2. 广东省林业科学研究院 广东省森林培育与保护利用重点实验室, 广州 510520;
3. 华南农业大学林学与风景园林学院, 广州 510642
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization, Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China;
3. College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
三叶木通(Akebia trifoliata)为木通科(Ladizaba- lacene)木通属多年生落叶木质藤本,根、茎、果实均可入药,在我国已有上千年的应用历史,有利尿、通乳、舒筋活络之功效,用于治疗风湿关节痛等症[1]。三叶木通在我国主产于贵州、重庆、湖北、湖南西部、陕西南部、甘肃东南部至长江流域各省区,生于山谷疏林或丘陵灌丛中,在日本也有零星分布。三叶木通干燥藤茎是我国传统重要的中药材,被《中国药典》等收录,具有利尿通淋、清心除烦、通经下乳的功效,用于治疗淋证、水肿、心烦尿赤、口舌生疮、经闭乳少、湿热痹痛等症[2]。
迄今为止,已从三叶木通的愈伤组织、茎和果皮中分离报道了约80余种化学成分,其中有近70种为三萜或三萜皂苷类化合物[3-9],显示三萜类成分为三叶木通重要的功效成分。另外,有研究表明三叶木通中含有苯丙素和咖啡酰奎尼酸类成分[10-11]。为深入研究三叶木通藤茎中的化学成分组成,进一步阐明三叶木通三萜类化学成分,为深入开发利用奠定物质基础。本研究从三叶木通藤茎的乙醇提取物中分离得到9个三萜化学成分,分别鉴定为stachlic acid A (1),齐墩果酸(2)、乌苏酸(3)、2α, 3β-dihy- droxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4)、serratagenic acid (5)、gypsogenic acid (6)、20α-hydroxyl-29-norolea- nolic acid (7)、mesembryanthemoidigenic acid (8)和12α-hydroxy-δ-lactone (9),其中,化合物3和7为首次从木通属植物中分离获得,化合物1、4、6和9为首次从三叶木通藤茎中分离得到。采用刃天青显色法进行抗菌活性分析,结果表明,化合物2和3对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽胞杆菌(B. subtilis)具有显著的抗菌活性,但对革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌(Shigella dysenteriae)无明显抑制作用。
1 材料和方法 1.1 仪器和试剂LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司), 中压反相柱层析HPLC半制备系统(北京创新通恒科技有限公司),超导核磁共振仪(Bruker DRX-400、Bruker Advance-600,瑞士Bruker公司),N-1000旋转蒸发仪(日本东京理化EYELA公司),粉碎仪(RT- 04,屹立工具有限公司);电喷雾质谱(MDS SCIEX API,美国应用生物系统公司),电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
柱层析色谱正相硅胶(80~100、100~200和200~ 300目, 青岛海洋化工厂); 薄层色谱正相硅胶板HFGF254 (山东烟台江友硅胶开发有限公司)、GF254 (青岛海洋化工厂);YMC ODS-A (50 μm,日本YMC公司);Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司);氘代试剂(CDCl3、CD3OD、DMSO-d6,Sigma公司);实验中所用分析纯试剂石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿(天津市富宇试剂公司),色谱级甲醇、乙腈(默克股份两合公司)。紫外荧光(254 nm)、碘蒸气以及喷洒硫酸-乙醇溶液(20∶80,V/V)加热显色。
1.2 材料实验用三叶木通藤茎材料于2009年9月采自湖南省桑植县,经中国科学院华南植物园罗世孝研究员鉴定为木通科木通属三叶木通(Akebia trifo- liate),标本存放于中国科学院华南植物园生物有机化学实验室(No. 20090921)。
供测试筛选的细菌菌株来自广东省微生物研究所,包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylo- ccocus aureus, CMCC26003)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus, CMCC63302)、枯草芽胞杆菌(B. subtilis, CMCC63501)和革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌(Shi- gella dysenteriae, CMCC51252)。
