2022, Vol. 30
2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海口 571101;
3. 海南大学热带作物学院，海口 570228
2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China;
3. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou 570228, China
叶片表皮是调控蒸腾作用的重要组成成分，同时也是植物抵御生物和非生物入侵的第一道防线。表皮细胞和气孔器在保护植株、调节光合和呼吸作用等多种生理过程中发挥着重要的作用[1]。大多数双子叶植物表皮细胞的细胞壁会形成凸出(lobe)，从而使表皮细胞相互嵌合，紧密排列[2]。双子叶植物气孔器一般由2个保卫细胞构成，通过控制气孔器的开闭来调控与外界气体的交换[3]。已对很多植物的表皮形态进行了研究[4-7]，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、野丁香(Leptodermis potaninii)等，而菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)的表皮形态研究还较少。
植物叶片是进行光合作用的主要器官，光对叶表皮形态具有一定的调控作用。有研究表明，强光环境下叶表皮细胞的体积会减小[8]。Thomas等[9]报道气孔的密度随光照强度的增加而增加。Kang等[10]的研究表明，在蓝光和红光下隐花色素(cryptochrome, CRY)和光敏色素B (phytochrome B, phyB)功能缺失突变体中气孔的发育受到抑制; 在远红光下光敏色素A (phyA)缺失突变体中气孔器几乎不发育。
MAPs (microtubule associated proteins)是一类与微管结合的蛋白。MAP65s对维持微管稳定以及微管成束起关键作用。MAP65-1可通过抑制与微管切断酶KTN1 (katanin)的结合，保护微管免受切断[11]。微管排布会影响细胞的生长过程。当微管平行聚集成束并横向排列时，局部表皮细胞的生长会受到抑制，从而使表皮细胞形成凹陷[12]。同时，微管还可通过调节纤维丝的长度影响细胞生长，当微管正常排布时，纤维丝较长，抑制细胞向纤维丝平行的方向生长[13]。
菠萝蜜是一种常绿木本植物，具有较高食用、观赏和经济价值[14]。白化突变植株光合色素缺失, 从而使得叶片发育异常[15]。同时叶色白化突变体也是一类难得的材料，可发掘其观赏价值[16]。目前有关白化现象对表皮形态影响方面的研究较少，对白化叶片表皮形态及其形成机制进行研究，可为植物细胞形态建成、分子调控机制和植株园艺性状改良提供重要依据[17]。
本文在扫描电镜下观察了菠萝蜜白化突变体(AAS)和正常(CK)幼苗叶片的表皮细胞和气孔器变化，基于MAP65家族蛋白构建进化树，并对MAP65家族基因的表达模式进行分析，为探究木本植物白化突变体叶片表皮形态变化机制提供参考依据。
1 材料和方法 1.1 材料试验材料种植于海南大学儋州校区。菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)白化突变体(albino mutant, AAS)和作为对照(CK)的正常幼苗均为实生苗，来源于同一棵带有隐性白化基因的菠萝蜜成年母株，取幼苗成熟叶片为材料(图 1)。
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图 1 菠萝蜜正常幼苗(A)和白化突变体(B)植株形态 Fig. 1 Normal (A) and albino mutant (B) of Artocarpus heterophyllus seedlings |
种子萌发与幼苗的栽种 采用谢柳青等[18]的方法，选取发育良好的种子，点播于经灭菌处理的基质(营养土∶蛭石=3∶1)中，在(32±3) ℃、光照强度约1 440 μmol/(m2·s)的环境下栽种，每天定时浇水和管理。
扫描电镜观察 幼苗萌发第15天用镊子取茎尖向下第3枚叶片, 观测面向上置于电镜载物台, 并用液氮速冻约3 min。在扫描电子显微镜下对叶片上下表皮进行观察并拍照。
表皮细胞形态 表皮细胞测量周长、面积和密度。周长为单个细胞的细胞壁长度，面积为细胞壁围成的面积。此外，为反映AAS与CK表皮细胞的嵌合程度，参照Armour等[19]的方法对相邻2个表皮细胞交界点的直线距离和细胞壁长度进行测量，并统计凸出数量，重复大于100次; 表皮细胞的密度为单位面积的表皮细胞个数，重复3次。小细胞是指小于平均面积60%的细胞，小细胞密度为单位面积内小细胞的个数，重复3次。
