2023, Vol. 31
番石榴(Psidium guajava)又称芭乐、喇叭番石榴、鸡屎(矢)果等，为桃金娘科番石榴属常绿小乔木，原产于从墨西哥南部到南美洲北部的热带地区，现广泛种植于热带和亚热带地区[1]。番石榴的种植面积和产量仅次于芒果(Mangifera indica)、香蕉(Musa spp.)和柑橘(Citrus reticulata)，并称四大重要水果作物，在我国福建、海南、广东等地均有种植[2–3]。番石榴果实富含维生素C、维生素A、矿物质元素钙、磷、铁和镁等人体所需营养成分，营养价值高[2, 4]。番石榴植株的其他部位如根、茎皮、种籽和叶也具有一定的药用价值。番石榴根水提取物中的单宁对金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌和大肠杆菌具有良好的抑菌作用，效果优于庆大霉素和氯霉素[5]。番石榴茎皮水提取物对机械或化学诱导疼痛的白化大小鼠均具有镇痛效果[6]。番石榴种籽多糖通过诱导细胞凋亡抑制PC-3前列腺癌细胞增殖[7]。番石榴叶含有挥发油、多酚类化合物和多糖等活性成分，具有抗癌、抗糖尿病、抗氧化、止泻、抗菌、降脂和保肝等多种功效[8]。因此，番石榴的综合应用价值高。
番石榴在自然情况下花量大、挂果多，需要通过疏花疏果达到丰产稳产和果大质优的要求[9]。番石榴幼果含有金丝桃苷、鞣花酸和杨梅苷等多酚类化合物，具有体外抗氧化及降糖活性，可作为天然抗氧化剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂进行开发利用[10]。目前对于番石榴花的研究主要在调控花期产果方面。钟思强等[11]通过水肥调控促夏梢抽生的方法生产番花果，提高了果实的营养品质。李平等[12]调查了番石榴的成花习性，阐明花朵着生处枝梢及叶片的理化性质变化，为人工调控果实成熟期提供理论依据。Silva等[13]报道了番石榴叶和花的浸出液可作为传统中药用于治疗腹泻。关于番石榴植株多个部位如叶、果实的挥发性成分及多酚类化合物的生物活性和组分分析已有较多报道，但关于花的挥发性成分研究则暂未见报道。植物花中含有多种次级代谢产物，如黄酮类、有机酸和挥发油等成分，具有抗氧化、抗菌和抗黑色素生成等多种对人体有益的生物效应[14–16]。随着植物挥发性成分研究的深入及芳香疗法的推广，植物挥发油对人体的积极作用逐渐引起关注。不同植物挥发油在成分和功效方面有较大差异，研究挥发油成分有助于进一步了解挥发性成分发挥功效的物质基础。以香茅醇为主要成分的玫瑰(Rose rugosa)精油具有镇静催眠的作用[17]。以柠檬醛为主成分的柠檬草(Cymbopogon citratus)精油可发挥抗炎作用[18]。丁香(Eugenia caryophyllata)挥发油中的丁香酚是其抗惊厥的药效物质基础[19], 丁香油中的石竹烯则是其发挥镇定作用的主要成分[20]。含笑(Michelia figo)花挥发油的主要成分为橙花叔醇(76.37%)[21]，橙花叔醇具有抗氧化、抗炎和抑制肿瘤细胞增殖等多种活性[22–23]。因此，挥发油的成分分析对其加工利用有重要意义。
挥发性成分的种类和含量在不同植物种类、品种、生长环境等影响下差异明显，因此，本文选取10个番石榴品种花为研究对象，采用HS-GC-MS (顶空-气质联用)技术，检测其挥发性成分及相对含量, 明确不同品种番石榴花挥发性成分组成，为番石榴花在医药、化工和食品领域的应用提供理论基础。
1 材料和方法 1.1 材料和仪器选择福建省农业科学院亚热带农业研究所国家闽台特色作物种质资源圃内的10个番石榴品种，树龄4~5 a，分别为‘翠玉’、‘帝王’、‘本土’ (漳州本地种)、‘红叶’、‘粉红蜜’、‘珍珠’、‘西瓜’、‘水蜜’、‘木瓜’和‘红宝石’。于2021年5月7—11日采摘处于盛花期的花朵，每个品种挑选树冠大小和长势较为接近的植株4~5株，按照东南西北中每个方向随机选取10~15个花朵。