1.3 提取和分离三叶木通藤茎干品2.0 kg粉碎,经95%乙醇浸泡室温提取3×24 h,合并提取液;减压浓缩后加水成混悬液再萃取浓缩,得石油醚萃取部(16.6 g)和乙酸乙酯萃取部(67.8 g)。石油醚萃取部经正相硅胶柱层析(200~300目),以石油醚-丙酮(100∶1→0∶1, V/V, 下同)梯度洗脱,检测合并主点相同的流分, 得到E1~E9共9个组分。组分E3经正相硅胶柱层析(200~ 300目), 以石油醚-丙酮(100∶1→0∶1)梯度洗脱, 检测合并主点相同的流分,得到E3-1~E3-4共4个组分。E3-3为石油醚-丙酮2∶1洗脱得到的组分,经Sepha- dex LH-20柱层析(流动相为丙酮),得到亚组分E3-3-1~ E3-3-7,E3-3-6继续经Sephadex LH-20柱层析(流动相为氯仿-甲醇=1∶4),得到化合物9 (2 mg) (图 1)。E4经MCI柱脱色,甲醇洗脱物再经正相硅胶柱层析(200~300目),以石油醚-丙酮(100∶0→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→0∶100)梯度洗脱,TLC薄层检测合并主点相同的流分,得到E4-1~E4-7共7个组分。E4-5经正相硅胶层析柱(200~300目)分离纯化, 以石油醚-丙酮(10∶1→8∶1→6∶1→0∶100)为流动相梯度洗脱,根据薄层板检测,收集洗脱液得到5个组分E4-5-1~E4-5-5。E4-5-5经Sephadex LH-20柱(acetone)分离纯化,再经反相中压柱层析以甲醇-水=70∶30→85∶15 (0~60 min), 85∶15→100∶0 (61~220 min)为流动相梯度洗脱, 流速为10 mL/min, 根据薄层板检测,收集含主点的洗脱液组分,再经Sephadex LH-20柱(氯仿∶甲醇=1∶4)纯化,得到化合物2 (3.5 mg)和3 (4.6 mg)。E6经正相硅胶层析柱(200~300目)分离,以氯仿-甲醇= 100∶0、100∶1、100∶3、20∶1、10∶1、0∶100为流动相梯度洗脱,根据薄层板检测,收集洗脱液,得到6个组份E6-1~ E6-6;E6-6经反相中压柱层析以甲醇-水=60∶40→ 75∶25 (0~100 min), 75∶25→90∶10 (100~250 min), 90∶10→100∶0 (250~300 min)为流动相梯度洗脱,流速为10 mL/min,根据薄层板检测, 收集洗脱液,得到的主点组分再经Sepha- dex LH-20柱(流动相:丙酮)分离纯化,得到化合物4 (3 mg)。E8经MCI柱,甲醇洗脱后以石油醚-丙酮(100∶1~0∶100)梯度洗脱,根据薄层板检测,收集洗脱液合并相同主点部分得到8个流份。流份E8-4再经Sephadex LH- 20柱(氯仿-甲醇=1∶4)分离纯化, 得到4个组分。组分E8-4-3继续经反相(C-18)中压柱层析以甲醇-水= 50∶50→75∶75 (0~100 min), 75∶25→100∶0 (100~ 400 min)为流动相梯度洗脱,流速为10 mL/min,根据薄层板检测, 洗脱液合并得到10个亚组份。组分E8-4-3-3经凝胶Sephadex LH-20柱(流动相:甲醇)分离纯化得到2个主点组分,主点组分2经快速正相硅胶层析柱(200~300目)分离纯化,以氯仿-甲醇= 100∶0、99∶1、98∶2、97∶3为流动相梯度洗脱,收集氯仿-甲醇=98∶2洗脱部分经Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4分离纯化,得到化合物7 (2 mg)。E8-4-3-5经Sephadex LH-20柱(流动相:甲醇)分离得到2个主点组分,主点组分1经Sephadex LH-20柱(流动相:氯仿-甲醇=1∶4)分离纯化,得到化合物8 (2.7 mg);主点组分2经正相硅胶层析柱(200~ 300目)分离纯化,以氯仿-甲醇= 100∶0,99∶1,98∶2,97∶3为流动相梯度洗脱,收集氯仿-甲醇= 98∶2洗脱部分,再经Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4)分离纯化得到化合物5 (2.1 mg)。乙酸乙酯部分(800.0 g)经硅胶柱层析(200~300目),以氯仿- 甲醇(97∶3、90∶10、85∶15、70∶30、60∶40、0∶100)梯度洗脱,经TLC薄层层析检测合并主点相同的流分,得到F1~F10共10个组分。F5经正相硅胶层析柱(200~300目)分离纯化,以氯仿-甲醇(98∶2、95∶5、9∶1, 0∶100)梯度洗脱,TLC薄层检测合并主点相同的流分,得到7个组分。F5-5经反相中压柱层析分离, 甲醇-水(50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0)为流动相梯度洗脱, 收集70%甲醇-水洗脱流份, 经Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4)纯化,得到化合物6 (2.2 mg)。F7经反相中压柱层析分离,甲醇-水为流动相梯度洗脱(20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、100∶0),根据薄层板检测, 洗脱液合并得到组分F7-1~ F7-7。F7-7再经Sephadex LH-20柱(甲醇)分离纯化,得到化合物1 (6.6 mg)。
