2023, Vol. 31
植物生长发育过程中往往面临各种生物和非生物胁迫，并在长期进化过程中形成了复杂的自我防御反应调控网络。WRKY是一类植物特异的转录因子，广泛参与植物生长发育代谢、生物和非生物胁迫(温度、干旱等)调控[1–4]。研究表明，WRKY家族成员的典型特征是含有1或2个由约60个氨基酸构成的高度保守WRKY结构域，其5′端包含保守的WRKYGQK基序(极少数突变为WRKYGKK、WRKYGMK、WRKYGEK等)，3′端则含有1个保守的锌指结构基序，可以特异结合下游靶基因启动子核心序列中的W-box顺式元件，激活或抑制下游基因的表达，并对生物和非生物胁迫反应，改变植株的耐逆性[5–6]。根据WRKY的结构数目和特点, WRKY转录因子可分为3类，第一类(Ⅰ)含有2个WRKY保守结构域，锌指结构为C2H2型；第二类(Ⅱ)含有1个WRKY结构域，锌指结构均为C2H2型, 又可细分为5个亚类(Ⅱa~Ⅱe)；第三类(Ⅲ)含有1个WRKY结构域，锌指结构为C2HC型[7–8]。目前, 从植物中分离到的WRKY类转录因子大多都定位于细胞核中，且大部分WRKY含有核定位信号保守基序[9]。
近年来，西葫芦(Cucurbita pepo)的栽培面积仅次于黄瓜(Cucumis sativus)，己经成为农民增收、农业产业结构调整的重要栽培作物。西葫芦易受低温、干旱等非生物胁迫影响，造成落花落果、果实畸形以及多种病害等生理障碍，导致产量与品质严重下降[10–11]。据PlantTFDB v5.0统计，目前已分离出约94个拟南芥、125个马铃薯(Solanum tuberosum)、109个水稻(Oryza sativa subsp. indica)、69个辣椒(Capsicum annuum)和88个黄瓜WRKY转录因子。植物通过信号传导并产生一系列应答基因表达产物，以减少胁迫产生的伤害和增加耐受性，WRKY蛋白起着重要的调控作用。WRKY对逆境胁迫反应主要依赖于脱落酸(ABA)[12]、水杨酸(SA)[13–14]、茉莉酸(MeJA)[15]和乙烯利(ETH)[16]等激素信号转导途径，WRKY能够直接与自身或下游基因启动子中的W-box结合，正向或负向调控下游靶基因的表达, 形成复杂的信号调控网络，从而增强或降低植物对环境的耐受能力[17–18]。玉米(Zea mays)的ZmWRKY79通过激活下游靶基因ZmAAO3的表达并增加ABA激素合成来提高耐旱能力[19]；在黄瓜的CsWRKY46通过介导ABA激素响应积极参与低温胁迫反应防御[20]; 番茄(Lycopersicon esculentum)中20个SlWRKYs基因通过结合下游基因或与其他转录因子形成的复合体参与ICE-CBF-COR低温调控途径[21]；密罗木(Myrothamnus flabellifolia)中MfWRKY17的过量表达可以调控ABA响应基因(靶基因MfNECD3和MfRAB18), 以提高转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株的耐盐和抗旱性[22]；狗牙根(Cynodon dactylon)的CdWRKY2基因受低温诱导显著上调表达，并提高转基因植株的抗寒性, CdWRKY2能特异地结合到CdSPS1和CBF2启动子的W-box元件并激活其表达，协调介导蔗糖的合成和CBF信号通路，调控植物的抗寒性[23]。目前，除本研究团队2020年报道了2个WRKY基因外，还鲜见西葫芦其他WRKY基因的克隆和功能分析研究。
前期田间育种过程中发现西葫芦‘福美6号’容易受低温、干旱等逆境胁迫影响，引起产量和品质的下降。本研究以‘福美6号’为材料，采用转录组测序技术从叶片中克隆获得CpWRKY2基因，对基因结构、编码蛋白的生物信息学及其表达模式进行了分析，探讨CpWRKY2在西葫芦非生物胁迫响应过程中的调控作用，为开展西葫芦优良品种的选育以及非生物胁迫防御反应的分子机理研究提供科学依据。
1 材料和方法 1.1 材料试验材料西葫芦‘福美6号’ (Cucurbita pepo ‘Fumei 6’)由福建省蔬菜遗传育种重点实验室福清东张基地(119.18° E，25.69° N)保存[10]。