我国中药材新品种保护工作较为薄弱，DUS测试是植物新品种保护的重要手段，而DUS测试指南是植物品种DUS测试、品种权授权和维护的重要技术标准^[1]。目前，我国植物新品种测试主要集中在大作物和蔬菜上，对药用植物新品种的研究很少^[2]。截止2015年，仅有人参和三七2种中药材进入农业部植物保护名录^[3]，不利于中药材新品种培育工作的推进。

植物形态数量性状，是DUS测试指南中不可或缺的性状之一，因其变异呈现连续性，需要开展数量性状的分级研究，才能准确、客观地对其进行描述。同时，植物形态数量性状也是在形态水平上对遗传多样性的阐述，是种质资源多样性评价的重要研究内容^[4]。

伞形科(Umbelliferae)当归属植物重齿当归(Angelica biserrata)是中药材独活的正品来源，已有300多年人工种植历史。随着应用范围在医疗、保健、化妆、植保等领域的扩大，重齿当归人工种植面积也随之增加^[5]。关于重齿当归DUS测试指南及数量性状的分级研究还未见报道。本研究通过对重齿当归的表型数量性状进行测定、筛选，建立其概率分级指标体系，以期为重齿当归DUS测试指南研制、资源评价、品种选育等工作提供理论参考。

2019年春，分别在湖北恩施州巴东县和宜昌市五峰县、甘肃平凉市华亭市、重庆巫山县、陕西宝鸡市陇县、宁夏固原市隆德县等传统独活产区收集由种子繁殖的1 a生栽培种种苗，6份种质均移栽于湖北省恩施市的华中药用植物园同一地块中，经鉴定为重齿当归(Angelica biserrata)。移栽时间、移栽密度、水肥等栽培管理措施一致。

2019年8月下旬至9月上旬，每种资源选取20株，对14个性状进行测定(表 1)。取复叶顶端小叶测定叶宽、叶长、叶周长、叶面积、叶厚度和叶绿素含量。用卷尺和电子游标卡尺测量株高、冠幅、复叶叶柄的长度和直径、叶宽、叶长、叶厚度；用角度仪测量叶柄夹角；用SPAD-502叶绿素含量测定仪测量叶片的叶绿素含量。

表 1(Table 1)

表 1 重齿当归数量性状 Table 1 List of quantitative characteristics of Angelica biserrata 编号 No. 性状 Trait 单位 Unit 编号 No. 性状 Trait 单位 Unit C1 株高Plant height cm C8 叶片数Leaf number C2 冠幅Crown width cm C9 叶宽Leaf width cm C3 叶序数Phyllotaxis number C10 叶长Length of leaf cm C4 复叶叶柄长度Petiole length of compound leaves cm C11 叶周长Leaf circumference cm C5 复叶叶柄直径Petiole diameter of compound leaves mm C12 叶面积Leaf area cm2 C6 叶柄夹角Petiole angle ° C13 叶厚度Leaf thickness mm C7 复叶回数Number of replicates of compound leaves C14 叶绿素相对含量Content of chlorophyll SPAD

表 1 重齿当归数量性状 Table 1 List of quantitative characteristics of Angelica biserrata

所有数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计算性状的最大值、最小值、中位数、平均值、标准差和变异系数；采用K-S正态性检验来判断数据分布是否符合正态分布；采用Pearson相关系数对数量性状间进行相关性分析；采用主成分分析数量性状对差异的贡献率；结合变异分析、相关性分析、主成分分析，对数量性状进行取舍；对保留的且符合正态分布的数量性状进行分级，分级标准参照刘孟军^[6]的概率分级法，5级中1~5级出现的概率分别为10%、20%、40%、20%和10%，3级中1~3级出现的概率分别为30%、40%和30%，采用(X-1.2818S)、(X-0.5246S)、(X+ 0.5246S)和(X+1.2818S)作为4个分点分为5级，或用(X-0.5246S)和(X+0.5246S)作为2个分点分为3级，其中，X为性状的平均值, S为性状的标准差。

对6份重齿当归种质资源的数量性状数据进行统计分析(表 2)。14个数量性状的中位数与均值相近，表明这些材料各性状分布比较规则，性状的变异主要是自然选择的结果；各性状的变异系数为6.47%~33.20%，表明各性状在种质间存在明显变异，变异系数最大的4个性状是叶面积(33.34%)、叶片数(33.17%)、叶序数(27.19%)、叶宽(23.60%), 说明这4个性状的遗传变异较为丰富；最小的性状为复叶回数(6.47%)，说明此性状比较稳定；其余性状的变异系数为11.13%~19.79%，说明这些性状的遗传变异相对稳定。

表 2(Table 2)