化合物1 白色无定形粉末,ESI-MS m/z: 527 [M + Na]+, 503 [M-H]-, 分子量为504。分子式为C30H48O6。1H NMR (600 MHz, C5D5N): δ 5.49 (1H, m, H-12), 1.21 (3H, s, H-30), 1.20 (3H, s, H-27), 1.06 (3H×3, s, H-24, H-25, H-26); 13C NMR (150 MHz, C5D5N): δ 47.5 (CH2, C-1), 68.7 (CH, C-2), 78.0 (CH, C-3), 43.4 (C, C-4), 47.8 (CH, C-5), 18.3(CH2, C-6), 32.7 (CH2, C-7), 39.6 (C, C-8), 48.0 (CH, C-9), 38.2 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 122.3 (CH, C-12), 144.8 (C, C-13), 42.0 (C, C-14), 28.1 (CH2, C-15), 23.8 (CH2, C-16), 46.9 (C, C-17), 41.2 (CH, C-18), 41.1 (CH2, C-19), 36.4 (C, C-20), 28.9 (CH2, C-21), 32.5 (CH2, C-22), 66.3 (CH3, C-23), 14.1 (CH3, C-24), 17.2 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 26.0 (CH3, C-27), 180.1 (C, C-28), 73.6 (CH2, C-29), 19.5 (CH3, C-30)。以上波谱数据与文献[12]报道基本一致,故确定该化合物为stachlic acid A。
化合物2 白色无定形粉末;ESI-MS m/z: 479 [M + Na]+, 455 [M-H]-, 分子式为C30H48O3; 1H NMR (600 MHz, C5D5N): δ 5.50 (1H, t, J = 3.0 Hz, H-12), 3.31 (1H, dd, J = 13.9, 4.2 Hz, H-18), 3.43 (1H, m, H-3), 1.29 (3H, s), 1.24 (3H, s), 1.01 (3H, s), 1.02 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.95 (3H, s), 0.91 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, C5D5N): δ 38.9 (CH2, C-1), 28.2 (CH2, C-2), 78.1 (CH, C-3), 39.3 (C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 18.8 (CH2, C-6), 33.1 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 47.9 (CH, C-9), 37.3 (C, C-10), 23.7 (CH2, C-11), 122.3 (CH, C-12), 144.6 (C, C-13), 42.1 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 23.7 (CH2, C-16), 46.6 (C, C-17), 41.9 (CH, C-18), 46.5 (CH2, C-19), 30.9 (C, C-20), 34.2 (CH2, C-21), 33.2 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.4 (CH3, C-25), 17.4 (CH3, C-26), 26.1 (CH3, C-27), 180.0 (C, C-28), 33.2 (CH3, C-29), 23.6 (CH3, C-30)。以上波谱数据与文献[13]报道基本一致,故确定该化合物为齐墩果酸。
化合物3 白色粉末;ESI-MS m/z: 479 [M + Na]+, 455 [M-H]-, 分子式为C30H48O3; 1H NMR (600 MHz, C5D5N): δ 1.24 (3H, s), 1.23 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.03 (3H, d, J = 5.5 Hz), 1.01 (3H, s), 0.96 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.89 (3H, s), 2.64 (1H, d, J = 11.4 Hz, H-18), 3.46 (1H, m, H-3), 5.48 (1H, t, J = 3.0 Hz, H-12); 13C NMR (150 MHz, C5D5N): δ 39.1 (CH2, C-1), 28.0 (CH2, C-2), 78.1 (CH, C-3), 39.2 (C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 18.8 (CH2, C-6), 33.6 (CH2, C-7), 39.9 (C, C-8), 47.9 (CH, C-9), 37.4 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 125.6 (CH, C-12), 139.3 (C, C-13), 42.5 (C, C-14), 28.6 (CH2, C-15), 24.8 (CH2, C-16), 48.1 (C, C-17), 53.5 (CH, C-18), 39.5 (CH, C-19), 39.3 (CH, C-20), 31.0 (CH2, C-21), 37.3 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.7 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 23.6 (CH3, C-27), 179.9 (C, C-28), 21.4 (CH3, C-29), 17.4 (CH3, C-30)。以上波谱数据与文献[13]报道基本一致,故确定该化合物为乌苏酸。
