云南重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)是重楼属的多年生草本植物，又名滇重楼，与七叶一枝花(P. polyphylla var. chinensis)共同作为中药重楼的法定基原，收载于《中国药典》^[1]。云南重楼主产于我国西南地区，随着重楼栽培产业的发展，因其优良的药材质量，成为主要的栽培种源^[2]。中药材DNA条形码研究表明云南重楼种内遗传变异丰富, ITS序列存在明显的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)^[3–4]，并由此划分为2种基因型(YN-Ⅰ和YN-Ⅱ)。为了避免2种基因型并存导致真伪鉴定结果出现“假阴性”，开发了同时鉴别2种基因型的多重PCR鉴别体系^[4]。

然而，目前尚无报道云南重楼ITS序列的SNP现象是否会引起植株在化学成分构成上的分化，进而在种内衍生出不同的化学型？研究这一问题对于丰富云南重楼种质资源多样性具有重要意义，并可能发现具有筛选价值的分子遗传标记。同时，根据2018年国家药品监督管理局发布的《中药材生产质量管理规范》(征求意见稿)的要求，中药材的优良品种选育，禁用人工选育的多倍体或者单倍体品种、种间杂交品种和转基因品种。因此，从云南重楼野生种群的自然变异类群中优选良种，将是未来重楼育种的主要途径，探索ITS区的SNP现象与药材质量的关联性将为实现这一目标提供重要参考。

本研究对云南重楼YN-Ⅰ和YN-Ⅱ型植株进行田间观察，发现形态学特征并无明显的分化^[4]。为进一步了解是否会引起植株化学型的分化，进而影响药材质量，本研究收集了云南重楼不同产区的样品，根据其ITS序列的SNP特征进行基因型的鉴别，然后对不同基因型的7种甾体皂苷类成分(重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、薯蓣皂苷)进行测定，分析基因型与甾体皂苷构成的相关性，探讨其对药材质量的影响，为云南重楼的质量控制和良种选育提供科学依据。

云南重楼样本共37份，分别于2019—2021年采自云南、贵州、四川3省的主产区，根据采集年月编号凭证标本，样本详细信息见(表 1)。样品经成都中医药大学尹鸿翔副教授进行原植物鉴定，根据李恒系统，均符合云南重楼的特征(图 1)；再经ITS序列同源性比对鉴定为云南重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)，凭证标本藏于成都中医药大学标本馆(CDCM)。

表 1(Table 1)

