南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)，又名紫杉，是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属植物，因其含有重要抗癌功效的紫杉醇而倍受人们的关注^[1]，由于人们对紫杉醇需求量日益增加，市场上有关紫杉醇项目逐渐成为开发热点，使得南方红豆杉长期受到掠夺式砍伐，导致现存自然资源很少^[2]。自然条件下，南方红豆杉种子休眠性强且不易被打破，无人为干预条件下需经两冬一夏才能完成生理成熟过程，天然更新能力差，在长时间的休眠中大量种子丧失了活力，造成种子萌发率低^[3]。将种子埋于湿沙置于较低温度进行层积处理，能降低种子发芽抑制物和增加细胞分裂素，进而有效地解除休眠。南方红豆杉种子因其休眠期长、自然萌发率低给野生资源的开发利用造成困难。因此，开展南方红豆杉种子休眠机理的研究，对其种质资源的开发及保护生物学具有重要意义。文献报道在红豆杉属植物种子的休眠机理做了一些工作，如廖云娇等^[4]对东北红豆杉(T. cuspidata)的研究表明，种子在变温层积处理下，层积6个月后可促进种胚伸长，且昼夜变温-冷温层积效果优于暖温-冷温和冷温-冷温层积。阎腾飞等^[5]在不同湿度下低温层积红豆杉(T. wallichiana var. chinensis)种子，认为层积2个月对种子内含物的影响较大。陈发军等^[6]研究表明相对较低湿度更有利于南方红豆杉种子多糖成分的贮藏。尽管在南方红豆杉种子生理学方面做了一些研究，但对休眠机理观点不一致，缺乏在不同季节和湿度及其交互作用对红豆杉种子中贮藏物质的影响研究。本研究以南方红豆杉种子为试验对象，旨在探究其在不同季节和不同湿度条件下层积过程中的生理特性变化规律，以期进一步揭示南方红豆杉种子的休眠机理，推动南方红豆杉的规模化培育。

供试材料南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)种子于2016年12月采自江西省九江市修水县。采集的种子经纯水浸泡，搓洗除去假种皮，自然荫干后置于4 ℃下保存。

温度层积处理  在培养箱内将种子层积12个月(2017.5—2018.5)，光照强度为54 µmol/(m²·s)。温度设置参照修水县1987—2016年的温度数据分为春、夏、秋、冬4组，昼温设置为每个季节的平均最高气温，夜温设置为平均最低温度，昼夜时间为12 h: 12 h。温度设置分别为春季22.1 ℃/12.7 ℃、夏季32.4 ℃/23.5 ℃、秋季23.9 ℃/14.3 ℃和冬季11 ℃/2.8 ℃ (由江西省气象局提供温度数据)。取约600粒种子于发芽盒(长×宽×高=19 cm×13 cm× 12 cm)内，种子和湿沙按1:3的体积比在发芽盒中均匀混合，置于培养箱中进行层积处理，每组处理3个重复。层积处理过程中全程保湿，将发芽盒内水分含量控制在16%和24%，基质含水量变化很小，每月根据含水量进行1次定量补充。在种子层积过程中，每间隔3个月采用随机抽样法，每次取约150粒种子用于内含物测定。样品采集后置于–80 ℃低温保存。

指标测定  采用蒽酮比色法测定种子可溶性糖含量；采用考马斯亮蓝G-250法测定种子可溶性蛋白含量；采用蒽酮比色法测定淀粉含量；采用索氏提取法测定种子脂肪含量^[7]。

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，采用Sigma-plot 12.0软件画图，显著性差异水平为α=0.05。

从图 1可见，2种湿度下，种子经过不同季节温度层积12个月后，种子可溶性蛋白含量呈现先上升后下降的变化趋势。种子蛋白含量在温度层积处理3个月都呈现出上升的趋势，与层积前相比显著增加。在夏季温度层积3个月后，种子腐烂现象严重，后续数据缺失。16%湿度下，春季、秋季、冬季层积处理3~6个月的种子蛋白含量缓慢上升, 而秋季层积处理6个月后开始下降。春季和冬季层积处理9个月的种子蛋白含量变化趋势较一致，都呈持续上升的趋势，并在层积9个月后达到最高值, 由层积前的18.1 mg/g分别增加到48.8和43.7 mg/g, 9个月后呈现下降趋势(图 1: A)。

图 1(Fig. 1)

图 1 湿度和季节层积对种子可溶性蛋白含量的影响。A: 16%湿度; B: 24%湿度。 Fig. 1 Effects of humidity and season stratification on soluble protein content. A: 16% humidity; B: 24% humidity.

