2022, Vol. 30
肉桂酸-4-羟化酶(C4H，EC 1.14.13.11)属于细胞色素P450单氧化酶(CYP73)亚家族，被认为是木质素合成通路中最为保守的蛋白家族[1]，由约500个氨基酸组成球蛋白，中心位置含有1个由α-螺旋包裹的血红素环，其上分布着活性中心氨基酸残基以及底物结合区域，是酶高效催化功能的基础[2]。C4H基因的数量在不同物种间存在较大差异，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、欧芹(Petroselinum crispum)和黄芩(Scutellaria pekinensis)中仅有1个C4H[3-5], 在喜树(Camptotheca acuminata)和甘蓝型油菜(Brassica napus)中至少存在2个C4H基因[6], 而在水稻(Oryza sativa)、毛果杨(Populus trichocarpa)中分别包含3和4个C4H[7]。有研究表明，C4H在植物中的转录丰度和蛋白质活性直接影响植物中木质素的生物合成量[8]。欧芹中C4H基因在木质化程度高的花梗中表达丰富，而在叶片中不表达[3]。拟南芥C4H基因也在木质化程度较高的组织中表达最为丰富[9], C4H基因下调表达时，其木质素含量显著降低，并且会抑制PAL的表达活性[10]。抑制烟草(Nicotiana tabacum)中的C4H基因表达，其茎秆中的木质素含量显著降低[11]。另外，C4H基因的表达可受到干旱和温度胁迫、植物激素信号刺激等多种因素的诱导[12]。
竹材具有韧性好、强度高等特点，在木材供给不足的情况下，作为重要的替代品发挥着重要作用，其相关研究一直备受关注[13]。毛竹(Phyllostachys edulis)是我国最重要的竹种之一，现有林地面积4.68×106 hm2，占全国竹林面积的72.96%[14]。毛竹基因组的发布，为从分子水平研究竹材的形成与调控奠定了坚实基础。木质素是竹材的重要组成成分，其含量对竹材机械强度具有重要影响，其生物合成与调控已成为竹材形成的研究热点之一。目前，已有对包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)与漆酶(LAC)等毛竹木质素生物合成酶基因的研究报道[15-18]。C4H催化肉桂酸形成对-香豆酸，是木质素合成途径第二步反应的调控酶，虽然已从毛竹中克隆了1个C4H基因[19]，但尚缺乏从基因组水平对毛竹C4H的系统了解。本研究以毛竹为对象，进行C4H基因的全基因组鉴定，在综合生物信息学分析的基础上，基于转录组和qPCR分析了C4H基因在不同组织以及不同高度笋中的表达模式，并初步探究干旱胁迫和外源GA3处理下PeC4Hs的表达特征，以期为深入研究毛竹C4H基因的功能提供依据。
1 材料和方法 1.1 材料在江西南昌选择生长良好的毛竹林地(28°45' 50" N，115°45'36" E，海拔394.0 m)，采集不同木质化程度的毛竹笋(高度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 m)，选择代表性样品(第15节上部)，迅速放入液氮中，后存储于-80 ℃冰箱中，用于RNA提取。
将毛竹种子播种于泥炭∶蛭石=7∶3的基质中, 置于人工气候室(温度25 ℃，相对湿度80%, 光照16 h/黑暗8 h)中培养，实生苗生长2个月，选择长势一致的幼苗分成2组，每组不少于20株，一组用20% PEG-6000溶液浇灌模拟干旱处理，另一组用100 μmol/L赤霉素(GA3)溶液喷洒叶片，每组不少于3个生物学重复。分别在处理0、1、2、4和8 h时收集叶片和根系，液氮处理后保存于–80 ℃冰箱，用于RNA提取。
1.2 方法毛竹C4H基因的鉴定 以模式物种水稻和拟南芥的C4H基因为参考序列，利用TBtools软件[20]中的Blast工具在毛竹基因组数据[21]中进行同源序列查找。运用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的BLASN和BLASTP功能分别对所获得的序列进行比对分析，并对基因编码的氨基酸序列用SMART在线软件(http://smart.embl.de/)进行保守结构域分析。最终获得毛竹C4H基因成员，并进行重新命名。
PeC4Hs的生物信息学分析 利用ExPASy提供的在线软件ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)对毛竹C4H编码蛋白的理化性质进行分析。使用在线软件PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/)，对毛竹C4H基因上游启动子序列(2 000 bp)中的顺式调控元件进行分析预测[22]。从Phytozome V. 12数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/)获得拟南芥、水稻、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)和二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等植物的C4H氨基酸序列，基于MEGA X内置的Clustal W对这些氨基酸序列进行多重序列比对分析，并采用邻接法生成系统进化树[23]，其中校验参数选用bootstrap method设置为1 000次重复，氨基酸替换模型选择p-distance，其他各参数为默认值。