TriPlus 300顶空自动进样器(美国赛默飞公司); Trace1300-TSQ9000气质联用仪器(美国赛默飞公司)。
1.2 方法顶空条件 取1.00 g番石榴鲜花，转移至20 mL顶空螺纹瓶，待测。设置传输线温度135 ℃、腔温92 ℃、炉温85 ℃，瓶静态平衡时间8 min，压力平衡时间0.2 min，进样时间0.2 min。
GC-MS检测 气相条件：气相色谱柱为TG-5SILMS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；进样口温度225 ℃，分流比12:1，载气为He (99.999%), 体积流量1.2 mL/min。升温程序为柱温箱起始温度50 ℃, 保持5 min，然后以5 ℃/min升温到160 ℃, 再以10 ℃/min升温到250 ℃，保持5 min，总时间为45 min。质谱条件：EI离子源，离子源温度300 ℃，接口温度280 ℃。质量扫描范围为30~550 amu。
定性和定量分析 将GC-MS采集得到的扫描质量图谱中的每个色谱峰与NIST标准质谱库进行匹配性检索, 再结合文献和人工谱图分析最终确定各化学成分；挥发性物质的定量分析采用峰面积归一法计算各成分相对百分含量。参照王华夫等[24]的方法计算成分相似率。
1.3 数据分析运用SPSS 22.0软件中的聚类分析和主成分分析对数据进行统计分析，采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，图表制作采用Excel 2007和Originpro 8.6完成。
2 结果和分析 2.1 挥发性物质的组成采用HS-GC-MS对10个品种番石榴花中的挥发性成分进行检测与分析，相对含量在0.1% (含)以上的挥发性物质共43种，其中单萜类8种、倍半萜类26种、酯类2种、醇类3种、醛类2种和烃类2种，相对含量占挥发性成分总量的91.19%~ 98.20% (表 1)。10种番石榴花的共有挥发性成分有10种，分别为单萜类4种(α-蒎烯、D-柠檬烯、桉叶油醇、α-松油醇)，倍半萜类5种[雪松烯、β-石竹烯、2-epi-反式-β-石竹烯、1-异丙基-4, 7-二甲基-1, 2, 3, 5, 6, 8a-六氢萘、1, 6-二甲基-4-(1-甲乙基)-1, 2, 3, 4, 4a, 7-六氢萘]和醛类1种(苯甲醛)。不同品种番石榴花也检测到其特有的香气成分, ‘翠玉’特有β-卡地烯，‘帝王’特有3-己烯-1-醇和乙酸橙花酯，‘粉红蜜’特有(-)-β-蒎烯、(4aS, 9aR)-2, 4a, 5, 6, 7, 9a-六氢-3, 5, 5, 9-四甲基-1H-苯并环庚烯和(-)-异丁香烯，‘木瓜’特有α-愈创木烯，‘红宝石’特有佛术烯、α-甜没药烯、τ-杜松醇乙酸酯和正二十烷。
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表 1 10个品种番石榴花挥发性成分组成 Table 1 Volatile components in flower of ten varieties of Psidium guajava |