植物DNA提取试剂盒FastPure® Plant DNA Isolation Mini Kit、DNA Marker (DL 2000)、植物RNA提取试剂盒Fast-Pure® Plant total RNA Isolation Kit、RNA逆转录试剂盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA、限制性内切酶Sac Ⅰ和BamH Ⅰ购于TaKaRa公司，基因扩增试剂盒Phanta Max Master Mix、荧光定量试剂盒ChangesQTM Universal SYBR qPCR Master Mix、DL2000 plus DNA Marker、质粒抽提试剂盒FastPure® Plasmid Mini Kit、DNA产物纯化试剂盒FastPure® Gel DNA Extraction Mini Kit、同源重组试剂盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit、DNA快速克隆试剂盒TA/Blunt-Zero Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，瞬时表达载体PC1300S-GFP由本实验室保存，大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101菌株均购自上海唯地生物技术有限公司，其他生化试剂均为国产分析纯级。
1.2 WRKY基因及其上游启动子扩增参考植物DNA试剂盒说明书提取西葫芦样品的DNA，根据西葫芦全基因组数据库和前期转录组测序库中搜索到的CpWRKY2基因信息，设计基因启动子和全长克隆引物(表 1)，PCR扩增产物经1.0%琼脂糖电泳、纯化、回收后，与PCE2 TA/Blunt-Zero载体进行连接、转化大肠杆菌DH5α，PCR检测后的阳性单克隆菌液送至福州尚亚生物科技有限公司进行测序验证。
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表 1 引物 Table 1 Primers |
采用在线工具包(SMS)(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)进行基因和蛋白序列分析; DNAMAN软件和EditSeq 5.01软件分析蛋白的理化性质; 进化树的最大似然法构建采用MEGA 7.0软件; 保守结构域分析采用SMART软件(http://smart.emblheidelberg.de/); 蛋白的一级结构分析采用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)和ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)软件; 蛋白翻译后修饰采用MotifScan软件(http://myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan); 蛋白信号肽分析采用SignalP 6.1 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/); 蛋白跨膜分析采用TMHMM Server v6.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/); 蛋白二级结构分析采用在线软件CFSSP (http://www.biogem.org/tool/choufa-sman/); 蛋白三级结构分析采用在线软件SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)进行蛋白模板比对，采用SPDBV软件构建蛋白三级结构模型，采用VMD软件进行蛋白模型呈现; 亚细胞定位分析采用Wolf Psort Prediction软件(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)。
1.4 CpWRKY2基因的表达分析选取颗粒饱满的西葫芦种子，用0.2%高锰酸钾溶液进行浸泡消毒2 h，清水洗净晾干，在福建省蔬菜遗传育种重点实验室福清东张基地蔬菜育苗大棚内，播种于32孔穴盘中，出现第2片真叶后进行移栽，采集商品期的西葫芦根、茎、叶、花和果，利用百泰克试剂盒提取各组织的总RNA，反转录成cDNA后，调整cDNA浓度至50 ng/µL。根据获得的CpWRKY2序列设计特异引物(表 1)，以西葫芦Actin基因(GenBank登录号：MH21108)为内参基因[24]，利用ABI7500 Real-Time PCR system (美国ABI公司)，参考ChangesQTM Universal SYBR qPCR Master Mix说明书进行PCR扩增，均开展3次生物学和3次技术重复实验。
1.5 不同处理下CpWRKY2的表达分析西葫芦种子发芽后播种于32孔育苗盘中，在光照培养箱(28 ℃，16 h光照/28 ℃，8 h黑暗)中培养4周后，在5 ℃、10% PEG 6000、0.1 mmol/L ABA、50 mmol/L ETH、10 mmol/L SA和50 mmol/L MeJA分别处理幼苗20株，在0、2、4、8和12 h采集叶片液氮速冻，并于–80 ℃冰箱保存备用。每处理3个生物学重复。