PeC4Hs的表达分析 依据本实验室前期获得的毛竹鞭、根、笋、叶片、鞘和芽等26个组织的转录组数据[21]，筛选其中PeC4Hs在不同组织中的表达量数据(fragments per kilobase per million, FPKM)，对每个FPKM取以2为底数的对数(Log2)，用TBtools软件绘制表达谱热图。采用试剂盒(天漠生物)法提取样品的总RNA，用反转录试剂盒(TaKaRa RNA)合成cDNA第一条链。利用Primer Premier 5.0软件设计6个PeC4Hs编码区的特异性定量引物，由北京博迈德生物技术有限公司合成(表 1)。以上述cDNA为模板，用PeNTB作为内参基因[24], 反应体系和程序参照Roche Light Cycler® 480 SYBR Green试剂盒，qPCR实验在qTOWER2.2系统上进行，用2–ΔΔCT法[25]分析基因的相对表达量。
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表 1 实时定量PCR引物 Table 1 Primers used in qPCR |
从毛竹基因组数据库中共鉴定出6个C4H基因，编码蛋白均具有完整的C4H保守结构域，分别命名为PeC4H1~PeC4H6。对PeC4Hs蛋白进行分析表明(表 2)，长度为501~564 aa，分子量为57.04~ 63.43 kDa，理论等电点为8.53~9.36，蛋白不稳定系数为43.61~51.94，均属于不稳定蛋白。氨基酸组成和跨膜结构预测分析表明，PeC4Hs都含有20种氨基酸和2个跨膜结构，非极性氨基酸含量均在50%以上，其中缬氨酸和亮氨酸含量最高，均属于易形成跨膜结构的氨基酸，其余各种氨基酸含量差异不大。亚细胞定位预测表明，6个PeC4Hs均定位在内质网上，经修饰加工后，作为分泌蛋白发挥其作用。
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表 2 PeC4Hs的理化性质 Table 2 Physical and chemical characteristics of PeC4Hs |
PeC4Hs的编码区长度为1 506~1 695 bp，对应的基因序列全长为2 425~4 581 bp。多重序列比对分析表明(图 1)，PeC4Hs与拟南芥的AtC4H1 (AM887619.1)和水稻的OsC4H1 (AB207105.1)相似, 都含有细胞色素P450 (CYP450)家族蛋白特有的保守结构域和特征基序[26]，如富含脯氨酸的酶正确定向铰链基序“PPGPXXXP”、C-端血红素结合域“PFGVGRRSCPG”和苏氨酸结合槽基序“AAIETT”、“E-R-R”三联体以及特征性底物识别位点(substrate recognition sites, SRSs)[27]，表明PeC4Hs在进化上是相对保守的。另外，这些C4H的SRSs中少数氨基酸略有差异，但在N-端和C-端存在明显的差异，尤其是N端的膜锚定片段上，PeC4H3和PeC4H4有1个延长的N端，会导致膜拓扑结构改变，进而会影响蛋白质之间的相互作用，最终将代谢通量转移到苯丙烷途径的不同分支上[28]。
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图 1 毛竹与拟南芥、水稻的C4H氨基酸序列比对。黑色方框: 细胞色素P450蛋白保守域; ▲: ERR三联体; 下划线: 底物识别位点。 Fig. 1 Alignment of C4H amino acid sequences among Phyllostachys edulis, Oryza sativa and Arabidopsis thaliana. Black rectangle: Conserved domains of cytochrome P450 proteins; ▲: ERR triad; Underline: Substrate recognition sites (SRS). |
为明确PeC4Hs间的进化关系，预测其潜在功能，利用毛竹(PeC4Hs)、水稻(OsC4Hs)、玉米(ZmC4Hs)、高粱(SbC4Hs)、二穗短柄草(BdC4Hs)和拟南芥(AtC4H1)的氨基酸序列构建了系统进化树(图 2)。结果表明，6物种的17个C4H成员可分成2个大的分支(Class Ⅰ和Class Ⅱ)，分别包含4和2个PeC4Hs，并且出现两两聚在一起的现象，这可能与毛竹进化史上发生过基因组复制和基因家族扩张事件有关[29]。除拟南芥只有1个C4H成员外，其他5物种的C4H成员在2个分支中均有分布，且多数分布在分支Ⅰ中，毛竹中与拟南芥C4H亲缘关系最近的是PeC4H1/2，其可能与AtC4H1有相似的功能，在木质素的生物合成过程中起重要作用[9]。
