2023, Vol. 31
茶树是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)茶组(sect. Thea)的多年生常绿木本植物[1]，且为常异花授粉植物，具有高度杂合性，杂交结实率低[2]，自然杂交收获种子比人工杂交收获种子相对容易，但缺乏对其父本信息了解，对自然杂交后代父本的模拟鉴定有助于提高茶树育种者对茶树自然杂交后代的选择。EST-SSR具有共显性、多态性高、重复性好等特点[3–8]，被应用在不同生物上进行模拟亲本鉴定。用于亲本模拟分析的软件主要有CERVUS、COLONY和PAPA，李博等[9]对比了这3个软件的准确率，认为CERVUS亲本模拟分析的准确率可达81.2%，鉴定效果较好。不同作物都有大量采用CERVUS软件进行亲本模拟分析的报道，艾畅等[10]通过马尾松(Pinus massoniana)自由授粉子代模拟父本分析，建立遗传多样性与同父本组成之间的联系，为种子园集约生产种子提供理论依据；张冬梅等[11]利用SSR对油松(P. tabulaeformis)种子进行父本分析, 结合油松在园内的分布，明确种子园内花粉传播的最大距离和花粉活力；冯源恒等[12]对广西马尾松第2代育种群体进行父本分析，表明个体间的近交程度较低，为开展马尾松高世代杂交育种奠定了基础；王建忠等[13]从桉树(Eucalyptus robusta)候选父本中鉴定出D2、D4、D11、D19、D20等7个子代的父本，探究了桉树自交不亲和与近交衰退机制，并准确进行子代父本鉴定和杂交亲本重建; 邵文豪等[14]认为高多态性和高累积排除概率的SSR位点适用于对油橄榄(Canarium oleosum)品种子代进行父本分析，‘城固32’具有一定的自交亲和性，这为品种建园时授粉品种的选择和配置提供重要依据；何勇凤等[15]准确找出了圆口铜鱼子1代(Coreius guichenoti)的父母本，为圆口铜鱼的家系管理、种群遗传管理和增殖放流效果评估提供了科学依据；余书平等[16]对开化县茶树种质资源进行父本分析，了解茶树种质资源的遗传背景。同时，利用CERVUS软件对子代模拟亲本鉴定在黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)[17]、鳙(Aristichthys nobilis)[18]、羊(Caprinae)[19]、黄喉拟水龟(Mauremys mutica)[20]、许氏平鲉(Sebastes schlegelii)[21]和唇䱻(Hemibarbus labeo)[22]等生物上有较多的报道。总的来说，亲本模拟分析主要用于分析亲本的遗传方式(花粉转播距离、自交不亲性)、后代群体遗传差异评估(遗传多样性、种群遗传管理、遗传背景、近交程度)、辅助杂交后代选择等方面。
茶树品种‘金牡丹’为“九五”国家科技攻关的一级优异茶树种质资源[23]，适制性广，制优率高，制乌龙茶香气馥郁芬芳，滋味醇厚甘爽，“韵味”显, 制红、绿茶花香显、味醇厚。本试验以42个福建茶树良种为候选父本对‘金牡丹’自然杂交后代进行分子鉴定，并调查其节间长度、叶片长度、叶片宽度等叶片性状，旨在分析‘金牡丹’自然杂交后代亲缘关系与遗传差异，为茶树品种选育提供参考。
1 材料和方法 1.1 材料2015年11月收取福建省茶树种质资源圃内‘金牡丹’成熟茶果，2016年1月播种。2016年11月选取生长正常的实生苗，与福建省茶树种质资源圃邻近种植，位于福建省农业科学院茶叶研究所二号山(27°12′58″ N，119°34′31″ E)。种植规格为行距1.5 m，株距0.3 m，按顺序编号JMD1~JMD65。2019年分别采集65个‘金牡丹’自然杂交后代和42个福建省茶树品种(福建省茶树种质资源圃内)的嫩叶，用液氮冷冻处理，于-70 ℃冰箱中保存备用(表 1)。
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表 1 供试材料 Table 1 Materials in test |