表 2 重齿当归叶片的形态数量性状的变异 Table 2 Variation analysis of Angelica biserrata quantitative characteristics 编号 No. 最大值 Max. 最小值 Min. 平均 Mean 中位数 Median 标准差 SD 变异系数/% Coefficient variation P C1 69.00 32.00 48.34 47.50 7.91 16.37 0.000 C2 133.00 50.00 92.10 93.00 17.69 19.21 0.027 C3 9.00 3.00 4.69 4.00. 1.27 27.19 0.127 C4 26.50 12.00 19.62 20.00 2.89 14.71 0.008 C5 11.17 5.38 7.69 7.66 1.20 15.62 0.014 C6 101.10 44.20 73.08 71.70 12.12 16.59 0.064 C7 4.00 3.00 3.93 4.00 0.25 6.47 0.553 C8 402.00 69.00 183.36 173.00 60.82 33.17 0.024 C9 7.85 2.30 4.17 3.98 0.98 23.60 0.153 C10 12.56 5.58 8.74 8.78 1.60 18.36 0.357 C11 37.42 14.41 22.33 22.11 4.42 19.79 0.598 C12 60.01 10.11 23.27 22.21 7.76 33.34 0.365 C13 0.49 0.19 0.32 0.33 0.05 16.44 0.000 C14 42.90 23.70 33.51 33.6 3.70 11.03 0.030 C1~C14见表 1。下表同。 C1-C14 see Table 1. The same is following Tables.

表 2 重齿当归叶片的形态数量性状的变异 Table 2 Variation analysis of Angelica biserrata quantitative characteristics

6份种质资源间的株高、复叶叶柄长度、叶厚度、冠幅、叶序数、复叶叶柄直径、叶片数和叶绿素含量等8个性状的差异显著(P < 0.05)；而叶柄夹角、叶宽、复叶回数、叶长、叶周长、叶面积等6个性状的差异不显著(P > 0.05)。

对重齿当归种质资源14个数量性状变异情况进行K-S正态性检验，结果表明, 除叶序数、复叶回数2个数量性状外，其他数量性状的P > 0.05，符合正态分布；其中叶序数的偏度和峰度绝对值均小于1，可按近似于正态分布处理；复叶回数的偏度和峰度的绝对值均大于1，不符合正态分布(表 3)。结合性状的变异与资源间的方差分析，将复叶回数性状去除，只对剩余13个性状进行后续分析。

表 3(Table 3)

表 3 重齿当归数量性状的K-S正态性检验 Table 3 K-S normality test of Angelica biserrata quantitative characteristics 编号 No. 极端差别Most extreme difference K-S P 偏度 Skewness 峰度 Kurtosis 绝对值Absolute value 正Positive 负Negative C1 0.086 0.086 –0.051 0.928 0.355 0.370 –0.419 C2 0.052 0.029 –0.052 0.556 0.917 –0.142 –0.437 C3 0.223 0.223 –0.148 2.402 0.000 0.963 0.949 C4 0.102 0.068 –0.102 1.022 0.248 –0.211 –0.086 C5 0.043 0.043 –0.037 0.455 0.986 0.296 0.035 C6 0.090 0.090 –0.043 0.965 0.309 0.324 –0.295 C7 0.378 0.358 –0.378 4.072 0.000 –3.447 10.053 C8 0.087 0.087 –0.032 0.932 0.350 0.627 0.751 C9 0.090 0.090 –0.083 0.984 0.287 1.292 2.798 C10 0.044 0.041 –0.044 0.487 0.972 0.118 –0.537 C11 0.055 0.055 –0.036 0.605 0.857 0.485 0.285 C12 0.073 0.073 –0.059 0.801 0.524 1.081 2.925 C13 0.099 0.099 –0.084 1.053 0.217 0.146 0.848 C14 0.076 0.061 –0.076 0.830 0.496 –0.055 0.178

表 3 重齿当归数量性状的K-S正态性检验 Table 3 K-S normality test of Angelica biserrata quantitative characteristics

对重齿当归的13个数量性状进行相关性分析(表 4)，结果表明，冠幅、叶序数和叶片数之间呈极显著正相关；叶片厚度与叶绿素含量呈极显著正相关；株高与叶序数呈显著正相关；复叶叶柄长度与叶宽、叶厚度呈显著负相关；复叶叶柄直径与叶厚度、叶绿素含量呈显著负相关；但相关系数偏低, 仅个别达到0.55，其余均不足0.50。叶宽、叶周长、叶长、叶面积间呈极显著正相关，相关系数为0.568~0.925，在实际操作中可以用叶宽来代表叶周长、叶面积、叶长等3个性状。

表 4(Table 4)