1.6 CpWRKY2亚细胞定位分析利用Primer3Plus在线软件设计引物MQCpWRKY2 (表 1)，在CpWRKY2基因的开放读码框(ORF)两端加入酶切位点Sac Ⅰ和BamH Ⅰ (去掉终止密码子)，以测序验证后的重组质粒PCE2 TA/Blunt-CpWRKY2为模板进行ORF全长扩增和胶回收。用限制性内切酶BamH Ⅰ和Sac Ⅰ对质粒pCAMBIA 1300-GFP(35S: : GFP)进行双酶切。用同源重组连接酶将回收的CpWRKY2连接载体35S: : GFP，转化至DH5α大肠杆菌感受态，经菌液PCR及测序验证, 获得重组质粒35S: : CpWRKY2:: GFP。将重组质粒35S: : CpWRKY2:: GFP和对照空载质粒35S: : GFP分别转入农杆菌GV3101菌株中，挑取阳性的单克隆菌落于含有50 μg/mL利福平和50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养，在28 ℃摇床以200 r/min培养过夜；用含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和100 mmol/L乙酰丁香酮的侵染液重悬农杆菌至OD600约为0.8，冰浴1 h后，用无针头的10 mL注射器将35S: : CpWRKY2:: GFP重组载体和35S: : GFP空载体的菌液注射至烟草(Nicotiana tabacum)下表皮。注射后的烟草置于室温黑暗放置24 h，然后于28 ℃气候箱中培养1 d。利用激光共聚焦显微镜(LEICA TCS SP8，德国莱卡)观察侵染烟草叶片，分析CpWRKY2蛋白的亚细胞定位情况。
1.7 数据分析采用Excel软件和2–ΔΔCT方法计算CpWRKY2基因的相对表达量，利用SPSS 19.0软件中单因素方差分析法对CpWRKY2表达进行差异显著性分析。
2 结果和分析 2.1 CpWRKY基因克隆根据西葫芦全基因组信息，设计WRKY基因启动子引物QCpWRKY2，扩增得到西葫芦WRKY基因启动子序列长度为1 513 bp (图 1)。通过设计基因全长引物，从西葫芦基因组中克隆得到1条全长为1 349 bp基因序列，同源性分析表明，该CDS序列与同为南瓜属的中国南瓜(Cucurbita moschata, XM_023091218.1，E value: 0)的WRKY序列相似性高达98.51%，经测序验证和比对分析，获得的WRKY基因(GenBank登录号: MF988287)[11]和NCBI中公布的西葫芦WRKY全基因组(XM_023676898.1)序列信息完全一致[25]，将该基因命名为CpWRKY2。
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图 1 西葫芦CpWRKY2基因和启动子的PCR扩增。M: DL2000 marker; A: 启动子; B: CpWRKY2基因。 Fig. 1 PCR amplified of CpWRKY2 and promoter of Cucurbita pepo. M: DL2000 marker; A: Promoter; B: CpWRKY2 gene. |
序列分析表明，CpWRKY2基因全长1 351 bp，上游和下游非编码区长度分别为193和38 bp，基因编码区含有2个内含子(第590~775，905~998位) (图 2)。预测CpWRKY2基因编码279个氨基酸(AA), CpWRKY2蛋白(登录号: XP_023532666.1)理论分子量(Mw)为30.18 kD，等电点为9.29，pH 7.0时的带电荷数为12.87。CpWRKY2蛋白由20种氨基酸构成，其中丝氨酸(Ser)含量最高(17.6%)，丙氨酸(Ala)次之(9%)，色氨酸(Trp)最低(0.7%)。CpWRKY2蛋白包含79个疏水氨基酸(A、I、L、F、W和V)、91个极性氨基酸(N、C、Q、S、T和Y)、34个碱性氨基酸(K和R)和23个酸性氨基酸(D和E)。CpWRKY2蛋白的总平均疏水性(GRAVY)为–0.534, 蛋白不稳定系数(Ⅱ)为48.37，脂肪族指数(AI)为68.60，预测为亲水性蛋白。