化合物4 白色无定形粉末;ESI-MS m/z: 495 [M + Na]+, 471 [M-H]-, 943 [2M-H]-, 967 [2M + Na]+, 分子式为C30H48O4; 1H NMR (600 MHz, C5D5N): δ 1.30 (3H, s, H-23), 1.25 (3H, s, H-27), 1.17 (3H, s, H- 26), 1.09 (3H, s, H-24), 1.01 (3H, s, H-25), 0.97 (3H, s, H-29), 0.86 (3H, s, H-30); 13C NMR (150 MHz, C5D5N): δ 48.0 (CH2, C-1), 68.7 (CH, C-2), 83.7 (CH, C-3), 39.7 (C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 19.7 (CH2, C-6), 35.3 (CH2, C-7), 42.6 (C, C-8), 51.1 (CH, C-9), 38.7 (C, C- 10), 22.1 (CH2, C-11), 25.4 (CH2, C-12), 137.7 (C, C- 13), 44.7 (C, C-14), 27.6 (CH2, C-15), 33.5 (CH2, C- 16), 48.7 (C, C-17), 129.2 (C, C-18), 41.4 (CH2, C-19), 32.8 (C, C-20), 37.3 (CH2, C-21), 36.4 (CH2, C-22), 29.2 (CH3, C-23), 17.5 (CH3, C-24), 17.8 (CH3, C-25), 18.1 (CH3, C-26), 21.1 (CH3, C-27), 178.9 (C, C-28), 32.2 (C, C-29), 24.3 (CH3, C-30)。以上波谱数据与文献[14]报道基本一致, 故确定该化合物为2α, 3β-di- hydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid。
化合物5 白色无定形粉末;ESI-MS m/z: 509 [M + Na]+, 485 [M-H]-, 分子式为C30H46O5; 1H NMR (600 MHz, CD3OD): δ 5.29 (1H, m, H-12), 3.16 (1H, m), 1.25 (3H, s), 1.17 (3H, s), 1.16 (3H, s), 0.98 (3H, s), 0.95 (3H, s), 0.82 (3H, s), 0.78 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, CD3OD): δ 38.1 (CH2, C-1), 27.8 (CH2, C-2), 79.7 (CH, C-3), 39.8 (C, C-4), 56.7 (CH, C-5), 19.5 (CH2, C-6), 32.7 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 47.4 (CH, C-9), 38.1 (C, C-10), 24.1 (CH2, C- 11), 124.4 (CH, C-12), 144.5 (C, C-13), 41.6 (C, C- 14), 28.7 (CH2, C-15), 24.5 (CH2, C-16), 46.8 (C, C- 17), 41.2 (CH, C-18), 40.5 (CH2, C-19), 42.8 (C, C- 20), 29.5 (CH2, C-21), 34.0 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.3 (CH3, C-24), 15.9 (CH3, C-25), 17.7 (CH3, C-26), 26.3 (CH3, C-27), 181.3 (C, C-28), 181.9 (C, C-29), 19.7 (CH3, C-30)。以上波谱数据与文献[15]报道基本一致,故确定该化合物为serratagenic acid。
化合物6 白色无定形粉末;ESI-MS m/z: 509 [M + Na]+, 485 [M-H]-, 分子式为C30H46O5; 1H NMR (600 MHz, C5D5N): δ 5.49 (1H, m, H-12), 3.42 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.29 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.02 (3H, s), 0.95 (3H, s), 1.01 (3H, s), 0.96 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, C5D5N): δ 37.6 (CH2, C-1), 26.2 (CH2, C-2), 74.0 (CH, C-3), 53.0 (C, C-4), 50.5 (CH, C-5), 20.2 (CH2, C-6), 31.6 (CH2, C-7), 38.6 (C, C-8), 