不同品种番石榴花挥发性成分均以萜类为主, 含量范围89.77%~97.40%。其中‘本土’、‘红叶’、‘粉红蜜’、‘珍珠’、‘西瓜’、‘水蜜’等品种主要以单萜类为主，含量为59.79%~76.17%，‘珍珠’以单萜烃类为主(81.34%)、‘本土’、‘红叶’、‘西瓜’和‘水蜜’以单萜含氧衍生物为主，占比达52.45%~84.24%，‘粉红蜜’单萜烃类含量占比(50.21%)与单萜含氧衍生物(49.79%)接近；‘翠玉’、‘帝王’和‘红宝石’主要以倍半萜类为主，含量范围54.97%~67.71%，其中倍半萜烃类含量占99.65%~100%，几乎不含倍半萜含氧衍生物；‘木瓜’番石榴花的单萜类与倍半萜类含量接近，分别为48.01%和41.76%。酯类、醛类、醇类和烃类等成分在各品种番石榴花中含量均较低, 此4类化合物总含量为0.63%~2.25% (表 2)。
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表 2 番石榴花的挥发性成分含量 Table 2 Relative contents of volatile components of Psidium guajava flowers |
不同品种番石榴花的主要挥发性成分组成及含量有较大差异，以相对含量可达20%以上的成分包括β-石竹烯、桉叶油醇、D-柠檬烯和β-罗勒烯等4种成分为主要成分进行品种间挥发性成分比较分析。从图 1可见，‘翠玉’、‘帝王’、‘水蜜’以β-石竹烯和桉叶油醇为主要成分，相对含量可达57.00%~ 71.00%；‘本土’以桉叶油醇和D-柠檬烯为主要成分，相对含量为67.12%；‘红叶’、‘西瓜’、‘粉红蜜’以桉叶油醇和β-罗勒烯为主要成分，相对含量可达60.98%~72.90%；‘木瓜’、‘红宝石’以β-罗勒烯和β-石竹烯为主要成分，相对含量可达57.45%~59.71%；D-柠檬烯为‘珍珠’的最主要成分，含量达57.54%。
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图 1 10个品种番石榴花的主要挥发性成分 Fig. 1 Main volatile components in flowers of 10 Psidium guajava varieties |
D-柠檬烯和β-罗勒烯的相对含量在不同番石榴花品种间的差异最为明显。除‘珍珠’和‘本土’外，其余8个品种中D-柠檬烯的相对含量均不超过1%, 且‘珍珠’中的D-柠檬烯相对含量(57.54%)是‘本土’ (23.08%)的2.49倍。在相同的检测条件下，‘翠玉’、‘帝王’、‘本土’和‘珍珠’未检测到β-罗勒烯，‘水蜜’中则仅含0.51% β-罗勒烯，其余品种的β-罗勒烯相对含量范围为22.40%~34.24%。β-石竹烯、D-柠檬烯和桉叶油醇在10个品种中均可检测到，含量分别为10.32%~44.64%、0.37%~57.54%和13.94%~ 49.91%。β-石竹烯、桉叶油醇、D-柠檬烯和β-罗勒烯相对含量最高的品种分别为‘帝王’、‘水蜜’、‘珍珠’和‘西瓜’。
2.3 挥发性成分相似率比较将10个品种的挥发性成分进行相似率分析(表 3)。‘翠玉’和‘帝王’、‘粉红蜜’和‘红叶’、‘粉红蜜’和‘西瓜’、‘西瓜’和‘红叶’、‘木瓜’和‘红宝石’等品种的相似率均大于0.95，分别为0.984、0.959、0.977、0.967和0.965，相似率极高，香型复配性好。‘水蜜’和‘本土’、‘水蜜’和‘红叶’、‘西瓜’和‘木瓜’、‘红宝石’和‘粉红蜜’间的相似率为0.8~0.9，分别为0.892、0.884、0.841和0.880，这4个品种对香气相似率较高，香型复配性较好。相似率为0.7~0.8的品种对共有10组，涵盖除‘珍珠’品种外的9个品种，除‘珍珠’外，每个品种至少与其他一种具有相似的成分组成，香型复配性一般。在10个品种中，‘珍珠’的香气组成最为独特，‘珍珠’与‘本土’香气相似率为0.675, 与其余8种的为0.192~0.303，说明‘珍珠’的香气类型明显不同于其他9个品种。