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图 2 不同植物基于C4H氨基酸序列的系统进化树。Pe: 毛竹; Sb: 高粱; Zm: 玉米; Bd: 二穗短柄草; Os: 水稻; At: 拟南芥。 Fig. 2 Phylogenetic tree of different plants based on amino acid sequences of C4H. Pe: Phyllostachys edulis; Sb: Sorghum bicolor; Zm: Zea mays; Bd: Brachypodium distachyon; Os: Oryza sativa; At: Arabidopsis thaliana. |
基因的组织特异性表达一定程度上能反映其发挥作用的位置，利用转录组数据对PeC4Hs在毛竹不同组织中的表达模式进行分析(图 3)。结果表明，各PeC4Hs的表达模式存在一定的差异，总体来讲PeC4Hs在根部的表达水平较高，但在芽中的表达水平较低，在不同发育阶段的笋中，基部的表达高于中部和尖部。进一步分析表明，毛竹Ⅰ类C4H成员整体表达水平高于Ⅱ类成员，特别是分支Ⅰ中的PeC4H1和PeC4H2在各组织的相对表达量均较高，且表达量变化不大，可能作为组成型基因在毛竹整个生长发育中都发挥着重要作用。PeC4Hs在不同组织的表达差异，反映了不同PeC4Hs在毛竹生长发育过程中的生物学功能存在一定的差异，对毛竹木质化过程可能发挥着重要作用。
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图 3 PeC4Hs在26个组织中的表达分析 Fig. 3 Expression analysis of PeC4Hs in twenty-six tissues |
C4H是木质素合成通路的关键酶，参与次生细胞壁形成和木质化的过程[9]。采用qPCR技术检测PeC4Hs在不同木质化程度笋中的表达模式(图 4)。结果表明，6个PeC4Hs在不同高度笋中均呈现差异表达，随着笋高度的增加，整体表现出先下调后上调的变化，其中PeC4H1和PeC4H2的表达量在6.0 m笋中达到最高，其余4个PeC4Hs均在4.0 m的笋中表达量最高。进一步分析表明，PeC4Hs在发育前期(0~2.0 m)和发育后期(8.0 m)的笋中均呈现相对较低的表达水平，这与毛竹笋在4.0~6.0 m时的快速木质化变化一致[17]。
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图 4 PeC4Hs在不同高度笋中的表达分析。*: P < 0.05; **: P < 0.01。 Fig. 4 Expression analysis of PeC4Hs in different height shoots. *: P < 0.05; **: P < 0.01. |
对PeC4Hs的起始密码子上游2 000 bp的序列进行分析，结果表明，每条启动子序列中除包含大量真核生物启动子的基本转录调控元件TATA-box和CAAT-box外，还存在多个顺式作用元件序列位点，包括35S启动子元件ASF，MYB、MYC转录因子结合的顺式作用元件，低温胁迫响应元件LTR, 干旱胁迫响应元件MBS，光响应元件G-box和Box4, 赤霉素响应元件TATC-box、P-box和GARE-motif, 生长素响应元件TGA-element, 茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif，脱落酸和水杨酸响应元件ABRE、TCA-element等(图 5)。由此推测，PeC4Hs的启动子可能在空间表达过程中受到非生物胁迫的调控并参与多种植物激素的响应，进而对毛竹C4H基因的转录表达起着不同程度的调控作用。
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图 5 PeC4Hs基因启动子顺式作用元件分析 Fig. 5 Analysis of cis-acting elements in the promoter sequences of PeC4Hs |
qPCR结果表明，随干旱时间的延长, PeC4Hs在叶中总体呈现下调的表达趋势(图 6: A), 但不同基因成员间又存在差异，如PeC4H1/2在处理1 h内表达量无显著变化，分别在处理后8和4 h达到最低; PeC4H3/4在干旱处理1 h时的表达量已显著降低, 而后维持在相对较低的水平；PeC4H5/6则是在下调表达过程中出现波动变化。而根中PeC4H1/2/5/6的表达显著下调，基本是逐渐降低, 而PeC4H3/4的表达量则是在1 h内显著上调，之后迅速下降并维持在相对稳定的水平，但均显著高于对照。PeC4Hs通过表达变化响应了干旱胁迫，表明可能在抵御非生物胁迫中发挥重要的作用。