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图 2 CpWRKY2基因全长及其编码氨基酸序列。红色: 特征序列WRKYGQK和锌指结构域C2H2; 方框: 起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)。 Fig. 2 Full-length sequence of CpWRKY2and encoding amino acid sequence. Red: Characteristic sequence WRKYGQK and C2H2 domain; Box: Start codon (ATG) and stop codon (TGA). |
西葫芦CpWRKY2蛋白的二级结构(CFSSP)分析表明，随机卷曲最多，为71.68%，其次为α螺旋和延伸链，分别占19.71%和6.81%，没有β转角结构。利用SWISS-MODEL、SPDBV和VMD软件进行三级结构建模和可视化作图(图 3)，拟参与WRKY转录激活功能的61个保守结构域(204~ 264位)由1个WRKYGQK (212~218位)基序和C2H2 (Cys: 232, 238位；His: 262, 64位)锌指结构共同组成。
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图 3 CpWRKY2的三级结构预测 Fig. 3 Prediction of tertiary structure of CpWRKY2 |
Motif Scan在线软件分析表明，CpWRKY2蛋白包含1个保守的WRKY结构域(201~267位，E值为1.6e-24)，206~266位为WRKY蛋白DNA结合区域，锌指结构域(232~264位)为C2H2型，且含有1个保守RTGHARFRRAP (76~86位)氨基酸序列，属于典型的Ⅱd型WRKY蛋白。分析表明，113~ 116和263~266位为N糖基化位点；47~50和267~ 270位为酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点；166~171位为N-豆蔻酰化位点；33~35、74~76、156~158、167~169、181~183、184~186、199~201、211~213和234~236位为蛋白激酶C磷酸化位点。TMHMM表明, CpWRKY2属于非跨膜蛋白，不含跨膜螺旋区。SignalP分析表明，CpWRKY2蛋白不含信号肽序列。CpWRKY2中没有核定位信号保守基序。
蛋白亚细胞定位预测表明，CpWRKY2转录因子位于细胞核中。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达亚细胞定位分析表明，在注射空载体35S: : GFP的对照组中，绿色荧光在细胞膜、细胞质和细胞核中均有分布，而注射瞬时表达载体35S: : CpWRKY2:: GFP的细胞中，仅在细胞核中有绿色荧光。说明CpWRKY2蛋白定位在细胞核上，这与亚细胞定位预测结果一致，推测CpWRKY2在细胞核内发挥转录调控作用(图 4)。
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图 4 CpWRKY2在本氏烟草下表皮细胞中的亚细胞定位。35S: : GFP: 携带空载pCAMBIA1300-GFP的农杆菌菌株；35S: : CpWRKY2:: GFP: 携带重组载体pCAMBIA1300-CpWRKY2-GFP的农杆菌菌株。 Fig. 4 Subcellular localization of CpWRKY2 in lower epidermal cells of Nicotiana benthamiana. 35S: : GFP: Agrobacterium tumefaciens strain withe empty vector pCAMBIA1300-GFP; 35S: : CpWRKY2: : GFP: A. tumefaciens strain with recombinant vector pCAMBIA1300-CpWRKY2-GFP. |
从PlantTFDB (http://planttfdb.gao-lab.org/)转录因子数据库中下载了18个CpWRKY2同源蛋白的序列，利用MEGA7.0软件构建CpWRKY2 (XP_ 023532666.1)、6个葫芦科(Cucurbitaceae)、4个十字花科(Brassicaceae)、4个禾本科(Gramineae)和4个茄科(Solanaceae)植物的WRKY蛋白系统进化树。结果表明，西葫芦CpWRKY2与中国南瓜、印度南瓜、黄瓜和甜瓜等葫芦科植物WRKY聚为一类，亲缘关系较近，与烟草、番茄和马铃薯等茄科植物WRKY蛋白的亲缘关系较远(图 5)。