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表 3 不同品种番石榴花挥发性成分的相似率 Table 3 Similarity rate of volatile components in Psidium guajava flowers among different cultivars |
将10个品种番石榴花的挥发性成分进行系统聚类分析(图 2)。当横坐标距离为25时，可以将10个品种分为2类，‘珍珠’为一类，余下9个品种归类；‘珍珠’挥发性成分以D-柠檬烯为主，其他品种以β-石竹烯、桉叶油醇或β-罗勒烯为主且D-柠檬烯相对含量较低。当距离为10时，10个品种分为4类，‘珍珠’仍独立为I类；‘翠玉’和‘帝王’归为II类，该组品种中β-石竹烯为相对含量最高的成分且均不含β-罗勒烯；‘水蜜’和‘本土’归为III类，该组品种中桉叶油醇同为主要成分，且β-罗勒烯相对含量极低；‘红叶’、‘粉红蜜’、‘西瓜’、‘木瓜’和‘红宝石’归为IV类，该组品种大部分以β-石竹烯、桉叶油醇和β-罗勒烯为主要成分且D-柠檬烯相对含量低。当距离为5时，10个品种分为5类，其他分组保持不变，IV类细分为2类，‘木瓜’和‘红宝石’归为一类, 该组β-石竹烯和β-罗勒烯相对含量较高；‘红叶’、‘粉红蜜’和‘西瓜’归为一类，该组桉叶油醇相对含量较高。随着横坐标距离的变化，10个番石榴品种的分类不同，但‘珍珠’始终单独为一类，明显区别于其他9个品种，该结果与挥发性成分相似率分析结果一致, 但聚类分析可更加直观看出番石榴的具体分类。
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图 2 10个品种番石榴花的CA树状图 Fig. 2 Cluster analysis dendrogram of 10 varieties of Psidium guajava flower |
利用SPSS软件的因子分析对10个品种番石榴花挥发性成分(相对含量 > 0.30%)进行主成分分析，得到主成分的特征值和特征向量(表 4)。结果表明，前3个主成分的方差贡献率分别为27.697%、23.282%、14.798%，累积总方差65.778%，说明这3个主成分包含了番石榴花香气的绝大部分信息。因此，本实验选择前3个主成分进行分析。载荷系数的绝对值越大，表明该指标与其对应的主成分之间的联系紧密程度越大。由表 5可见，对第1主成分贡献较大的成分主要是α-蒎烯和1-异丙基-4, 7-二甲基-1, 2, 3, 5, 6, 8a-六氢萘，负影响较大的是β-罗勒烯和β-长叶蒎烯；对第2主成分贡献较大的成分是3-蒈烯和D-柠檬烯；对第3主成分贡献较大的成分为香树烯。
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表 4 主成分的特征值和贡献率 Table 4 Eigenvalue and contribution rate of 3 principal components |
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表 5 主成分载荷矩阵 Table 5 Principal component loading matrix |
依据10个品种挥发性成分的相对含量，第1、第2和第3主成分的特征值及19种挥发性物质的载荷值计算出主成分1值(PC1)、主成分2值(PC2)和主成分3值(PC3)，并以PC1为x轴，PC2为y轴, PC3为z轴作主成分3D散点图(图 3)。10个品种可分为4类，‘翠玉’和‘帝王’为一类，‘本土’和‘水蜜’为一类，‘红宝石’、‘西瓜’、‘红叶’、‘粉红蜜’和‘木瓜’为一类，‘珍珠’为一类。该分类结果与聚类分析距离为10时的分类结果一致。