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图 6 PeC4Hs在干旱胁迫(A)和GA3处理(B)下的相对表达量。*: P < 0.05; **: P < 0.01。 Fig. 6 Expression of PeC4Hs under drought (A) and GA3 (B) treatments. *: P < 0.05; **: P < 0.01. |
100 μmol/L的GA3处理后，叶片中PeC4H3/6在处理1 h内表达量显著上调(图 6: B)，之后又逐渐降低；PeC4H5则随处理时间的延长表达量逐渐上升, 在8 h时达到最高；PeC4H4在叶中的表达量无显著变化。而在根中PeC4Hs的表达量变化明显, PeC4H1/3/4的表达量显著下调，且维持在较低水平; PeC4H2/5的表达量在2 h时显著上调，4 h时最高, 1和8 h的表达量均低于对照。这表明，PeC4Hs对GA3信号刺激的响应存在一定的差异，根中的变化较为显著，推测PeC4Hs倾向于在根中表达，进一步说明PeC4Hs在根中对GA3响应更为敏感。
3 结论和讨论C4H是苯丙烷代谢途径的第二个关键酶，催化反式肉桂酸的苯环C4位羟基化生成p-香豆酸，能够为木质素、类黄酮以及芳香族化合物的合成等多条次级代谢支路提供前体物质，在植物各组织中均具有很高的活性[30]。本研究从毛竹中鉴定出6个PeC4Hs，均具有完整的保守结构域和相同的基序，亚细胞定位均在内质网上，这对PeC4Hs形成准确的高级结构和与内质网外膜正确结合具有重要意义[28]。氨基酸序列分析表明，PeC4Hs含有丰富的底物识别位点，其中SRS1、SRS2和SRS3结合底物的脂肪链，SRS5和SRS6结合底物的芳香环，这对酶高效识别专一底物具有重要意义[27]。PeC4Hs中包含细胞色素P450家族蛋白特有的血红素结合域是绝对保守，而另一个保守结构域(PPGPXXXP)则有氨基酸残基的差异，特别是与双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的差异较为明显，这可能是因为C4H在单、双子叶植物间有着不同的进化路径。根据氨基酸序列的相似性以及N-端和C-端的保守性，C4H可以分为2类[31]，虽然Ⅰ类很可能包括参与木质素生物合成的真正成员，但这2类酶都被证明是非常有效的肉桂酸4-羟化酶[7]，并且其基因都能够恢复拟南芥C4H突变体的表型[28]，PeC4Hs的酶活性和具体功能有待进一步验证。
研究表明，植物C4H基因的表达具有组织特异性，拟南芥AtC4H在茎中表达量最高、根中次之、叶和花中最少[32]。油菜(Brassica napus)的BnC4H2在茎、叶和花中表达量较高，而在根和种子中表达量较低[33]。转录组数据分析表明，PeC4H1/2在笋中表达量最高，根和叶中次之，芽中表达量最低, 这与拟南芥和油菜中的研究结果相符。在拟南芥Ref3突变体中AtC4H突变，会使植物体内木质素含量降低，造成植株矮小、雄性不育等表型[34]。在苜蓿和烟草中下调C4H的表达，也会使木质素含量显著下降[10-11]。在毛竹中，PeC4Hs随着笋的木质化程度加深呈上调表达趋势，说明毛竹笋中PeC4Hs的表达与木质素积累呈正相关，qPCR结果也进一步证实了PeC4Hs参与了毛竹笋的木质化过程。
PeC4Hs上游启动子序列中存在多种与激素和逆境胁迫相关的顺式作用元件，这些元件赋予了植物快速反应和调节相关基因表达的能力，从而提高对逆境的适应性[35]。qPCR结果表明，第Ⅱ类基因PeC4H3/4在干旱处理后1 h的根中显著上调表达，其余成员在叶和根中均下调表达，与2 a生实生苗干旱处理后的叶片转录组数据(SRR4450542∼ SRR4450551)相一致[36]，这可能是由于在逆境胁迫下，毛竹幼苗体内代谢减弱所致。GA3处理下, PeC4Hs在叶中的表达模式与2个月毛竹幼苗经100 μmol/L GA3处理4 h的转录组数据(SRR6131113~ SRR6131118)基本一致[37]，在根中的表达量也出现显著变化，由此推测PeC4Hs的表达受激素信号的影响。在逆境胁迫下，茶树(Camellia sinensis)中C4H表达的增加使得植物体内木质素积累量增加，可应对逆境胁迫[31]。本研究中，在木质化程度高的根中PeC4Hs呈现较高的表达水平，且非生物胁迫和生长调节剂处理下根中的表达变化较叶中更为显著，进一步说明，在逆境下PeC4Hs可能通过增加木质素含量来抵抗胁迫。干旱和GA3处理下PeC4Hs表达模式的差异，说明PeC4Hs功能的多样性，但其在毛竹生长过程以及逆境胁迫中的作用机制仍需进一步研究。
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