表 1 云南重楼样品 Table 1 Samples of Paris polyphylla var. yunnanensis 序号 No. 编号 Code 基因型 Genotype 采集地点 Collection location 生境 Habitat 凭证标本 Voucher 1 Ⅰ-1 YN-Ⅰ 贵州兴义市七舍镇 Qishe Town, Xingyi City, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190702 2 Ⅰ-2 YN-Ⅰ 贵州兴义市马岭镇 Maling Town, Xingyi City, Guizhou 石灰岩灌丛 Limestone bushwood 20190703 3 Ⅰ-3 YN-Ⅰ 贵州兴义市郑屯镇 Zhengtun Town, Xingyi City, Guizhou 石灰岩灌丛 Limestone bushwood 20190704 4 Ⅰ-4 YN-Ⅰ 贵州长顺县广顺乡 Guangshun Township, Changshun County, Guizhou 阔叶林 Broad-leaved forests 20200601 5 Ⅰ-5 YN-Ⅰ 贵州长顺县新寨乡 Xinzhai Township, Changshun County, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200602 6 Ⅰ-6 YN-Ⅰ 贵州长顺县摆塘乡 Baitang Township, Changshun County, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200603 7 Ⅰ-7 YN-Ⅰ 四川石棉县草科乡 Caoke Township, Shimian County, Sichuan 灌丛 Bushwood 20200501 8 Ⅰ-8 YN-Ⅰ 四川石棉县田湾乡 Tianwan Township, Shimian County, Sichuan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200502 9 Ⅰ-9 YN-Ⅰ 四川石棉县安顺乡 Anshun Township, Shimian County, Sichuan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200501 10 Ⅰ-10 YN-Ⅰ 云南宣威县龙场乡 Longchang Township, Xuanwei County, Yunnan 阔叶林 Broad-leaved forest 20190601 11 Ⅰ-11 YN-Ⅰ 云南宣威县来宾乡 Laibin Township, Xuanwei County, Yunnan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190602 12 Ⅰ-12 YN-Ⅰ 云南宣威县板桥乡 Banqiao Township, Xuanwei County, Yunnan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190603 13 Ⅰ-13 YN-Ⅰ 云南宣威县西泽乡 Xize Township, Xuanwei County, Yunnan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190604 14 Ⅰ-14 YN-Ⅰ 贵州六枝县郎岱乡 Langdai Township, Liuzhi County, Guizhou 阔叶林 Broad-leaved forest 20200604 15 Ⅰ-15 YN-Ⅰ 贵州省六枝县箐口乡 Qingkou Township, Liuzhi County, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200605 16 Ⅰ-16 YN-Ⅰ 四川盐源县梅雨镇 Meiyu Town, Yanyuan County, Sichuan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20210601 17 Ⅰ-17 YN-Ⅰ 四川盐源县卫城镇 Weicheng Town, Yanyuan County, Sichuan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20210602 18 Ⅰ-18 YN-Ⅰ 四川盐边县渔门乡 Yumen Township, Yanbian County, Sichuan 阔叶林 Broad-leaved forest 20210603 19 Ⅰ-19 YN-Ⅰ 四川省盐边县白坡乡 Baipo Township, Yanbian County, Sichuan 灌丛 Bushwood 20210604 20 Ⅱ-1 YN-Ⅱ 贵州兴义市则戎乡 Zerong Township, Xingyi City, Guizhou 石灰岩灌丛 Limestone bushwood 20190705 21 Ⅱ-2 YN-Ⅱ 贵州兴义市顶效乡 Dingxiao Township, Xingyi City, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190706 22 Ⅱ-3 YN-Ⅱ 贵州兴义市敬南乡 Jingnan Township, Xingyi City, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190707 23 Ⅱ-4 YN-Ⅱ 贵州长顺县广顺乡 Guangshun Township, Changshun County, Guizhou 阔叶林 Broad-leaved forest 20200610 24 Ⅱ-5 YN-Ⅱ 贵州长顺县新寨乡 Xinzhai Township, Changshun County, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200611 25 Ⅱ-6 YN-Ⅱ 四川会理县凤营乡 Fengying Township, Huili County, Sichuan 阔叶林 Broad-leaved forest 20190605 26 Ⅱ-7 YN-Ⅱ 四川会理县太平镇 Taiping Town, Huili County, Sichuan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190606 27 Ⅱ-8 YN-Ⅱ 四川德昌县永朗乡 Yonglang Township, Dechang County, Sichuan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20190607 28 Ⅱ-9 YN-Ⅱ 贵州安顺市幺铺镇 Yaopu Town, Anshun City, Guizhou 石灰岩灌丛 Limestone bushwood 20200612 29 Ⅱ-10 YN-Ⅱ 贵州安顺市大山镇 Dashan Town, Anshun City, Guizhou 石灰岩灌丛 Limestone bushwood 20200613 30 Ⅱ-11 YN-Ⅱ 贵州安顺市宋旗镇 Songqi Town, Anshun City, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200614 31 Ⅱ-12 YN-Ⅱ 云南宣威县龙场乡 Longchang Township, Xuanwei County, Yunnan 阔叶林 Broad-leaved forests 20210605 32 Ⅱ-13 YN-Ⅱ 云南宣威县来宾乡 Laibin Township, Xuanwei County, Yunnan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20210606 33 Ⅱ-14 YN-Ⅱ 云南宣威县西泽乡 Xize Township, Xuanwei County, Yunnan 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20210607 34 Ⅱ-15 YN-Ⅱ 贵州六枝县郎岱乡 Langdai Township, Liuzhi County, Guizhou 阔叶林 Broad-leaved forest 20200606 35 Ⅱ-16 YN-Ⅱ 贵州六枝县箐口乡 Qingkou Township, Liuzhi County, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200607 36 Ⅱ-17 YN-Ⅱ 贵州六枝县中寨乡 Zhongzhai Township, Liuzhi County, Guizhou 针阔混交林 Coniferous-broadleaf mixed forest 20200608 37 Ⅱ-18 YN-Ⅱ 贵州六枝县岩脚乡 Yanjiao Township, Liuzhi County, Guizhou 石灰岩灌丛 Limestone bushwood 20200609

表 1 云南重楼样品 Table 1 Samples of Paris polyphylla var. yunnanensis

图 1(Fig. 1)

图 1 云南重楼。A: YN-Ⅰ型；B: YN-Ⅱ型。 Fig. 1 Paris polyphylla var. yunnanensis. A: YN-Ⅰ genotype; B: YN-Ⅱ genotype.

