11-epoxy-11, 13-dihy- droxypicrotoxano-3(15)-lactone。
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表 1 化合物1的1H (500 MHz)和13C-NMR (125 MHz) 波谱数据(CD3OD) Table 1 1H (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) spectral data of compound 1 (CD3OD) |
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图 2 化合物1的HMBC、1H-1H COSY和ROESY关键相关信号 Fig. 2 The key HMBC, 1H-1H COSY and ROESY correlations of compound 1 |
化合物2 白色粉末，HR-ESI-MS m/z: 369.114 0 [M + Na]+，分子量为346，分子式为C15H22O9。1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 6.49 (2H, s, H-3, 5), 4.81 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-1′), 3.92 (1H, m, H-2′), 3.81 (6H, s, H-7, 8), 3.70 (3H, s, H-9), 3.65 (1H, dd, J = 12.0, 6.7 Hz, H-4′), 3.44 (3H, m, H-3′, 5′, 6′a), 3.33 (1H, d, J = 12.8 Hz, H-6′b); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): δC156.0 (C-4), 154.8 (C-2, 6), 134.5 (C-1), 103.2 (C-1′), 96.2 (C-3, 5), 78.4 (C-5′), 78.1 (C-3′), 75.0 (C-2′), 71.7 (C-4′), 62.7 (C-6′), 61.2 (C-9), 56.6 (C-7, 8)。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定为2, 4, 6-三甲氧基苯-1-O-β-d-葡萄糖苷。
化合物3 黄色油状，HR-ESI-MS m/z: 273.130 8 [M + Na]+，分子量为250，分子式为C11H22O6。1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 4. 23 (1H, d, J = 7. 7 Hz, H-1′), 3.94 (1H, td, J = 8.1, 5.9 Hz, H- 1a), 3.85 (1H, d, J = 11.8 Hz, H-6′a), 3.65 (1H, dd, J = 12.0, 4.8 Hz, H-6′b), 3.55 (1H, td, J = 8.7, 6.6 Hz, H-1b), 3.23~3.35 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 3.14 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′), 1.73 (1H, m, H-3), 1.50 (1H, q, J = 7.0 Hz, H-2), 0.91 (6H, dd, J = 6.8, 1.9 Hz, H-4, 5); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): δC 104. 4 (C-1′), 78.2 (C-3′), 78.0 (C-5′), 75.1 (C-2′), 71.7 (C-4′), 69.3 (C-1), 62.8 (C-6′), 39.7 (C-2), 26.1 (C-3), 23.0 (C-4, 5)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定为3-methylbutan-1-ol β-d- glucopyranoside。
2.2 活性测试对3个化合物进行α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制活性测试，同时对化合物1进行神经保护活性测试。结果表明在100 μmol/L浓度下，3个化合物均未检测到相应活性。
金钗石斛作为石斛属中的重要药用植物之一，其化学成分一直以来是研究者关注的热点。由于其具有药用价值高、毒性低的特点，目前已在医疗、保健等领域广泛使用。本研究对金钗石斛茎乙醇提取物正丁醇萃取部分进行了化学成分分离，得到了3个化合物，分别为2, 11-epoxy-11, 13-dihy- droxypicrotoxano-3(15)-lactone (1)、2, 4, 6-三甲氧基苯-1-O-β-d-葡萄糖苷(2)和3-methylbutan-1-ol β-d- glucopyranoside (3)，其中化合物1为一个新的木防己毒烷型倍半萜，丰富了其化学成分。截至目前，从金钗石斛中分离的倍半萜有40多个，主要分为4个类型，包括木防己毒烷型、allo-aroma-dendrane型、cyclocopacamphane型和copacamphane型，其中木防己毒烷型数量最多[5]。本研究组前期分离到与化合物1结构类似的倍半萜，区别仅在于已知化合物的11号位为羰基且13号位无羟基取代，经测试其具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性[6]，但本次化合物1并未筛选出相关活性，推测可能与两者结构差异有关。
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