在24%湿度下，春季、秋季、冬季层积处理9个月的种子可溶性蛋白含量变化趋势较一致，均持续上升，并在9个月达到最高值，由层积前的18.1 mg/g分别增加到42.1、38.9、36.1 mg/g，层积9个月后呈下降趋势。16%湿度下春季和冬季层积前9个月的种子可溶性蛋白含量比24%湿度下升高。2种湿度下春季层积9个月的种子可溶性蛋白含量最高(图 1: B)。

在16%和24%湿度下，种子在3个季节层积(春、秋、冬)前9个月的可溶性糖含量变化趋势基本一致，均呈先增加后减少的趋势, 在前3个月可溶性糖含量降低，3~6个月增加，6个月后又下降(图 2)。

图 2(Fig. 2)

图 2 湿度和季节层积对可溶性糖含量的影响。A: 16%湿度; B: 24%湿度。 Fig. 2 Effects of humidity and season stratification on soluble sugar content. A: 16% humidity; B: 24% humidity.

由图 3可见，2种湿度下种子经春、秋、冬季层积12个月，淀粉含量都降低。春、秋季层积6个月的种子淀粉含量变化趋势基本一致，均呈持续下降的趋势，冬季层积3个月含量下降，之后略有回升。春、秋、冬季层积6~9个月的淀粉含量显著下降(P < 0.05)，16%湿度下层积9个月种子淀粉含量由层积前的2.62%分别下降到1.63%、1.37%、1.52% (图 3: A)；24%湿度下分别下降到1.39%、1.13%、1.35%。2种湿度下秋季层积处理的种子淀粉含量降幅最为明显(P < 0.05，图 3: B)。

图 3(Fig. 3)

图 3 湿度和季节层积对淀粉含量的影响。A: 16%湿度; B: 24%湿度。 Fig. 3 Effects of humidity and season stratification on starch content. A: 16% humidity; B: 24% humidity.

2种湿度下种子经春、秋、冬季层积12个月, 脂肪含量均有不同程度的降低。16%湿度下种子经春、秋、冬季层积9个月后，脂肪含量由层积前的72.1%分别下降到68.02%、68.48%、68.98%，且以6~9个月的降幅最为显著(图 4: A)；24%湿度下春、秋季分别下降到68.68%、68.67%，冬季层积处理的差异不显著(图 4: B)。16%湿度下种子层积处理6~9个月种子脂肪含量降幅比24%湿度大，以秋季层积处理的最为显著(P < 0.05)。

图 4(Fig. 4)

图 4 湿度和季节层积对脂肪含量的影响。A: 16%湿度; B: 24%湿度。 Fig. 4 Effects of humidity and season stratification on fat content. A: 16% humidity; B: 24% humidity.

不同层积处理与种子内含物的相关性分析表明(表 1)，层积湿度对种子内含物影响较小，而层积时间对内含物影响更为明显(P < 0.000)，在不同湿度和温度交互作用下，除对可溶性蛋白含量存在显著性影响外，对其他内含物均无显著性影响。在层积过程中，种子可溶性蛋白质含量累积较多，而其它内含物用于种子代谢及其形态后熟。因此，层积处理是种子内含物的重要调控过程。

表 1(Table 1)

表 1 层积处理与南方红豆杉种子内含物的相关性分析 Table 1 Correlation analysis of fat content with stratification the content of Taxus chinesis var. mariei seeds 因子 Factor 可溶性蛋白Soluble protein 可溶性糖Soluble sugar 淀粉Starch 脂肪Fat F P F P F P F P 温度Temperature (A) 25.257 0.000** 5.192 0.100 2.831 0.072 1.714 0.195 湿度Humidity (B) 0.989 0.327 3.853 0.057 5.687 0.220 0.359 0.213 时间Time (C) 45.906 0.000*** 43.093 0.000*** 271.934 0.000*** 25.195 0.000*** A×C 2.394 0.069 1.435 0.242 11.005 0.000*** 0.579 0.667 B×C 0.335 0.717 2.455 0.100 2.395 0.106 1.417 0.256 A×B 4.679 0.016* 3.124 0.056 1.847 0.172 0.556 0.578 A×B×C 3.198 0.024* 0.420 0.793 1.310 0.285 0.108 0.979 *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; n=12

表 1 层积处理与南方红豆杉种子内含物的相关性分析 Table 1 Correlation analysis of fat content with stratification the content of Taxus chinesis var. mariei seeds