基因组DNA的提取 采用改进的CTAB法[24]提取茶树基因组DNA。采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用756-MC型紫外分光光度计测定OD260和OD280，检测茶树基因组DNA的纯度。
引物合成 参照Ma等[25]的引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息见表 2。
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表 2 SSR引物信息 Table 2 Sequences of 28 primer pairs |
PCR扩增和产物鉴定 PCR反应体系为: 双蒸水18.8 μL，2.5 μL 10×Buffer (Mg2+)，0.5 μL dNTP (10 mmol/L)，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Taq聚合酶0.2 μL (0.5 U)，模板DNA 1 μL。PCR反应于美国ABI-9600型扩增仪上进行，反应程序为: 94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性45 s，不同温度下退火60 s，72 ℃延伸75 s，共35次循环；最后72 ℃延伸10 min。反应产物于4 ℃保存。统一在反向引物(R)的5′段标记荧光(FAM/TAMRA), 由上海百力格生物科技有限公司合成。扩增产物0.5 μL，GeneScan™ 500 ROX™ 0.5 μL，HiDi 9 μL，混匀后使用ABI公司3730XL进行毛细管电泳。
叶片性状测量 测量17个‘金牡丹’自然杂交后代(父本模拟达到显著性)与40个福建良种的主要叶片性状，主要有第1~3叶芽稍的长度、第1~3节间长度、叶齿数、叶脉对数、第1~4叶片长度与宽度，每个性状调查重复5次。
1.3 数据处理采用ABI公司的GeneMapper 4.0软件，选择GeneScan™ 500 ROX™作为分子量标准，对每条扩增条带记录大小。使用Cervus 3.0[26]软件计算多态信息含量、期望杂合度、等位基因频率与非父排除概率等参数。利用SAS9.3进行叶片性状聚类。运用NTSYSpc 2.1对参试材料进行遗传距离计算，利用MEGA7进行UPGMA聚类分析，并利用网站https://itol.embl.de/进行图片优化。
1.4 亲子鉴定模拟分析使用Cervus 3.0软件进行亲子鉴定模拟分析，分别运行Simulation程序与Parentage Analysis程序中的paternity子程序，模拟10 000次亲子鉴定，candidate fathers的设置为42，候选亲本检测率为80%, 位点检测率为90%, 基因型判别错误率为0.01, 计算候选亲本基因型似然对数比(LOD)值和95%置信水平，根据LOD值判定亲子关系。对福建省农业科学院茶叶所审(鉴)定品种、65个‘金牡丹’自然杂交后代分别进行双亲模拟分析与单亲模拟分析。
2 结果和分析 2.1 遗传多样性分析对65个‘金牡丹’自然杂交后代与42个模拟亲本进行扩增，28个SSR位点的平均等位基因数6.86个(表 3)，其中，TM422位点上的等位基因数目最多(14个)，TM499和TM589最少(3个)，均满足利用SSR标记进行父本分析所需等位基因数要求。28个SSR位点的平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.540和0.583，变异范围分别为0.247~0.794和0.240~0.805。Ho与HE均值相近，表明茶树品种受选择及近交等因素的影响较小，平均杂合度较高, 等位基因在群体中分布较均匀。
