甜叶菊(Stevia rebaudiana)是菊科(Composite)多年生草本药用植物，叶中丰富的甜菊糖苷作为一类天然甜味剂备受世界关注，并广泛应用于食品、饮料和调味料的生产^[1]。甜菊糖苷(steviol glycosides, SVglys)是一类萜类混合物，主要组分有甜菊苷(stevioside, STV)和瑞鲍迪苷(rebaudiosides)系列，其中STV和RA (rebaudioside A)含量较高^[2]。中国是全球最主要的甜菊糖苷出口国，甜菊糖苷市场需求的逐渐增加导致甜叶菊种植面积不断扩大。新疆是国内近几年来甜叶菊推广种植的重点发展区域，其独特的气候特征及良好的土壤资源尤其适合甜叶菊的规模化种植和机械化操作，但甜叶菊的生长特性决定其在新疆只能一年一收，收获后的气候又不适宜其他作物生长，随后的连续种植甜叶菊造成生产上的连作并产生一定弊端，如生长减缓、产量下降及发病率增加^[3]等，即产生了连作障碍。

引起连作障碍的原因很复杂，根系所处土壤环境的恶化是重要原因之一，研究土壤性状变化对克服作物连作障碍有着重要的指导意义。土壤酶与微生物参与土壤养分循环，与土壤质量的许多理化指标高度相关^[4]。研究表明，连作改变土壤理化性质、导致养分失衡、改变土壤酶活性及引起微生物群落结构失衡等，进而影响植物生长^[5]，但连作对土壤酶活的影响在不同作物不同生育时期的表现均不一致^[6–8]。对药用植物而言，土壤性状改变显著影响植物的活性成分含量^[9]，土壤养分含量变化显著影响药用植物黄花蒿的青蒿素含量^[10]。连作是药用植物栽培中导致土壤恶化的主要原因，连作障碍已经成为制约药用植物品质和发展的关键性因素^[11], 如何通过控制土壤性状减缓连作障碍已经成为甜叶菊生产中迫切需要解决的科学问题。

调查发现，新疆地区甜叶菊少则连作2~3 a, 多则4~5 a甚至更长，严重阻碍了甜叶菊生产的可持续性。目前对甜叶菊连作问题还缺乏深入系统的研究。因此，本文从土壤角度，对甜叶菊连作后土壤理化性质、土壤酶活性及土壤微生物量的变化进行研究，探讨连作后土壤性状与叶片干重及甜菊糖苷含量间的关系，以期为生产中甜叶菊的施肥、减缓连作障碍及可持续高效栽培提供理论依据。

试验地位于新疆库尔勒市和静县哈尔莫敦镇(86.14° E，41.76° N)，地处天山中段南麓，属于中温带大陆性干燥气候，四季分明，干燥少雨，光热条件充足，无霜期长，年均气温8.8 ℃，年降雨量68 mm，年蒸发量2 100 mm，年日照时数2 942 h, 全年无霜期为183 d。土壤类型为壤土，中性偏碱, 肥力中等。

供试甜叶菊品种为‘谱星六号’，于2019年4月15—20日进行大田移栽，当年9月10日前后收获。采用覆膜滴灌的种植方式，底肥用量为：重过磷酸钙337.5 kg/hm²，硫酸钾337.5 kg/hm²，硫酸亚铁108 kg/hm²，后期分期追施尿素6次共36 kg/hm², 均随滴灌施入；收获前1个月左右叶面喷施磷酸二氢钾30 kg/hm²，其余操作同常规大田管理。

以第1年种植甜叶菊地块为对照(CK)，连作年限设有2、3和4 a。CK和2~4 a连作地块移栽前土壤pH为8.5~8.8，有机质(organic matter, OM)含量分别为25.76、24.43、20.83和16.13 g/kg，全氮(total nitrogen, TN)含量分别为1.47、1.78、1.50和1.11 g/kg, 速效磷(available phosphorus, AP)含量分别为20.48、35.03、30.24和34.57 mg/kg，速效钾(available potassium, AK)含量分别为107.67、97.33、92.00和69.00 mg/kg。于甜叶菊收获前采集样品, 按照蛇形采样法每处理采集5株并混合，3个重复。将甜叶菊根系完整挖出后，抖掉多余的土，收集根际附近的土壤作为测试样品。一份土壤样品自然风干后过20和100目筛, 用于土壤理化及土壤酶活性的测定；一份土壤鲜样低温保存，用于土壤微生物量的测定。同时将叶片于烘箱105 ℃杀青30 min后75 ℃烘干，用电子天平称取叶片干质量(leaf dry weight, LDW)后粉碎过60目筛待测糖苷含量。