Legend Micro 21R离心机(美国Thermo); BSA 124S分析天平(Sartorius科学仪器有限公司); MK-10干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)；PCR仪(杭州博日科技有限公司)；DDY-12电泳系统(北京六一仪器厂)；激光成像仪Typhoon 7000 (通用电气医疗集团生命科技部)；微量紫外-分光光度仪(Thermo Nanodrop 2000)。Agilent technologies 1200series高效液相色谱仪(DAD检测器)，色谱柱COSMOSIL Cholester RP-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，BP121S电子分析天平(万分之一)，ULUP-I-10T优普超纯水机(成都超纯有限公司)，SB-5200D超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司)，SHZ-DⅢ型循环水式多用真空泵(上海一科仪器有限公司)，BCD-202D型冰箱(北京海信电器)，DTF-100A型手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，DZKW-4型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司), 101-3-BS型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

琼脂糖(广州赛国生物科技有限公司)，Goldview Ⅰ型核酸染色剂(北京索莱宝科技有限公司)，Easy Taq DNA聚合酶，10×EasyTaq Buffer (Mg²⁺ plus) (北京全式金生物技术有限公司), DNA Marker-B, dNTPs Mixture Solution (生工生物工程股份有限公司)，植物组织DNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)，α-高聚淀粉酶(思科生物科技有限公司)。色谱纯乙腈(TEDIA)，超纯水，分析纯乙醇为(Fisher), 重楼皂苷I (批号：111590-201604，纯度93.6%)、Ⅱ (批号: 111591-201103, 纯度93.4%)、Ⅵ (批号：111592-201604, 纯度98.0%)、Ⅶ (批号: 111593-201604, 纯度94.0%)均购自于中国食品药品检定研究院；薯蓣皂苷(批号：19057-60-4)购于上海甄准生物科技有限公司。重楼皂苷H (纯度98.3%)、Ⅴ (纯度97.1%)由本课题组制备^[5]。

参照张开元等^[4]的方法，采用ITS序列通用性引物ITS-4/ITS-L对37份样本进行扩增，扩增产物送成都擎科梓熙生物科技有限公司测序，利用Megalign软件对测序结果进行校对与分析，找出具有稳定差异的SNP位点，然后进行基因分型。

采用李朋等^[5]的方法，对37份样品的7种甾体皂苷含量进行测定，平行测定3次，取平均值，完成定性、定量对比分析。根据《中国药典》一部重楼项下含量测定标准^[1]进行合格率评价。

采用SPSS 25.0基于平均联结(组间)谱系图法对样本的甾体皂苷构成特征进行聚类分析(CA)，采用SIMCA-P 15.0软件进行主成分分析(PCA)。

采用Megalign软件对37份样本的ITS序列进行校对，扩增的ITS序列包含ITS1、5.8s rDNA和ITS2等3个片段。SNP有40个位点，其中ITS1区有SNP位点18个，5.8s rDNA区1个，ITS2区21个。40个位点均为双等位多态性，其中发生碱基转换的有32个，碱基颠换的有8个(表 2)。依据SNP位点多样性可以划分为2种基因型，分别编号为YN-Ⅰ和YN-Ⅱ，其中YN-Ⅰ型有19份(1~19号)，YN-Ⅱ型18份(20~37号)。

表 2(Table 2)

表 2 云南重楼ITS区的SNP位点特征 Table 2 SNP characteristics of ITS of P. polyphylla var. yunnanensis 基因型 Genotype SNP位点 SNP locu 分区 Region 9 10 34 36 42 55 62 93 127 131 180 ITS1 YN-I T G C T C T A C G A T YN-II C T T C T C G T A T C 183 193 197 201 211 212 223 YN-I G A C C A T C YN-II A G T T C C T 395 5.8S rDNA YN-I T YN-II C 411 412 413 439 443 462 471 476 482 500 520 ITS2 YN-I G C G G A T G T C C G YN-II A T A A G C A C T T T 521 526 527 594 596 599 604 612 615 622 YN-I T G G A G A A G C T YN-II G C A G C G G T T C 灰色底纹为碱基颠换，其余为碱基转换。 Gray shading indicate base transversion and the rest indicates base transition.