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表 3 28对SSR引物遗传多样性与鉴定排除率 Table 3 Genetic diversity and exclusion rate of 28 SSR loci |
28个SSR位点的平均多态信息含量(PIC)为0.532, 其中，TM499位点最低(0.221)，TM262位点最高(0.778)。28个SSR位点具有丰富的多态性, 能够为研究提供足够的多态信息。
当双亲基因型皆未知时，单个SSR位点的非父排除概率(NE-1P)为0.551~0.972，均值0.793；当1个亲本基因型已知时，单个SSR位点的非父排除概率(NE-2P)为0.375~0.882，均值0.645；当双亲基因型已知时，单个SSR位点的非父排除概率(NE-PP)为0.187~0.793，均值0.485 (表 4)。
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表 4 18个茶树品种的亲子鉴定结果 Table 4 Paternity analysis result of 18 tea varieties |
依据PIC由高至低次累积计算28个SSR位点的排除概率，随着SSR位点数增加，累积排除概率增大(图 1)。对于单亲已知类NE-2P，基于前6个SSR位点累积排除概率0.975，基于前13个SSR位点累积排除概率0.999，而基于全部28个SSR位点累积排除概率接近1。因此，28对引物适合用于亲本鉴定分析。
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图 1 28个SSR位点的累积排除概率 Fig. 1 Cumulative exclusion probability of the 28 SSR loci |
从表 4可见，18个福建省农业科学院茶叶所审(鉴)定品种的亲子鉴定可分为2个类型，类型I真实亲本不在实验模拟亲本中，‘悦茗香’(母本为‘赤叶观音’)、‘早春毫’(母本为‘迎春’)、‘朝阳’(母本为‘崇庆枇杷茶’)未能找到显著性模拟亲本；类型II真实亲本在实验模拟亲本中，‘福云6号’、‘福云7号’、‘福云10号’、‘福云20号’和‘福云595’的真实亲本之一为‘福鼎大白茶’，另一真实亲本(‘云南大叶种’)未在42个模拟亲本中；‘黄奇’、‘春兰’、‘瑞香’、‘丹桂’、‘紫牡丹’的真实亲本之一分别为‘黄棪’、‘铁观音’、‘黄棪’、‘肉桂’、‘铁观音’，单一亲本鉴定模拟结果与真实亲本相一致；‘茗科1号’、‘金牡丹’真实亲本为母本(‘铁观音’)、父本(‘黄棪’)，双亲亲本模拟鉴定结果与真实亲本相一致；‘黄玫瑰’、‘黄观音’的真实亲本与模拟鉴定结果不完全一致，能准确模拟到其中之一亲本为‘黄棪’；‘九龙袍’模拟亲本之一为‘肉桂’，且达到显著性水平，‘九龙袍’真实父本未知，推测‘肉桂’为‘九龙袍’真实父本。类型II中的12个品种能找到真实亲本，准确率80%，因此，模拟亲本结果较为准确。
65个‘金牡丹’自然杂交后代中的25个子代的LOD值均大于0，且置信度均达到95%，说明25个‘金牡丹’自然杂交后代均能准确地找到显著性模拟父本。后代中模拟父本为‘茗科1号’的有14个, 占56%，其次模拟父本为乌龙茶品种的有‘丹桂’、‘黄棪’和‘黄奇’，模拟父本为绿茶品种的有‘福鼎大白茶’、‘福云6号’和‘福云7号’ (表 5)。
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表 5 65个茶树品种的父本 Table 5 Male parent of 65 tea varieties |