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图 5 WRKY的系统进化树。XP_023532666.1: 西葫芦; XP_022946986.1: 中国南瓜; KAG6605183.1: 野生灰籽南瓜; XP_023006860.1: 印度南瓜; XP_ 011648567.1: 黄瓜; XP_008462838.1: 甜瓜; XP_022148532.1: 苦瓜; XP_009102803.1: 芜菁; AT2G23320.1: 拟南芥; XP_013593834.1: 甘蓝; NP_ 001288884.1: 欧洲油菜; MLOC_22356.1: 大麦; EEC72879.1: 水稻; XP_008647807.1: 玉米; XP_021306906.1: 高粱; XP_016465866.1, XP_ 009764599.1: 烟草; NP_001352739.1: 番茄; NP_001275001.1: 马铃薯。 Fig. 5 Phylogenic tree of WRKY. XP_023532666.1: Cucurbita pepo; XP_022946986.1: C. moschata; KAG6605183.1: C. argyrosperma; XP_023006860.1: C. maxima; XP_011648567.1: Cucumis sativus; XP_008462838.1: C. melo; XP_022148532.1: Momordica charantia; XP_009102803.1: Brassica rapa; AT2G23320.1: Arabidopsis thaliana; XP_013593834.1: Brassica oleracea; NP_001288884.1: B. napus; MLOC_22356.1: Hordeum vulgare; EEC72879.1: Oryza sativa; XP_008647807.1: Zea mays; XP_021306906.1: Orghum bicolor; XP_016465866.1, XP_009764599.1: Nicotiana tabacum; NP_001352739.1: Lycopersicon esculentum; NP_001275001.1: Solanum tuberosum. |
PlantCARE启动子预测软件分析表明(表 2)，CpWRKY2基因启动子上游1 513 bp具有许多顺式作用元件，其中包含ARE、ABRE、MBS、TC-rich repeat和W-box等胁迫响应元件，也存在光响应、昼夜节律响应等元件，暗示CpWRKY2基因可能受低温、弱光、干旱等非生物胁迫诱导表达。
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表 2 PlantCARE启动子预测 Table 2 Promoter prediction by PlantCARE |
定量PCR分析表明，CpWRKY2基因在西葫芦的根、茎、叶、花和果实中均有表达，其中，花中的表达丰度最高，其次为根和茎，在果实中的表达量最低，CpWRKY2基因表达呈现组织特异性(图 6)。
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图 6 CpWRKY2的表达模式。柱上不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下同 Fig. 6 CpWRKY2 Expression pattern of CpWRKY2. Different letters upon column indicate significant difference at 0.05 level. The same below |
西葫芦幼苗经5 ℃低温处理，CpWRKY2在处理2、4和6 h有较高的表达丰度，12 h后表达量降低，但表达量仍显著高于对照(0 h) (图 7)。用10% PEG 6000模拟干旱胁迫，CpWRKY2在处理4 h内的表达无明显变化，处理8 h后表达量显著高于对照，并在12 h出现峰值。0.1 mmol/L ABA处理后CpWRKY2呈现先上调后下调的表达趋势，处理2 h的表达量最高，为对照的23倍，达极显著差异。CpWRKY2表达在50 mmol/L ETH处理2和4 h上调，此后逐渐降低。CpWRKY2表达在10 mmol/L SA处理12 h内总体呈上调趋势，在12 h的表达丰度最高。CpWRKY2表达在50 mmol/L MeJA处理2和4 h上升，此后逐渐降低，处理8和12 h的表达量低于对照。