表 2 云南重楼ITS区的SNP位点特征 Table 2 SNP characteristics of ITS of P. polyphylla var. yunnanensis

以7种甾体皂苷对照品的进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积(A)为纵坐标，绘制对照品的标准曲线，拟合回归方程。7种甾体皂苷色谱峰面积的RSD为0.316 5%~1.261 4%，表明方法的精密度良好; 重复性试验的RSD为0.613 6%~2.115 5%，表明重复性良好；且对照品和供试品溶液中7种甾体皂苷在24 h内基本稳定；7种甾体皂苷的平均加样回收率为99.71%~99.60%，均符合测定要求。

37份样品的测定结果见表 3，7种甾体皂苷对照品、YN-Ⅰ型和YN-Ⅱ型的HPLC特征见图 2。根据2020年版《中国药典》一部重楼项下规定，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ之和不少于0.6%评价合格率。从表 3可见，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H和薯蓣皂苷等6种甾体皂苷在云南重楼中广泛分布，但重楼皂苷V较稀少，37份样品中仅有8份出现。除样品1、2、3、4、5、6、24、28、31和34外，其余27个样品均达到《中国药典》的含量标准，整体合格率达72.97%，其中YN-Ⅰ型的合格率为68.42%, YN-Ⅱ型为77.78%。YN-Ⅰ型的药典指标成分总含量平均为1.070%，YN-Ⅱ型为0.93%; YN-Ⅰ型的7种甾体皂苷总含量平均为1.65%，YN-Ⅱ型为1.32%。以基因型为影响因素，进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，结果表明YN-Ⅰ型和YN-Ⅱ型的药典指标成分含量无显著差异(P > 0.05)，但7种甾体皂苷总含量有显著差异(P < 0.05)，说明2类基因型的甾体皂苷构成存在一定的分化。

表 3(Table 3)