气孔器形态 气孔器测量长度、宽度、面积、周长、密度和气孔指数。长度和宽度分别为气孔器的长轴和短轴长; 周长为2个保卫细胞外围细胞壁围成的曲线长; 面积为2个保卫细胞外围曲边围成的面积，重复大于100次。气孔指数=气孔器个数/(气孔器个数+表皮细胞个数)，重复3次。形态异常的气孔器为面积不足平均面积60%的气孔器，计算异常气孔器占全部气孔器的比例，重复3次。
保卫细胞形态 保卫细胞测量长度、宽度、周长和面积。宽度为气孔器横向边缘切点到气孔中轴线的距离; 长度为保卫细胞纵向展平时两端点的距离; 周长为保卫细胞外围曲边与气孔中轴线围成的曲线长; 面积为保卫细胞外围曲边与气孔中轴线围成的面积，重复大于100次。
1.3 数据的统计和分析采用Image J软件对叶片表皮细胞和气孔器进行测量。采用Excel 2010软件对数据进行单因素方差分析和多重比较，以P < 0.05表示差异显著, P < 0.01表示差异极显著，所有数据用平均值±标准误差表示。
1.4 MAP65家族基因的表达分析本研究前期已完成菠萝蜜转录组测序(PRJNA 579273)，从拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)中获得AtMAP65家族成员的氨基酸序列，使用BioEdit软件，通过本地Blast筛选出与拟南芥AtMAP65-1 (AT5G55230)同源的蛋白，并在拟南芥数据库中进行BLAST验证。从AAS叶转录组数据中获取菠萝蜜MAP65家族基因表达量。并通过在线网站Expression Heatmapper (http://www2.heatmapper.ca/expression/)进行可视化，标准化方法为Row Z-score标准化。
1.5 系统进化树的构建用Clustal W将菠萝蜜和拟南芥MAP65的氨基酸序列进行多重比对，采用MEGA 6.05软件以邻接法(neighbor-joining, NJ)构建进化树，设置步长为1 000，模式为Poisson model，缺口设为Pairwise deletion进行检验。
2 结果和分析 2.1 表皮细胞形态结构CK幼苗的叶片颜色为绿色，而AAS为白色(图 1)。AAS和CK的上表皮细胞周长分别是347.25和923.67 μm，AAS是CK的37.59%，差异极显著; AAS和CK下表皮细胞周长分别是146.18和524.09 μm, AAS是CK的27.89%，差异极显著(图 2, 图 3)。AAS和CK上表皮细胞面积分别是85.03和202.73 μm2, AAS是CK的41.94%，差异极显著; AAS和CK下表皮细胞面积分别是54.44和128.00 μm2，AAS是CK的42.53%，差异极显著(图 3)，这表明光合色素缺失严重抑制叶表皮细胞的大小。
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图 2 叶片表皮细胞和气孔器形态。CK: 正常幼苗; AAS: 白化突变体; 白色箭头: 形态异常的气孔器; 黑色箭头: 小细胞。 Fig. 2 Morphology of leaf epidermis cells and stomatal apparatus. CK: Normal seedling; AAS: Albino mutant seedling; White arrow: Abnormal stomatal apparatus; Black arrow: Small cell. |
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图 3 叶片表皮细胞的形态特性。1: CK上表皮细胞; 2: AAS上表皮细胞; 3: CK下表皮细胞; 4: AAS下表皮细胞。柱上不同大小写字母分别表示差异极显著(P < 0.01)和显著(P < 0.05)。 Fig. 3 Morphology of leaf epidermal cells. 1: Upper epidermal cell of CK; 2: Upper epidermal cell of AAS; 3: Lower epidermal cell of CK; 4: Lower epidermal cell of AAS. Different capital and small letters upon column indicate significant differences at 0.01 and 0.05 levels, respectively. |