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图 3 10个品种番石榴花主成分散点图 Fig. 3 PCA scatter diagram of 10 varieties of Psidium guajava flower |
植物的挥发性成分(精油)是一类分子量较小的次级代谢产物，存在于多种植物[桃金娘科(Myrtaceae)、姜科(Zingiberaceae)、龙脑香科(Dipterocarpaceae)、芸香科(Rutaceae)、樟科(Lauraceae)、木兰科(Magnoliaceae)等]的根、叶、花、果等器官中，其中花果的经济价值最高，研究其香气成分, 有利于优化品种特性，提高经济效益[25]。植物精油成分复杂，主要有烃、醇、醛、酯、酮、酸、酚和萜类等挥发性成分，同一植株部位的挥发性成分的种类、组成比例和特征成分在不同品种间明显不同, 对精油的开发及利用有较大影响[15]。番石榴的根、茎、叶、果均具有良好的药用价值，而番石榴花的应用研究则极为欠缺。本研究选取10个品种番石榴盛花期的花朵为研究对象，采用HS-GC-MS的方法对10个品种进行挥发性成分检测与分析，结果表明，番石榴花挥发性成分丰富，以萜烯类化合物为主，但种间存在差异，主要挥发性成分组成和含量也有较大区别。
从化合物分类上，番石榴花的萜类化合物中单萜类和倍半萜类的相对含量在89%以上，酯类、醇类、醛类、烃类化合物含量极少。该结果与番石榴叶片挥发油组成较为类似，番石榴叶挥发性成分中萜烯类化合物相对含量达95%以上[26]。但该结果与番石榴果实香气相比，则有较大区别，不同品种番石榴始熟果以萜烯类物质为主要香气成分，相对含量范围77.13%~94.85%；而完熟果则以醛类物质为主要香气成分，相对含量为82.56%~96.79%[27]。有研究表明，野菊花(Chrysanthemum indicum)[28]、金钗石斛(Dendrobium nobile)[29]、腊梅(Chimonanthus praecox)[30]等的部分品种均以萜烯类化合物为主要香气成分，其相对含量分别为86.36%~98.37%、83.25%~94.93%和89.43%~90.79%，与番石榴花接近。
从化合物种类上，在相同的检测条件下，‘红宝石’和‘粉红蜜’化合物种类最多，‘红叶’次之，‘珍珠’最少。研究表明，植物花挥发性成分主要是萜类和苯环型化合物，常见的有β-罗勒烯、石竹烯、柠檬烯、α-蒎烯、苯甲醛和苯甲醇等[31]。番石榴叶挥发油以广藿香烯为主要成分，不同番石榴果实以3-己烯醛、己醛或石竹烯为主要成分[27]。本研究中大多数番石榴花挥发性成分以单萜类为主，并以D-柠檬烯、桉叶油醇或β-罗勒烯为主要成分，其中‘本土’、‘红叶’、‘水蜜’的单萜含氧衍生物含量较高, 主要来源于桉叶油醇，因此香气更为浓郁[32]；‘翠玉’、‘帝王’和‘红宝石’则以倍半萜类为主，几乎不含倍半萜含氧衍生物，并以β-石竹烯含量最高，香气偏淡雅[33]。
从品种间的相似性上，不同品种间挥发性成分组成及含量不同，但也存在一定的相似性。对10个品种番石榴的花挥发性成分及主要成分进行对比分析，可将10个品种分为4类。‘珍珠’香气独特，独为一类；‘翠玉’和‘帝王’有12种相同的挥发性成分，含量接近，相同成分的总含量可达86.72%~ 92.04%，香气相似度高，归为一类；‘水蜜’和‘本土’有15种相同的挥发性成分，含量有一定的区别, 但主成分含量接近，归为一类；‘木瓜’、‘红宝石’、‘粉红蜜’、‘西瓜’和‘红叶’中相同的挥发性成分有13种，5个品种间的成分相似率为0.771~0.967，相似率高于0.9的品种组合数达50%，归为一类。PCA对10个品种番石榴花的分类结果与CA为10时的分类一致，说明2种方法均可对番石榴花进行分类，但是根据CA值不同可以有多种分类结果，而PCA根据得分仅获得1种侧重于信息贡献影响力综合评价的分类结果[34]。按照成分对各品种进行划分, 有利于将差异明显的各类品种区别利用，对同类品种则可作为相同/相似资源，提高利用率。