为进一步解读‘金牡丹’自然杂交后代的遗传信息，将模拟父本结果标注在107个参试材料遗传距离聚类图上(图 2)。‘金牡丹’自然杂交后代的显著性模拟父本(天蓝色)为‘黄棪’、‘茗科1号’、‘丹桂’、‘福鼎大白茶’与‘福云6号’等，为福建省主要种植乌龙茶和绿茶品种，模拟父本来源广泛，遗传多样性丰富。‘金牡丹’为‘铁观音’ (母本)与‘黄棪’ (父本)的人工杂交后代，大多数‘金牡丹’自然杂交后代受双亲的影响，分别与祖母、祖父、母本、模拟父本聚类在一起，形成5个类群。5个类群分别为‘铁观音’ (祖母)与‘金牡丹’自然杂交后代类群(草绿色)、‘黄棪’ (祖父)与‘金牡丹’自然杂交后代类群(深蓝色)、‘金牡丹’(母本)与‘金牡丹’自然杂交后代类群(红色)、‘茗科1号’ (模拟父本)与‘金牡丹’自然杂交后代类群(金黄色)、‘丹桂’ (模拟父本)与‘金牡丹’自然杂交后代类群(浅紫色)；JMD51、JMD53模拟父本为‘丹桂’，与‘丹桂’ (模拟父本)形成一个类群。少部分‘金牡丹’自然杂交后代未与亲本聚类在一起, JMD44、JMD45模拟父本为‘福云6号’，遗传聚类分别未与‘金牡丹’ (母本)、‘福云6号’ (父本)聚类在一起，推测JMD44、JMD45遗传信息受双亲共同作用影响。另外, JMD9、JMD3未能模拟到显著性父本，从遗传距离看分别与‘白芽奇兰’、‘杏仁茶’遗传距离较近，推测JMD9、JMD3的真实父本与‘白芽奇兰’、‘杏仁茶’亲缘关系较近，且遗传信息偏向未知父本。
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图 2 遗传距离聚类图 Fig. 2 Cluster diagram of genetic distance |
将107份试验材料按来源与是否找到显著性父本进行分类，分为4个类群进行遗传多样性分析。从表 6看出，参试材料的Shannon信息指数为0.828~ 1.245，类群的遗传多样性为：类群D > 所有材料 > 类群C > 类群B > 类群A，说明65个‘金牡丹’自然杂交后代降低参试材料整体的遗传多样性水平，且遗传多样性略低于福建省茶树品种。Ho和He分别为0.497~0.587和0.481~0.625。其中，类群C的Ho与He相当，属于基因型的分布就越接近于平衡状态，说明65个‘金牡丹’自然杂交后代群体基因型相对稳定；类群A的Ho大于He，说明存在杂合子过剩，推测类群A基因型杂合性较高；类群D的Ho小于He，说明存在杂合子缺失现象，福建省茶树品种间遗传交流较少。
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表 6 4个群体的遗传多样性 Table 6 Genetic diversity of 4 groups |
基于叶片长宽、叶齿数、叶脉对数等性状，利用SAS软件对父本模拟显著性的‘金牡丹’自然杂交后代与福建主要茶树品种进行叶片性状聚类(图 3)。模拟父本为‘福云6号’、‘福云7号’的‘金牡丹’自然杂交后代JMD44、JMD45、JMD47都聚类在类群I中，且类群I中主要为‘福云6号’、‘福云7号’、‘福云10号’、‘福云20号’等绿茶品种，推测JMD44、JMD45、JMD47叶片主要性状偏向于模拟父本，可优先进行绿茶、白茶加工品质鉴定。
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图 3 叶片性状最大距离法聚类图 Fig. 3 Cluster dendrogram based on leaf characters by maximum distance |
类群III内JMD51、JMD53模拟父本为‘丹桂’，叶片性状与‘丹桂’的母本‘肉桂’聚类在一起，叶片性状更偏向‘肉桂’(祖母)。JMD61模拟父本为‘黄奇’, 叶片性状更偏向‘黄棪’(祖母)。JMD59模拟父本为‘黄棪’，叶片性状与‘黄棪’聚类在一起，叶片性状偏向于模拟父本‘黄棪’。MD24、JMD26、JMD29、JMD55与JMD27、JMD41的模拟父本分别为‘茗科1号’与‘黄棪’，叶片性状与‘黄棪’聚类在一起，叶片性状更偏向于‘黄棪’(祖父、模拟父本)，可优先进行乌龙茶加工品质鉴定。