AAS和CK上表皮细胞密度分别是2 816.98和1 077.77 num./mm2，AAS是CK的2.61倍，差异极显著; AAS和CK下表皮细胞密度分别是6 458.43和2 008.03 num./mm2，AAS是CK的3.22倍，差异极显著(图 3)，这表明光合色素缺失使叶表皮细胞的密度成倍增加。
气孔器仅分布于叶片的下表皮(图 2)。与CK相比，AAS上、下表皮细胞的凸出较少，分别是CK的60.82%和29.50%，差异极显著(图 3)。AAS的上、下表皮相邻2个细胞交界点直线距离的中位数分别是11.55和6.62 μm，是CK的57.43%和46.95%; 相邻2个细胞交界点的细胞壁长度分别是14.22和7.40 μm，是CK的39.38%和52.48% (图 4: A, B)。这表明光合色素缺失使AAS的上、下表皮细胞凸出减少。
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图 4 相邻2个细胞交界点间直线距离(A)和细胞壁长度(B)及其线性关系(C: 上表皮, D: 下表皮)。1: CK上表皮细胞; 2: AAS上表皮细胞; 3: CK下表皮细胞; 4: AAS下表皮细胞。 Fig. 4 Distance (A) between two adjacent cell junctions and the cell wall length (B) and their linear relationship (C: Upper epidermis, D: Lower epidermis). 1: Upper epidermal cell of CK; 2: Upper epidermal cell of AAS; 3: Lower epidermal cell of CK; 4: Lower epidermal cell of AAS. |
在叶片的上、下表皮中，AAS和CK的相邻2个细胞交界点间的直线距离与细胞长度都呈正相关。线性回归分析表明，CK上表皮的回归系数是1.86, AAS为1.33，是CK的71.50%;而CK下表皮的回归系数是1.97，AAS为1.11，是CK的56.35% (图 4: C, D)，这表明受光合色素缺失的影响，AAS上、下表皮细胞间的嵌合程度降低。
AAS下表皮的小细胞较多，CK小细胞的密度为19.15 num./mm2，AAS为279.38 num./mm2，是CK的14.59倍，差异极显著。
2.2 气孔器形态AAS和CK的气孔器均分布于叶片下表皮。CK气孔器的长度、宽度、周长和面积分别为23.22、18.48、64.90 μm和333.67 μm2，而AAS分别为20.16、17.50、58.81 μm和292.67 μm2，分别是CK的86.82%、94.70%、90.62%和87.71%，差异达极显著或显著水平。此外，AAS周长和面积的变异系数分别为15.18%和29.78%，是CK的2.60和3.09倍。CK的气孔密度为390.58 num./mm2, AAS为1 044.92 num./mm2, 是CK的2.68倍，达极显著差异。CK的气孔指数为21.58%，AAS的为20.63%, 无显著差异(表 1)。
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表 1 气孔器的形态 Table 1 Morphology of stomatal apparatus |
CK保卫细胞的长度、宽度、周长和面积分别是23.31、8.95、52.88 μm和160.35 μm2，AAS分别为20.46、8.60、48.28 μm和144.00 μm2，分别是CK的87.77%、96.09%、91.30%和89.80%，差异均达极显著或显著水平。AAS保卫细胞周长和面积的变异系数分别为15.76%和29.93%，是CK的2.89和2.87倍(表 2)。这表明光合色素缺失会使AAS的气孔器和保卫细胞发育异常，导致气孔器和保卫细胞大小悬殊，分布不均。
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表 2 保卫细胞比较 Table 2 Comparisons of guard cells |
AAS形态异常气孔器的比例为6.19%;而CK则没有(表 1)，表明光合色素缺失使部分气孔器的形态异常。