大多数参与植物体内代谢的酶都是蛋白质，其含量在很大程度上反映其代谢状况^[8]。种子的可溶性蛋白质含量增加反映胚生命活动不断增强^[9]。Lewak^[10]认为苹果(Malus domestica)种子休眠期间蛋白水解活性显著提高是由于某些特定的蛋白酶引起的。本研究结果表明，2种湿度下，南方红豆杉种子在4个季节层积处理3个月，其可溶性蛋白含量均显著增加，可能是此时种子代谢活动不强, 呼吸作用较弱，可溶性蛋白消耗速度较慢^[11]。南方红豆杉种子在夏季层积3个月，由于受高温影响, 导致种子发生霉烂，发芽指数大幅降低，种子活力下降^[12]。16%湿度下春季、秋季、冬季层积处理3~6个月，种子的可溶性蛋白积累速度有所减缓。24%湿度下春季、秋季层积处理3~6个月的种子可溶性蛋白含量减少，其原因可能是种胚生长发育消耗可溶性蛋白或部分蛋白分解转化为糖类所致^[8]。16%湿度下春季和冬季层积6~9个月，以及24%湿度下春季、秋季、冬季层积处理的种子可溶性蛋白持续累积，在9个月达极大值，说明种子休眠解除种胚基本完成生长，此时，蛋白质开始积累，种子代谢活动增强^[13]。16%湿度下春季和冬季层积9个月的种子可溶性蛋白积累比24%湿度下的更多。2种湿度下，春季和冬季层积9个月时的种子可溶性蛋白含量最高，说明种子在春季和冬季层积过程中，16%湿度更能促进种子代谢。2种湿度下春季层积9个月的种子可溶性蛋白积累量最多，说明春季更能促进种子可溶性蛋白积累。

种子中可溶性糖是呼吸代谢底物，来源主要是种胚和胚乳现存的可溶性糖，以及淀粉水解和脂肪的降解^[14]。淀粉作为植物体内重要的代谢物质，可以通过淀粉酶水解为葡萄糖，为种子萌发提供能量^[15]。本研究表明，2种湿度下，南方红豆杉种子在不同季节层积3个月的可溶性糖含量快速降低, 淀粉和脂肪含量变化不大，可能是种胚生长发育消耗的可溶性糖大于淀粉和脂肪转化的量，导致可溶性糖含量降低^[16]。春季、秋季、冬季层积3~6个月的种子可溶性糖含量持续上升，并在层积6个月时达到最高；春季和秋季层积处理的种子淀粉含量持续减少，说明此时种子代谢活动加强，虽然种子呼吸消耗量有所增加，但淀粉及其它内含物转化生成可溶性糖的速率更快^[17–18]。层积6~9个月种子可溶性糖含量减少，可溶性蛋白质含量上升，代谢活动增强，说明这个阶段种胚大致完成生长，需要消耗大量的能量。2种湿度下，春季、秋季、冬季层积6~ 9个月的种子淀粉含量急剧下降，说明种子代谢活动加强，淀粉酶活性增加，导致淀粉水解速度加快^[19]。2种湿度下秋季层积的种子淀粉含量减少最多，说明秋季层积处理更能促进种子中淀粉的分解。

有研究表明，未层积处理的南方红豆杉种子的脂肪含量较高，脂肪主要通过酶解和糖异生作用转化为糖用于种子的萌发，说明脂肪是红豆杉种子中主要的储藏物质^[20–21]。黄儒珠等^[22]认为红豆杉种子中脂肪会降解为可溶性小分子物质或糖类，用于胚的呼吸，为胚的生长发育提供养料。2种湿度下, 春季、秋季、冬季层积9个月的种子脂肪含量均减少，说明在层积过程中脂肪转化为其他物质。南方红豆杉种子层积处理3个月，脂肪含量均减少^[23]。南方红豆杉种子层积处理3~6个月脂肪和淀粉含量下降, 可溶性糖含量上升明显，说明脂肪可转变为可供种胚直接利用的可溶性糖，为种胚生长提供物质基础^[24–25]。2种湿度下的春季和秋季层积6~9个月的种子脂肪含量下降，可溶性蛋白含量持续升高并在9个月时达到最高，说明种子休眠解除种胚完成生长，脂肪和蛋白质继续降解转化，分解成糖类和可溶性蛋白用于种子的萌发^[23]。2种湿度下, 春季和秋季层积处理的南方红豆杉种子脂肪含量持续下降。16%湿度下春季、秋季、冬季层积6~9个月的种子脂肪含量均快速下降，而24%湿度下冬季层积处理的种子脂肪含量略有增加, 说明16%湿度更能促进红豆杉种子脂肪的转化, 种子代谢活动更强。

南方红豆杉种子在16%和24%湿度下进行不同季节层积，夏季温度过高导致种子发生霉烂从而丧失生命力；春季、秋季、冬季层积处理的种子脂肪含量在16%湿度下比24%湿度下降的更多，表明16%湿度下种子代谢活动更强。春季层积处理的种子可溶性蛋白积累最多，秋季温度层积的淀粉含量、脂肪含量下降最多，说明春季、秋季的温度更能促进种子代谢及其形态后熟。