参考鲍士旦^[12]和关松荫^[13]的方法测定土壤指标。土壤pH采用电位法(土水比=1:2.5)，土壤电导率(EC)采用电导率仪测定；有机质采用外加热重铬酸钾容量法，全氮采用浓硫酸消煮后上流动分析仪检测，速效磷采用钼锑抗比色法，速效钾采用火焰光度计法。土壤脲酶(urease, UE)采用苯酚-次氯酸钠比色法，过氧化氢酶(catalase, CAT)采用高锰酸钾滴定法；蔗糖酶(sucrase, SUC)采用3, 5-二硝基水杨酸比色法，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)采用磷酸苯二钠比色法，多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)采用邻苯三酚比色法。新鲜土壤经氯仿熏蒸-硫酸钾提取后，分别采用碳分析仪器法和流动注射氮分析仪器法测定土壤微生物量碳(microbial biomass carbon, MBC)和土壤微生物量氮(microbial biomass nitrogen, MBN)。

参考Liu等^[14]和罗庆云等^[15]的方法测定叶片糖苷含量，精确称取50 mg甜叶菊粉末，加入1.5 mL 50%乙醇，超声提取40 min，11 800×g离心10 min, 0.45 μm有机微孔滤膜过滤后测定甜菊糖苷含量(%), 组分有STV、RA、RB (rebaudioside B)、RC (rebau- dioside C)、RD (rebaudioside D)、RF (rebaudioside F)和RM (rebaudioside M)。

所有数据均为3个重复的平均值，采用SAS 9.2软件进行方差分析和Pearson相关分析，LSD法进行多重比较，显著性水平设为P < 0.05。采用Graph- Pad Prism 7作图。

由图 1可知，除有机质含量外，连作显著影响土壤理化性状。与对照相比，pH值在连作4 a降到最低，分别比连作2 a和3 a降低了16.46%和19.22%; EC值随着连作年限增加而增加，连作3 a和4 a的差异不显著，分别是对照的2.32和1.79倍；速效磷含量在连作前3年无显著差异，连作4 a则显著提高，分别比对照、连作2 a和3 a提高了69.90%、91.25%和99.92%；连作3 a和4 a的全氮和速效钾含量并无显著差异，但均显著低于对照和连作2 a。

图 1(Fig. 1)

图 1 土壤理化性状的比较。CK: 对照; EC: 电导率; OM: 有机质; TN: 全氮; AP: 速效磷; AK: 速效钾。柱上不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下同 Fig. 1 Comparison of soil physicochemical properties. CK: Control; EC: Electric conductivity; TN: Total nitrogen; AP: Available phosphorus; AK: Available potassium. Different letters upon column indicate significant differences 0.05 level. The same below

甜叶菊连作后土壤酶活性的变化不一致(图 2)。与对照相比，连作使过氧化氢酶活性显著降低，但连作年限间并无显著差异；土壤脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶活性均呈下降趋势，连作2 a和3 a的差异不显著，连作4 a显著降低，分别比对照降低了63.68%、72.03%和47.43%；随着连作年限增加，土壤多酚氧化酶活性显著增加，在连作4 a达到最高，分别是对照、连作2 a和3 a的4.22、2.87和2.12倍。

图 2(Fig. 2)

图 2 土壤酶活性的变化。UE: 脲酶; CAT: 过氧化氢酶; SUC: 蔗糖酶; ALP: 碱性磷酸酶; PPO: 多酚氧化酶。下同 Fig. 2 Changes in soil enzyme activity. CK: Control; UE: Urease; CAT: Catalase; SUC: Sucrase; ALP: Alkaline phosphstase; PPO: Polyphenol oxidase. The same below