46.0 (CH, C-9), 35.3 (C, C-10), 22.3 (CH2, C-11), 122.4 (CH, C-12), 143.3 (C, C-13), 40.7 (C, C-14), 26.8 (CH2, C-15), 22.2 (CH2, C-16), 45.1 (C, C-17), 40.5 (CH, C-18), 45.0 (CH2, C-19), 29.5 (C, C-20), 32.7 (CH2, C-21), 31.5 (CH2, C-22), 179.5 (C, C-23), 10.7 (CH3, C-24), 14.5 (CH3, C-25), 15.9 (CH3, C-26), 24.7 (CH3, C-27), 178.7 (C, C-28), 31.8 (CH3, C-29), 22.3 (CH3, C-30)。以上波谱数据与文献[16]报道基本一致,故确定该化合物为gypsogenic acid。
化合物7 白色粉末;ESI-MS m/z: 481 [M + Na]+, 457 [M-H]-, 分子式为C29H46O4;1H NMR (600 MHz, C5D5N): δ 5.57 (1H, br.s), 3.37 (1H, dd, J = 14.0, 3.8 Hz), 1.59 (3H, s), 1.27 (3H, s), 1.25 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.03 (3H, s), 0.90 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, C5D5N): δ 38.8 (CH2, C-1), 28.7 (CH2, C-2), 78.0 (CH, C-3), 39.6 (C, C-4), 55.7 (CH, C-5), 18.7 (CH2, C-6), 33.2 (CH3, C-7), 39.3 (C, C-8), 48.0 (CH, C-9), 37.2 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 122.6 (CH, C-12), 144.2 (C, C-13), 42.0 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 23.7 (CH2, C-16), 46.6 (C, C-17), 48.0 (CH, C-18), 49.6 (CH2, C-19), 69.8 (C, C-20), 36.1 (CH2, C-21), 35.0 (CH2, C-22), 28.0 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.4 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 25.9 (CH3, C-27), 179.9 (C, C-28), 25.5 (CH3, C-29)。以上波谱数据与文献[15]报道基本一致,故确定该化合物为20α- hydroxyl-29-noroleanolic acid。
化合物8 白色无定形粉末;ESI-MS m/z: 495 [M + Na]+, 471 [M-H]-, 分子式为C30H48O4; 1H NMR (600 MHz, CD3OD): δ 5.25 (1H, m, H-12), 0.77 (3H, s), 0.81 (3H, s), 0.92 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.96 (3H, s), 1.17 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, CD3OD): δ 38.2 (CH2, C-1), 27.9 (CH2, C-2), 79.7 (CH, C-3), 39.8 (C, C-4), 56.7 (CH, C-5), 19.5 (CH2, C-6), 34.0 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 49.0 (CH, C-9), 36.9 (C, C- 10), 24.0 (CH2, C-11), 123.7 (CH, C-12), 145.2 (C, C- 13), 41.9 (C, C-14), 28.7 (CH2, C-15), 24.5 (CH2, C- 16), 47.9 (C, C-17), 41.4 (CH, C-18), 40.6 (CH2, C- 19), 36.8 (C, C-20), 29.3 (CH2, C-21), 33.1 (CH3, C- 22), 28.8 (CH2, C-23), 16.3 (CH3, C-24), 15.9 (CH3, C-25), 17.7 (CH3, C-26), 26.4 (CH3, C-27), 181.7 (C, C-28), 74.4 (CH2, C-29), 19.5 (CH3, C-30)。以上波谱数据与文献[17]报道基本一致,故确定该化合物为mesembryanthemoidigenic acid。