表 3 样品的甾体皂苷成分含量 Table 3 Steroid saponin contents in samples 序号 No. 编号 Code 重楼皂苷Ⅶ Polyphyllin Ⅶ /% 重楼皂苷H Polyphyllin H /% 重楼皂苷VI Polyphyllin VI /% 重楼皂苷II Polyphyllin II /% 薯蓣皂苷 Dioscin /% 重楼皂苷I Polyphyllin I /% 重楼皂苷V Polyphyllin V /% I+II+Ⅶ[1] /% 总皂苷 Total /% 1 Ⅰ-1 0.061±0.002 0.050±0.001 0.039±0.001 0.124±0.003 - 0.162±0.004 - 0.346±0.010 0.435±0.011 2 Ⅰ-2 0.275±0.003 0.048±0.002 0.108±0.003 0.141±0.004 - 0.062±0.002 - 0.478±0.012 0.633±0.014 3 Ⅰ-3 0.193±0.003 0.112±0.002 0.082±0.001 0.148±0.002 - 0.150±0.003 - 0.491±0.009 0.686±0.011 4 Ⅰ-4 0.050±0.001 0.466±0.003 0.437±0.003 - - - - 0.050±0.001 0.952±0.007 5 Ⅰ-5 0.189±0.002 0.581±0.004 0.384±0.002 - - - - 0.189±0.002 1.153±0.008 6 Ⅰ-6 0.074±0.001 0.326±0.002 0.536±0.004 - - - - 0.074±0.001 0.936±0.007 7 Ⅰ-7 0.487±0.004 0.065±0.002 - 0.424±0.004 - 0.102±0.002 - 1.013±0.010 1.078±0.012 8 Ⅰ-8 0.116±0.003 0.104±0.002 0.037±0.002 1.214±0.012 0.708±0.010 0.902±0.009 0.227±0.002 2.233±0.026 3.308±0.030 9 Ⅰ-9 0.682±0.005 0.053±0.002 0.041±0.002 0.272±0.005 - 0.338±0.004 - 1.292±0.016 1.386±0.018 10 Ⅰ-10 0.694±0.007 0.034±0.001 0.043±0.003 0.409±0.004 - 0.284±0.003 - 1.388±0.017 1.465±0.018 11 Ⅰ-11 0.674±0.009 0.032±0.002 0.033±0.001 0.064±0.002 - - 0.182±0.003 0.739±0.012 0.985±0.017 12 Ⅰ-12 0.447±0.008 - - 0.190±0.005 - 0.102±0.003 - 0.738±0.016 0.738±0.016 13 Ⅰ-13 0.245±0.007 0.054±0.002 0.063±0.003 0.061±0.002 0.133±0.003 0.414±0.005 - 0.721±0.017 0.970±0.022 14 Ⅰ-14 0.211±0.004 0.036±0.001 0.057±0.002 0.144±0.003 2.187±0.023 0.360±0.003 - 0.715±0.012 2.994±0.036 15 Ⅰ-15 0.289±0.005 0.048±0.002 0.041±0.002 0.281±0.006 1.701±0.013 1.229±0.007 0.051±0.002 1.799±0.020 3.640±0.037 16 Ⅰ-16 0.073±0.002 0.096±0.003 0.184±0.005 0.362±0.009 0.125±0.004 0.837±0.011 - 1.272±0.027 1.676±0.030 17 Ⅰ-17 0.236±0.005 0.091±0.002 0.057±0.002 0.507±0.010 0.238±0.004 0.304±0.005 - 1.047±0.022 1.433±0.028 18 Ⅰ-18 0.107±0.003 0.203±0.005 0.108±0.004 1.861±0.017 0.081±0.002 1.355±0.012 - 3.323±0.036 3.715±0.043 19 Ⅰ-19 0.345±0.009 0.430±0.006 0.233±0.005 1.036±0.009 0.164±0.004 1.054±0.015 - 2.434±0.038 3.261±0.048 20 Ⅱ-1 0.556±0.010 0.169±0.005 0.094±0.002 - - 0.372±0.006 - 0.928±0.018 1.190±0.023 21 Ⅱ-2 0.231±0.006 0.168±0.004 0.094±0.002 0.163±0.003 - 0.437±0.005 - 0.830±0.016 1.092±0.020 22 Ⅱ-3 0.444±0.008 0.095±0.002 0.059±0.001 0.276±0.004 0.056±0.002 0.928±0.010 - 1.649±0.023 1.859±0.027 23 Ⅱ-4 0.166±0.004 0.480±0.009 0.223±0.005 0.268±0.006 0.131±0.005 0.910±0.012 0.057±0.002 1.344±0.027 2.235±0.042 24 Ⅱ-5 0.123±0.003 0.339±0.005 0.266±0.004 - - 0.215±0.004 - 0.339±0.007 0.943±0.016 25 Ⅱ-6 0.282±0.005 0.134±0.003 0.151±0.002 0.069±0.001 - 0.580±0.009 0.083±0.001 0.932±0.017 1.299±0.021 26 Ⅱ-7 0.433±0.007 0.202±0.003 0.172±0.002 - 0.124±0.002 0.283±0.003 - 0.715±0.012 1.213±0.017 27 Ⅱ-8 0.928±0.011 0.280±0.002 0.086±0.001 0.191±0.002 0.894±0.007 - - 1.119±0.014 2.379±0.023 28 Ⅱ-9 0.226±0.003 0.088±0.002 0.053±0.002 0.074±0.001 - 0.266±0.004 - 0.566±0.010 0.707±0.012 29 Ⅱ-10 0.307±0.003 0.301±0.002 0.085±0.001 0.102±0.002 - 0.608±0.004 - 1.017±0.010 1.404±0.012 30 Ⅱ-11 0.291±0.002 0.137±0.001 0.089±0.001 0.086±0.001 0.111±0.002 0.833±0.004 - 1.210±0.008 1.546±0.011 31 Ⅱ-12 0.111±0.001 0.032±0.001 0.027±0.002 0.135±0.002 0.090±0.001 0.197±0.002 - 0.442±0.007 0.591±0.009 32 Ⅱ-13 0.253±0.002 0.046±0.001 0.028±0.001 0.103±0.002 0.064±0.002 0.388±0.003 - 0.744±0.008 0.881±0.011 33 Ⅱ-14 0.225±0.002 0.030±0.001 0.034±0.001 0.201±0.003 0.071±0.001 0.224±0.003 - 0.650±0.009 0.786±0.011 34 Ⅱ-15 0.339±0.003 0.042±0.001 0.047±0.001 - 0.599±0.007 0.159±0.002 - 0.498±0.006 1.186±0.014 35 Ⅱ-16 0.222±0.002 0.117±0.001 0.112±0.002 0.298±0.003 - 1.184±0.012 0.057±0.002 1.704±0.019 1.990±0.020 36 Ⅱ-17 0.141±0.002 0.135±0.002 0.115±0.001 0.127±0.002 - 0.525±0.004 0.041±0.001 0.794±0.008 1.084±0.011 37 Ⅱ-18 0.079±0.002 0.111±0.002 0.102±0.001 0.214±0.002 - 0.921±0.007 0.034±0.001 1.214±0.011 1.460±0.014