土壤微生物量均在连作4 a后降至最低(图 3), 其中连作4 a的微生物量碳与连作3 a的无显著差异, 但比对照和连作2 a显著降低了76.43%和56.82%; 连作4 a的微生物量氮比连作2 a和3 a分别降低了73.81%和41.05%。

图 3(Fig. 3)

图 3 土壤微生物生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)的变化 Fig. 3 Changes in soil microbial biomass carbon (MBC) and microbial biomass nitrogen (MBN)

连作显著影响甜叶菊叶片干质量和甜菊糖苷含量(图 4)。随着连作年限增加，叶片干质量逐渐下降，连作2 a和3 a的差异不显著，连作4 a则显著降低，仅为对照的64.04%。相反，连作4 a的糖苷总含量最高，分别比对照、连作2 a和3 a增加了14.00%、19.30%和20.42%；与对照相比，STV含量显著下降，在连作4 a降到最低，比对照低16%。连作2 a和3 a的STV、RB、RC、RD、RF、RM含量差异不显著；RA含量则呈现先降后升的趋势, 在连作4 a达到最大值，比对照增加了22.19%。

图 4(Fig. 4)

图 4 叶片干质量及甜菊糖苷含量的变化。LDW: 叶片干质量; SVglys: 甜菊糖苷; STV: 甜菊苷; RA、RB、RC、RD、RF、RM为瑞鲍迪苷系列。下同 Fig. 4 Changes in leaf dry weight and steviol glycosides content. LDW: Lear dry weight; SVglys: Steviol glycoside; STV: Stevioside; RA, RB, RC, RD, RF, RM: Rebaudiosides. The same below

相关分析结果表明(表 1)，甜叶菊叶片干质量与土壤EC和多酚氧化酶活性呈显著负相关，与速效钾含量、脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶活性及微生物量碳呈显著正相关；RA含量与土壤pH、脲酶、蔗糖酶、磷酸酶及微生物量氮显著负相关, 与土壤EC值和多酚氧化酶呈显著正相关；STV含量与土壤EC、速效磷含量和多酚氧化酶活性呈显著负相关，与脲酶、蔗糖酶、磷酸酶洗发呈显著正相关；RB和RC含量均与微生物量碳呈显著负相关，RC含量与土壤EC呈显著正相关，RM含量与速效钾含量和微生物量碳呈显著正相关。

表 1(Table 1)

表 1 相关分析 Table 1 Correlation analysis 指标Index pH EC OM TN AP AK UE CAT SUC ALP PPO MBC MBN LDW 0.20 –0.90** 0.45 0.39 –0.36 0.81** 0.90** 0.89** 0.89** 0.87** –0.78** 0.90** 0.11 RA –0.90** 0.58* –0.43 –0.51 0.79** –0.11 –0.71* –0.43 –0.72** –0.64* 0.85** –0.28 –0.58* STV 0.57 –0.70* 0.57 0.12 –0.65* 0.30 0.79** 0.56 0.79** 0.74** –0.75** 0.48 –0.00 RB 0.41 0.30 0.32 –0.13 –0.00 –0.57 –0.20 –0.37 –0.24 –0.17 0.12 –0.59* 0.09 RC –0.15 0.65* 0.16 –0.46 0.28 –0.55 –0.57 –0.62* –0.49 –0.57 0.53 –0.70** –0.37 RD 0.35 –0.18 0.11 0.40 –0.18 0.09 0.19 0.13 0.27 0.24 –0.38 0.11 0.50 RF 0.40 0.20 0.46 –0.06 0.23 –0.37 –0.15 –0.03 –0.23 –0.21 0.09 –0.45 0.10 RM –0.38 –0.28 0.11 0.39 –0.01 0.66* 0.27 0.44 0.38 0.27 –0.26 0.61* 0.11 *: P < 0.05; **: P < 0.01