化合物9 白色无定形粉末;ESI-MS m/z: 537 [M + Na]+, 513 [M-H]-, 分子式为C32H50O5; 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 0.86 (3H, s, H-25), 0.88 (3H, s, H-23), 0.91 (3H, s, H-30), 0.91 (3H, s, H-24), 0.99 (3H, s, H-29), 1.15 (3H, s, H-26), 1.31 (3H, s, H-27), 2.06 (3H, s, CH3COO), 3.89 (1H, m, H-12), 4.50 (1H, dd, J = 11.5, 5.5 Hz, H-3); 13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 38.8 (CH2, C-1), 23.8 (CH2, C-2), 81.0 (CH, C-3), 38.1 (C, C-4), 55.5 (CH, C-5), 17.9 (CH2, C-6), 34.2 (CH2, C-7), 42.6 (C, C-8), 44.7 (CH, C-9), 36.6 (C, C-10), 29.1 (CH2, C-11), 76.3 (CH, C-12), 90.8 (C, C-13), 42.3 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 21.5 (CH2, C-16), 44.9 (C, C-17), 51.4 (CH, C- 18), 39.6 (CH2, C-19), 31.8 (C, C-20), 34.4 (CH2, C- 21), 28.3 (CH2, C-22), 27.7 (CH2, C-23), 16.7 (CH3, C-24), 16.6 (CH3, C-25), 18.8 (CH3, C-26), 18.8 (CH3, C-27), 180.1 (C, C-28), 33.5 (CH3, C-29), 24.1 (CH3, C-30), 171.2 (C, C-1′), 21.4 (CH3, C-2′)。以上波谱数据与文献[18]报道基本一致,故确定该化合物为12α-hydroxy-δ-lactone。
1.5 抗菌活性采用刃天青显色法[18]分析化合物1~9的抗菌活性,每处理重复3次,以硫酸卡那霉素作为阳性对照,测定化合物的最低抑菌浓度(MIC)。先将100 μL 100 μg/mL的指示剂溶液(刃天青)放置到无菌的96孔板上的第11列板孔,约7.5 mL的指示剂溶液与5 mL的待测菌溶液(106 CFU/mL)混合,接着转移100 μL到第1至第10列以及第12列所有测试孔中,待测样品(0.8 mg/mL)溶液(100 μL)加入到第1列板孔中,再从第1列取出100 μL的溶液转移到第2列,用同样的方法(倍增稀释)转移到第3~10列,再从第10列取出100 μL以保证每列孔中的溶液均为100 μL。最后,将加好样品的孔板放入到恒温培养箱,37 ℃培养5~6 h,直到孔板的溶液变成粉红色。若颜色无变化仍为蓝色表示有活性,颜色从蓝色变为粉红色,表示无抑菌活性;颜色变化的最低稀释浓度则是待测化合物的最低抑菌浓度(MIC)。1个96孔板可同时测定6个样品、1个阳性对照和1个阴性对照。供测试筛选的细菌菌株包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、蜡样芽孢杆菌(CMCC63302)、枯草芽胞杆菌(CMCC63501)和革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌(CMCC51252)。
结果表明(表 1),化合物2和3具有与阳性对照硫酸卡那霉素接近或相当的体外抑制3种革兰氏阳性菌的活性,化合物4仅有较弱的抑菌活性(MIC≥ 25 μg/mL),而其他化合物则无明显的抗菌活性(MIC > 100 μg/mL)。
本研究对三叶木通藤茎的化学成分进行了系统分析,从其乙醇提取物中分离得到9个三萜类化合物,经波谱数据分析和文献比对,分别鉴定为: stachlic acid A (1),齐墩果酸(2),乌苏酸(3),2α, 3β- dihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4),serratagenic acid (5),gypsogenic acid (6),20α-hydroxyl-29-norolea- nolic acid (7),mesembryanthemoidigenic acid (8)和12α- hydroxy-δ-lactone (9)。化合物3和7为首次从木通属中分离得到,化合物1、4、6和9为首次从三叶木通中分离获得。
抗菌活性测试结果表明,化合物2和3对3种革兰氏阳性菌,即金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽胞杆菌,都有显著的抑制作用,最低抑菌浓度(MIC)为3.125~6.25 μg/mL,与阳性对照硫酸卡那霉素接近或相当,化合物4对蜡样芽孢杆菌有弱的抗菌活性(MIC=25.0 μg/mL)。所有化合物对革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌菌株均无显著抑制作用。这表明化合物2和3是三叶木通藤茎中具有强抑制革兰氏阳性菌的三萜化合物,对于促进三叶木通植物的综合开发利用具有积极意义,可望具有潜在重要的价值用途。
三叶木通具有较强的生态适应能力,不仅在我国有广阔的自然地域分布,并且还呈现出了丰富的品系形态多样性和地域差异性特征[19]。目前虽然已从三叶木通植物中分离出几十个化学成分[20],但具体研究的还仅仅是少数品系,未来有必要推进针对三叶木通不同地域具有差异性特征品系在成分和功能层面的比较分析研究。
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