表 3 样品的甾体皂苷成分含量 Table 3 Steroid saponin contents in samples

图 2(Fig. 2)

图 2 云南重楼和对照品HPLC图。A: 7种甾体皂苷对照品; B: YN-Ⅰ型; C: YN-Ⅱ型; 1: 重楼皂苷Ⅶ; 2: 重楼皂苷H; 3: 重楼皂苷VI; 4: 重楼皂苷II; 5: 薯蓣皂苷; 6: 重楼皂苷I; 7: 重楼皂苷V。 Fig. 2 HPLC chromatograms of P. polyphylla var. yunnanensis and reference substance. A: 7 Steroidal saponins; B: YN-Ⅰ; C: YN-Ⅱ; 1: Polyphyllin Ⅶ; 2: Polyphyllin H; 3: Polyphyllin VI; 4: Polyphyllin II; 5: Dioscin; 6: Polyphyllin I; 7: Polyphyllin V.

采用SPSS 25.0软件对37批样品的甾体皂苷构成特征进行聚类分析，构建树状聚类图(图 3)。当相似性距离为5~10时，37个样品聚为4支，其中Ⅰ-14、Ⅰ-15聚为第1支(A)；Ⅰ-8、Ⅰ-18、Ⅰ-19聚为第2支(B)；Ⅱ-8独立成第3支(C)；其余31个样品聚为第4支(D)。第4支成员众多，当相似性距离 < 5时明显分为2个亚支，Ⅰ-16、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-11、Ⅱ-16和Ⅱ-18聚为一亚支(D-1)，其中YN-Ⅰ型1个和YN-Ⅱ型5个；其余25个样品聚为另一亚支(D-2)，包括YN-Ⅰ型13个和YN-Ⅱ型12个。可见，不同基因型的样品可以聚类到同一分支中(如D-1和D-2)。

图 3(Fig. 3)

图 3 基于甾体皂苷特征的聚类图 Fig. 3 Dendrogram based on steroid saponin characters

产地对甾体皂苷构成特征具有一定程度的影响，A支的Ⅰ-14、Ⅰ-15均来自贵州六枝；Ⅱ-8是唯一的单独产地样品(四川德昌)，独立成C支；Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6和Ⅱ-5虽然分属2个基因型，但均来自贵州长顺而聚在一起。

采用SIMCA-P 15.0软件对37份样品的甾体皂苷含量进行主成份分析(PCA)，标定了3个主成份, 分别绘制了基于2个主成分的二维得分图(图 4: A)和基于3个主成分的三维投影图(图 4: B)。从图 4可见，37个样品的甾体皂苷成分构成特征虽无明显的基因型分化，但仍然表现出一定程度的影响，图 3中聚在一起的Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6和Ⅱ-5等4份样品在图 4: A中出现了分化，前三者仍然聚为一簇，但和Ⅱ-5明显分离。另外，YN-Ⅰ样品的离散度较高，而YN-Ⅱ样品的聚集度更好，其中Ⅰ-8号和Ⅰ-18号样品在Hotelling’s T2 (95%)下甚至表现为强异常值；这一特征也进一步在图 4: B的三维投影图中得到体现。

图 4(Fig. 4)

图 4 主成分分析。A: 二维得分图; B: 三维投影图。 Fig. 4 Principal component analysis. A: Two dimensional drawing; B: Three dimensional drawing.