2.3 MAP65家族基因分析为探究基因表达对AAS表皮细胞的影响，选择与微管蛋白相关的MAP65家族进行分析。本研究与MAP65家族相关基因在菠萝蜜中共有20个，其编码的蛋白中CL1677.C5、CL1677.C14、CL1677.C13、CL1677.C4、CL1677.C2、CL1677.C12、CL1677.C7、CL1677.C10与AtMAP65-8、AtMAP65-5聚于一支，基因在AAS中下调表达(图 5)。CL1465.C1、CL1465.C3、CL1465.C4与AtMAP65-2为直系同源蛋白。在AAS中CL1465.C1下调表达，而CL1465.C3和CL1465.C4上调表达。CL205.C4、CL205.C3、CL205.C5、CL205.C6、CL205.C8、CL205.C7、CL205.C1与AtMAP65-6、AtMAP65-7聚于一大支。除CL205.C4、CL205.C3和CL205.C6在AAS中上调表达，其余均下调表达。UG902与AtMAP65-9为直系同源基因，UG41335与AtMAP65-4的亲缘关系较近, 且其基因均在AAS中上调表达。这表明菠萝蜜MAP65家族成员大部分基因在AAS中下调表达。
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图 5 MAP65家族蛋白的系统进化树(左)及基因表达分析(右)。数值表示分支的置信度，蓝色圆点为菠萝蜜蛋白。 Fig. 5 Phylogenetic tree (left) and gene expression analysis (right) of MAP65 family. The value represents the confidence of the branch, Blue dot: Proteins in Artocarpus heterophyllus. |
对于双子叶植物而言，表皮细胞的发育经历了3个阶段，即多边形细胞的产生、细胞壁的延伸以及凸出的形成[20]。在这个过程中，细胞面积的增大依赖于细胞的膨胀和凸出的延伸[19]。本研究中, AAS的上下表皮细胞在大小、形态上均与CK有显著差异，表现为细胞的周长和面积减小，细胞密度增大，细胞壁的凸出数减少，相邻2个细胞交界点的直线距离和细胞壁长度较短，表明AAS的上、下表皮细胞间的嵌合程度降低。由此可见，AAS表皮细胞的生长和发育受到了抑制。韩冰等[21]研究的拟南芥突变体cpr1表皮细胞形态与本研究结果相似。其认为植物免疫反应可以调节表皮细胞的形态建成，因此可进一步研究AAS和CK免疫反应的异同。
无论是单子叶还是双子叶植物，通常气孔排布时两个气孔器间至少间隔1个表皮细胞，称为“单细胞间距规则”[22]。排布异常的气孔器会出现2个或多个气孔直接接触的情况，中间无表皮细胞间隔，称为气孔簇[23]。付影等[24]使用光学显微镜对白化菠萝蜜的叶表皮细胞及气孔器临时装片进行观察，由于图像解析度的限制，2个气孔器直接接触被误认为气孔簇，但本研究在电子显微镜下观察2个气孔器并未直接接触，并不构成气孔簇。
植物的细胞形态建成需要微管微丝的参与[25-26], 其中微丝与凸出的延伸有关，微管与细胞生长点的构建有关，微丝形成受阻会导致细胞壁变得平滑, 凸出减少; 微管的异常则会导致细胞不正常膨胀, 趋近于圆形[21]，由此推测，叶色白化植株微管微丝的结构可能发生了改变。MAP65对维持微管稳定起关键作用[27]，有研究表明AtMAP65-1和AtMAP65- 5蛋白能促进微管捆绑成束[28]。微管聚集成束会抑制表皮细胞局部生长，形成细胞凹陷[12]。菠萝蜜中与AtMAP65-1聚于同一分支的3个蛋白，对应的有2个基因在AAS中上调表达，1个下调表达; 与AtMAP65-5聚于同一分支的8个蛋白，其基因在AAS中下调表达，由此推测，AAS中这些基因的表达变化可能是造成菠萝蜜叶上、下表皮细胞凸出数量降低的原因。
AAS的气孔器和保卫细胞形态与CK有较大差异，AAS气孔器和保卫细胞的长、宽、周长和面积均较小，气孔器密度增大，且AAS的气孔器大小不一，而CK相对均一。Kim等[29]首次报道油菜素甾醇(brassinosteroid, BR)突变体中植物的气孔密度增加，而用BR处理发育叶片后气孔密度降低，由此推测，可能是由于AAS的BR合成异常导致气孔的密度增加。同时，AAS中小细胞密度和形态异常气孔器比例均与CK呈极显著差异。有研究表明, 甾醇合成异常会导致表皮细胞及气孔器的发育改变[30]，因此，对甾醇相关合成酶基因的表达情况还有待于深入研究。
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