表 1 相关分析 Table 1 Correlation analysis

连作导致土壤酸化，福建百香果(Passiflora edulis)连作3 a后土壤pH降到4.16^[16]，严重抑制植物生长，但新疆土壤本身偏碱，所以甜叶菊连作4 a后土壤pH值虽显著降低，但仍在甜叶菊的适宜生长范围。土壤EC值与土壤中的可溶性盐分有关, 盐度过高不利于植物的正常生长。关于连作与土壤养分、土壤酶活性的报道较多，由于植物种类不同、土壤类型不同及连作年限差异导致研究结果相差较大^[17–20]。从整体上看，甜叶菊连作后土壤次生盐渍化加重，土壤磷过剩，钾消耗过多，造成养分不平衡，这与黄瓜(Cucumis sativus)的研究结果一致^[21]。

土壤酶活性与土壤营养物质转化能力、肥力水平及污染状况密切相关^[22]。土壤脲酶和磷酸酶分别参与土壤含氮、含磷化合物的转化，蔗糖酶促进蔗糖分解成葡萄糖和果糖，这3种酶的活性均在甜叶菊连作4 a后显著降低，这与半夏(Pinellia ternate)^[23]的研究结果相似。过氧化氢酶可分解过氧化氢，降低其对生物体的毒害作用，甜叶菊连作后土壤过氧化氢酶的活性无显著差异，与土壤有机质含量的变化一致，也与刘垠霖等^[24]对哈密瓜(Cucumis melo var. saccharinus)的研究结果相同。作为一种氧化还原酶，多酚氧化酶能够降解土壤中酚类物质，减缓植物间的化感作用^[25]。桉树(Eucalyptus grandis×E. urophylla)林间的土壤多酚氧化酶活性随连栽年限增加呈上升趋势，且与土壤水溶性酚呈极显著正相关^[26]。本研究中甜叶菊连作4 a的土壤多酚氧化酶同样急剧增加，表明连作甜叶菊可能导致土壤中积累较多的水溶性酚，随之增强的多酚氧化酶活性则可以制约这种现象，从而缓解土壤酚对植株正常生长发育的抑制。

土壤微生物量参与土壤有机质的分解、腐殖质的形成及土壤养分的转化循环等生化过程，是土壤肥力与质量的重要生物指标^[27]。土壤微生物量碳是土壤有机碳的灵敏指示因子，土壤微生物量氮是土壤氮素矿化的重要组成部分，二者的变化趋势与土壤全氮的变化一致^[28]，这与本文的结论相似；此外，二者与土壤酶活性存在显著相关关系，并直接影响土壤中可培养微生物的数量^[29]，甜叶菊连作后土壤微生物量显著下降，也在一定程度上反映连作后土壤质量的变化，后续可进一步开展土壤微生物方面的相关研究。

连作改变了土壤性状，而土壤性状与药用植物的生长和品质密切相关^[30]。本研究中甜菊糖苷总量在连作4 a达到最高，但不同甜菊糖苷组分的含量受连作的影响不同，含量较高的STV在甜叶菊连作4 a显著下降，而RA含量则达到最高，其余组分的差异不大。甜菊糖苷属于植物次生代谢物，次生代谢与植物抗性及品质密切相关，植物通过提高次生代谢产物提高自身保护和生存竞争能力，环境胁迫显著刺激植物次生代谢产物的积累^[31–32]。本研究中较长时间连作导致的土壤性状劣变或许是刺激糖苷含量增加的主要胁迫因子，虽然主要糖苷组分含量在连作4 a达到最高，但由于此时较低的生物量依然使整体的糖苷积累量维持在较低水平。相关分析结果证实，甜叶菊叶片干质量与土壤理化指标呈显著正相关或负相关，主要糖苷组分STV和RA也与土壤理化性状、土壤酶活性及土壤微生物量存在一定的相关性，这表明连作通过改变土壤性状影响甜叶菊产量及品质，尽管连作会对糖苷组分产生一定的“连作增益”效应^[33]，但在连作年限上仍需结合生物量进行慎重选择。

综上，甜叶菊连作后显著劣变的土壤严重影响叶片干质量与甜菊糖苷含量。连续种植甜叶菊4 a的土壤性状整体弱于连作2~3 a，表明连作3 a可能是生产中甜叶菊连作的最高年限阈值。土壤是一个极其复杂的环境，除土壤理化性状外，还需要考虑根际分泌及土壤微生物等多种因素，综合多方位原因才能更加全面的解释甜叶菊连作障碍的产生机理，进而提出有针对性的解决措施。