同时，地理位置对甾体皂苷构成特征同样表现出一定影响，在图 4: A中，Ⅰ-1、Ⅰ-2和Ⅰ-3号样品(均来自贵州兴义)明显聚集，Ⅰ-4、Ⅰ-5和Ⅰ-6号样品(均来自贵州长顺)明显聚集，和图 3的聚类分析结果一致；Ⅱ-12、Ⅱ-13和Ⅱ-14 (均来自云南宣威)明显聚集，在图 4: B中，单一产地样品Ⅱ-8 (四川德昌)明显偏离其他样品，也和图 3的聚类结果一致。

重楼栽培种的种内甾体皂苷特征被相继报道^[5–6], 对云南重楼的种内变异研究涉及了分子遗传标记、形态学特征及其与甾体皂苷类成分的关联性^[7–11], 然而遗传多样性与甾体皂苷特征的相关性却未见报道。本研究首次报道了云南重楼ITS序列的SNP特征和甾体皂苷类成分的相关性。结果表明，重楼皂苷Ⅴ的分布稀少，与吴钰颖等^[12]的报道相似，这应该是重楼皂苷V没有纳入《中国药典》含量指标的原因之一。2个基因型在《中国药典》合格率上有一定差异，YN-Ⅱ型 > YN-Ⅰ型，但是7种甾体皂苷总含量上YN-Ⅰ型却显著大于YN-Ⅱ型。二者在这两项指标的不同反差提示，YN-Ⅱ型在甾体皂苷合成与累积方面个体差异小，更加稳定一致。PCA分析表明，YN-Ⅱ样品的聚集度更好，YN-Ⅰ样品的离散度更高，也印证了上述推测。究其原因，虽然绝大多数SNP存在于非编码区(ITS1和ITS2)，但5.8S rDNA区的SNP却可能会影响核糖体的转运功能，进而影响甾体皂苷累积的稳定性。这是否对已知的甾体皂苷合成途径及关键酶基因的表达产生影响，如甲羟戊酸途径(MVA)^[13–14]、鲨烯合酶(SQS)^[15]、鲨烯环氧酶(SE)^[16]、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)^[17]、环阿屯醇合酶(CAS)^[18]、细胞色素P450单加氧酶^[19]等, 还需要进一步验证。另外，参考华重楼基因组结构^[20]对2类基因型的叶绿体基因组进行分析，探讨光合作用效率是否影响皂苷合成也是一个探索方向，在云南重楼良种选育的遗传标记筛选中具有独特价值。

相对于基因型，地理位置对甾体皂苷构成特征具有更明显的影响，出现了3类现象：(1) 产地相同的样品聚在一起，甚至单独产地样品独立成一支(如Ⅱ-8)；(2) 不同产地样品聚在一起；(3) 相同产地样品不聚在一起。究其原因，甾体皂苷作为次生代谢产物，其合成与累积也受到环境因子的调控, 相同的地理位置往往具有相似的生态环境，导致相似的化学特征，因此聚在一起，特殊生境的植株甚至独立成支。同理，不同产地的植株若小生境相似，也可能聚在一起；反之，产地相同但是小生境差异较大，植株化学特征则必然分化^[21]。这提示，地理位置及其小生境对于甾体皂苷构成具有明显的影响，为保证重楼药材质量稳定，一定要选择生态适宜区并保持种植地的小生境一致。

综上，云南重楼YN-Ⅰ型和YN-Ⅱ型的甾体皂苷构成特征存在一定程度分化，但药典指标成分仍无显著性差异，二者在生产、监管和临床使用上不必区分对待。YN-Ⅱ型植株甾体皂苷累积的个体差异小，其SNP标记对于云南重楼的良种选育具有明显意义。虽然YN-Ⅰ型的合格率较低，但是平均总皂苷含量更高，在重楼总皂苷的生产中可作为优良的提取原料。