从品种间的差异性上，为确认引起品种间挥发性成分差异的主要化合物，采用主成分分析法提取出3个主成分，涵盖了65.78%的样品信息，基本可以说明样品间的差异，结果表明，引起10个品种番石榴花挥发性成分差异的主要化合物有7种，分别为α-蒎烯、β-罗勒烯、D-柠檬烯、3-蒈烯、香树烯、β-长叶蒎烯和1-异丙基-4, 7-二甲基-1, 2, 3, 5, 6, 8a-六氢萘。植物花香的影响因素有很多，如兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)、金钗石斛和铁皮石斛(D. officinale)等3种石斛花的挥发性成分差异显著，分别以乙酸异辛酯、β-石竹烯和α-蒎烯为主要成分[33]。桃金娘科植物嘉宝果(Myrciaria cauliflora)花在不同发育期挥发性成分也明显不同，花苞期和初花期以β-蒎烯为主，盛花期时α-蒎烯含量最高，末花期时D-柠檬烯含量最高[35]。此外，外界环境对植物的挥发性成分也有一定影响，例如盛花期的金钗石斛花一天内不同时间点挥发性物质的种类和数量存在明显差异，香气释放量在9:00时最高, 15:00最低[36]。本试验所用鲜花于同一时间采自相同花期、树龄和栽培条件的番石榴植株，且采用相同的试验方法，因此，引起番石榴花成分差异的主要因素可能是品种间遗传物质不同。
植物挥发性成分来源丰富、成分复杂、多靶点并且在干预人体机能上有显著优势，如因其分子量小、脂溶性好，易被人体吸收，具有速效潜力；在使用过程具有芳香气息，达到身心愉悦的效果；成分丰富，药理作用多样，可能降低副作用，具有良好的开发潜力。‘帝王’和‘翠玉’可作为β-石竹烯的良好来源。β-石竹烯有介于丁香和松节油之间的萜烯味，具有镇痛、局麻、抗炎、抗焦虑和抑郁等药理功效[37–38]，可应用于以舒缓情绪为目的的芳香疗法。β-石竹烯对金葡菌有较强的抑制作用，最低抑菌浓度仅(3±1.0) µmol/L，且抑制真菌活性优于卡那霉素[39]，可用于空气抑菌，达到净化空气的效果。‘本土’、‘红叶’和‘水蜜’中桉叶油醇含量丰富。桉叶油醇有樟脑特有的清凉味道，具有黏液溶解和解痉作用，可用于呼吸道疾病治疗[40]，桉叶油醇也具有一定的抑菌活性，同样可应用于环境抑菌[33]。‘珍珠’中D-柠檬烯含量极为丰富，超过50%，且其他成分含量均不超过15%，成分种类最少，是D-柠檬烯的优质来源。D-柠檬烯具有类似柑橘和柠檬(Citrus limon)的香味，并具有预防和抑制肿瘤活性[37], 在化工和医药方面有较好的利用前景。植物的挥发性成分除了对人体具有一定的药用价值，这些物质还可能与植物的生理活动如授粉、趋避害虫等相关, 具有一定的农药研发价值[32]。如β-罗勒烯具有草香、花香并伴有橙花油气息，对害虫有毒害作用, 可做绿色杀虫剂利用[41]，在‘西瓜’和‘木瓜’中含量均较为丰富。除了4种主要成分外，番石榴花中雪松烯的含量也较为丰富，雪松烯具有檀香木香气并带有花香，可用于香水调配。
不同品种番石榴花挥发性成分存在多样性，本研究结果明确了各品种番石榴花挥发性成分组成、优势成分和特征成分，可为番石榴花资源的开发利用提供理论指导。
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