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图 7 不同胁迫下CpWRKY2基因的表达模式 Fig. 7 Expression pattern of CpWRKY2 gene under different stresses |
转录因子调节的应答胁迫转录重排在植物耐逆防御反应过程中起重要调节作用，并以多基因家族的形式存在，据PlantTFDB统计。目前鉴定出的转录因子至少有58种，主要包括NAC、MYB、WRKY、DREB/ERF和M-type_MADS等家族。随着转录组测序、全基因组测序等技术的快速发展，越来越多的WRKY基因被逐渐分离出来，植物中的WRKY转录因子已达14 549个，成为高等植物中最为常见及研究较多的转录因子家族之一[26]。研究表明，植物通过信号传导并产生一系列应答基因表达产物，以此减少胁迫产生的伤害并增加耐受性，WRKY蛋白在此起着重要的调控作用。WRKY转录因子的基因克隆与功能鉴定研究在模式植物和其他作物中不断深入，但鲜见西葫芦中WRKY基因的克隆和分析的报道。本研究利用转录组测序技术，从西葫芦‘福美6号’叶片中克隆得到CpWRKY2转录因子基因, CpWRKY2的ORF全长为840 bp，CpWRKY2蛋白与中国南瓜(XP_022946987.1)和黄瓜(XP_011648567.1)同源蛋白的相似性分别为99.64%和86.39%，具有高度的蛋白进化保守性。Wolf Psort在线预测和烟草瞬时表达分析表明，CpWRKY2蛋白亚细胞定位于细胞核中。此外，Motif Scan分析表明，CpWRKY2蛋白包含WRKY保守结构域(201~267位)、WRKY蛋白DNA结合区域(206~266位)和C2H2型(Cx5Cx23HX1H)锌指(232~264位)，且含有1个RTGHARFRRAP氨基酸保守基序，属于典型的Ⅱd亚类WRKY转录因子蛋白家族[27]。
本研究结果表明，CpWRKY2基因具有组织表达特异性，在花中的表达量较高，暗示CpWRKY2基因可能参与了西葫芦花期的发育调控[28–29]。目前已识别和克隆的WRKY转录因子在各种环境(干旱、低温、盐、机械损伤等)的诱导下，其表达具有快速、瞬时等特点，同时还具有组织表达特异性，可通过介导ETH、SA、ABA和MeJA等信号通路对多种逆境胁迫进行防疫反应[30–32]。WRKY转录因子上游启动子的顺式作用元件是其参与何种逆境胁迫响应的重要依据，本研究通过PlantCARE在线网站预测CpWRKY2上游启动子1 513 bp内包括1个胁迫响应元件ARE、2个脱落酸(ABA)响应元件ABRE、1个MBS干旱胁迫响应的MYB结合响应元件、1个TC-rich repeat防御和胁迫反应元件以及3个结合WRKY响应生物和非生物胁迫响应的W-box元件[33–35]。经RT-qPCR验证，在5 ℃、PEG 6000模拟干旱胁迫、ABA、ETH、SA和MeJA处理后，CpWRKY2均出现不同程度的上调表达，暗示CpWRKY2基因可能参与多种非生物逆境，包括低温、干旱等胁迫的调控，这与课题组前期对CpWRKY2基因在低温弱光胁迫中的研究结果一致[11]。进一步分析表明，正常情况下，CpWRKY2在西葫芦叶片的表达量相对较低，但ABA处理后呈先上调后下调的表达趋势，可能受其他WRKY蛋白或CpWRKY2上游启动子中含有的W-box (TTGACC)结合而调控自身表达，或在此响应过程中受其他转录因子的竞争抑制影响而呈现下调表达[36–37]。因此，推测CpWRKY2可能通过ABA信号途径介导并参与多种胁迫反应。但对非生物胁迫下西葫芦中CpWRKY2的生物学功能及其调控分子机制还需进一步验证。本研究加深了对CpWRKY42参与逆境应答调控的认识，为下一步开展CpWRKY2转录因子基因调控低温、干旱等非生物胁迫的分子机制研究奠定了基础。
综上所述，本研究从西葫芦转录组数据库筛选出1条CpWRKY2基因，全长1 071 bp，与中国南瓜的WRKY核苷酸序列相似性为98.51%，具有高度的保守性。CpWRKY2蛋白包含1个WRKY保守结构域和C2H2型锌指，且含有1个RTGHAR-FRRAP氨基酸保守基序，属于Ⅱd亚类WRKY转录因子蛋白家族。CpWRKY2基因启动子中含有ARE、ABRE和W-box等可能的胁迫响应顺式作用调控元件，且CpWRKY2基因可受激素、低温及干旱胁迫诱导表达，推测CpWRKY2基因在响应西葫芦低温、干旱等非生物胁迫应答过程中具有重要的调控作用。
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