类群IV中JMD56、JMD2模拟父本为‘茗科1号’，叶片性状与‘茗科1号’的母本‘铁观音’聚类在一起，叶片性状更偏向‘铁观音’(祖母)，可优先进行乌龙茶加工品质鉴定。
3 结论和讨论 3.1 影响模拟父本筛选的因素本试验选择的候选父本为42个福建省鉴定审(鉴)定品种，引物28对，在95%置信水平下为25个自然杂交后代找到模拟父本，显著性模拟父本的概率为38.4%，与其他植物的模拟父本概率(37.67%[10]、34.5%[11]、36.2%[14])相近。影响模拟父本筛选的因素较多，耿瑞静等[27]认为无效等位基因的存在是影响亲子鉴定结果准确性的首要因素；祝招玲等[28]研究表明无效等位基因是影响亲权鉴定准确性的基础因素；朱克诚等[17]认为无效等位基因与等位基因的缺失导致低质量的DNA序列是影响准确性的主要原因。基因分型错误也会导致子代与亲本的错配，一方面是实验操作包括PCR扩增、电泳等诸多因素影响, 使得条带扩增不清导致分型错误, 另一方面是数据处理过程中的人为分型错误[29]; 亲子关系鉴定试验中应尽可能降低标记基因型在扩增和判定时的错误率，有些微卫星基因座在扩增时可能产生无效基因，导致某些等位基因无法出现，本可能为杂合子的个体可能出现为纯合子，这会影响鉴定的准确性[30]；进行排除法亲本分析时, 群体中候选亲本数量不宜大于100，否则很难为大多数子代确定亲本来源[31]。本试验认为，无效等位基因是不可避免的，只能尽可能的降低；候选父本的数量不是越多越好，而是模拟父本代表性越强越好，在理论上，选择相同母本与亲缘关系相近的品种作为父本，杂交后代可能为基因型一致的或极其相似的, 因此，增加亲缘关系相近的品种作为模拟父本数量会影响到软件鉴定的结果；同时构建核心种质与确定核心引物有利于提高模拟亲本鉴定结果准确性。
3.2 ‘金牡丹’自然杂交后代鉴定与辅助筛选本研究中父本模拟分析达到显著性的‘金牡丹’自然杂交后代一共有25个，其中8个模拟父本为‘茗科1号’的自然杂交后代种植4 a后，树势衰弱或自然死亡，不能满足叶片性状调查的需要，可能由于‘茗科1号’与‘金牡丹’杂交组合属于近亲杂交，部分杂交后代生长势弱。对父本模拟达到显著性的‘金牡丹’自然杂交后代需进一步分析。
模拟父本相同的‘金牡丹’自然杂交后代，亲缘关系聚类可能有差异。JMD59、JMD27、JMD41模拟父本同为‘黄棪’，叶片性状与‘黄棪’相似，但亲缘关系聚类显示有所不同，JMD59与‘金牡丹’(母本)亲缘关系更接近，JMD41与‘黄棪’(模拟父本)亲缘关系更接近，JMD27与‘茗科1号’亲缘关系更接近。JMD51、JMD53与JMD46的模拟父本相同，JMD51、JMD53与‘丹桂’(模拟父本)亲缘关系更接近，叶片性状更接近‘肉桂’(祖母)；JMD46与‘金牡丹’(母本)亲缘关系更接近，叶片性状更接近福云系列绿茶品种，叶片性状遗传可能来自于‘丹桂’(模拟父本)的未知父本。
模拟父本相同的试验材料，叶片性状聚类可能有差异。JMD24、JMD26、JMD29、JMD55与MD2、JMD56模拟父本同为‘茗科1号’，JMD24、JMD26、JMD29、JMD55的叶片性状聚类与‘黄棪’(祖父)在一起，后代可能与‘黄棪’(祖父)品质性状相似; MD2、JMD56的叶片性状聚类与‘铁观音’(祖母)在一起，后代可能与‘铁观音’(祖母)品质性状相似。
因此，‘金牡丹’自然杂交后代在相同模拟父本的情况下，叶片性状可以分别与父本、母本、祖父、祖母相似。进行初步辅助选种，选种目标为早生优质绿茶品系的可以选择JMD32、MD44、JMD45、JMD46和JMD47进行鉴定；选种目标为闽北高香岩茶乌龙茶品系可以选择JMD51和JMD53进行鉴定；选种目标为闽南‘铁观音’乌龙茶品系可以选择MD2和JMD56进行鉴定；选种目标为与‘黄棪’相似的早生高香乌龙茶类型可以选择JMD24、JMD26、JMD27、JMD29、JMD41、JMD55和JMD59。
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