表 4 重齿当归数量性状间的相关系数 Table 4 Correlation coefficient among 13 quantitative characteristics of Angelica biserrata 编号No. C1 C2 C4 C3 C5 C6 C8 C9 C11 C10 C12 C13 C14 C1 1 C2 0.157 1 C4 –0.056 0.086 1 C3 0.224* 0.285** –0.049 1 C5 0.003 –0.134 0.066 0.026 1 C6 0.103 –0.020 –0.041 0.021 –0.059 1 C8 0.180 0.550** 0.005 0.386** –0.032 0.096 1 C9 –0.116 0.005 –0.203* 0.009 –0.034 –0.144 –0.114 1 C11 0.004 –0.076 –0.091 0.057 –0.112 –0.020 –0.099 0.835** 1 C10 0.038 –0.102 –0.060 0.067 –0.135 0.096 –0.026 0.568** 0.894** 1 C12 –0.027 –0.015 –0.142 0.056 –0.132 –0.022 –0.080 0.832** 0.925** 0.863** 1 C13 0.076 –0.028 –0.227* 0.144 0.219* 0.170 0.077 0.123 0.072 0.018 0.056 1 C14 –0.005 –0.034 0.103 0.107 0.235* 0.015 0.066 0.066 0.015 –0.042 –0.015 0.255** 1 *: P < 0.05; **: P < 0.01.

表 4 重齿当归数量性状间的相关系数 Table 4 Correlation coefficient among 13 quantitative characteristics of Angelica biserrata

主成分分析是研究多个变量相关性的一种多元统计方法，影响表型性状的因素较多，使用主成分分析可以清楚显示各因素在表型多样性构成中的作用^[7]。以特征值大于等于1为标准，提取5个主成分，累计贡献率达到72.27%，表明这5个主成分可基本反映上述13个表型性状的特征。第1主成分的贡献率最大，为26.93%，特征值为3.50，主要由叶片的长、宽、面积、周长决定；第2主成分的贡献率为15.53%，特征值为2.02，主要由叶片数、叶序数、株高、冠幅等决定；第3主成分贡献率为12.33%，特征值为1.60，主要由叶厚度、叶绿素含量、复叶叶柄直径等决定；第4主成分贡献率为9.34%，特征值为1.21，主要由复叶叶柄长度、叶柄夹角等性状决定；第5主成分贡献率为8.15%, 特征值为1.06，主要由复叶叶柄长度、叶柄夹角等性状决定。以得分系数大于0.1为标准，叶宽、叶长、株高、冠幅、叶柄夹角、叶片数、叶厚度、复叶叶柄长度、复叶叶柄直径、叶绿素含量等10个性状在2个以上主成分中起主要决定作用，而叶周长、叶面积、叶序数等3个性状仅在1个主成分中起主要决定作用。根据贡献率的大小，结合种质资源间的方差分析与性状相关性分析，将叶周长、叶面积、叶序数、叶长等4个性状去除，只对剩余9个性状进行后续分析。

剩余9个数量性状均符合正态分布或近似正态分布。叶厚度的标准差小，且变异系数低，采用(X-0.5246S)和(X+0.5246S)作为2个分点可分为3级; 其余数量性状均采用(X-1.2818S)、(X-0.5246S)、(X+0.5246S)、(X+1.2818S)作为4个分点可分为5级(表 5)。依据分点对数量性状进行分级(表 6)，将各数量性状的测定值依据分级标准进行频次的K-S正态性检验，表明各性状的频次分布均属正态分布，验证了此分级标准的合理性。

表 5(Table 5)

表 5 重齿当归数量性状分级的分点值 Table 5 Grading point of quantitative characteristics of Angelica biserrata 编号 No. 分点值Point value 1 2 3 4 C1 38.20 44.20 52.50 58.50 C2 69.40 82.80 101.40 114.80 C4 15.90 18.10 21.10 23.30 C5 6.20 7.10 8.30 9.20 C6 57.50 66.70 79.40 88.60 C8 105.40 151.40 215.30 261.30 C9 2.90 3.70 4.70 5.50 C13 0.29 0.34 C14 28.80 31.60 35.50 38.30

表 5 重齿当归数量性状分级的分点值 Table 5 Grading point of quantitative characteristics of Angelica biserrata

表 6(Table 6)

表 6 重齿当归数量性状的分级 Table 6 Grading range of quantitative characteristics of Angelica biserrata 性状Characteristics 1 2 3 4 5 株高Plant height (cm) ≤38.20 38.30~44.20 44.30~52.50 52.60~58.50 ≥58.60 冠幅Crown width (cm) ≤69.40 69.50~82.80 82.90~101.40 101.50~114.80 ≥114.90 复叶叶柄长度Petiole length (cm) ≤15.90 16.00~18.10 18.20~21.10 21.20~23.30 ≥23. 40 复叶叶柄直径Petiole diameter (mm) ≤6.20 6.30~7.10 7.20~8.30 8.40~9.20 ≥9.30 叶柄夹角Angle between petioles (°) ≤57.50 57.60~66.70 66.80~79.40 79.50~88.60 ≥88.70 叶片数Leaf number ≤105.40 105.50~151.40 151.50~215.30 215.40~261.30 ≥261.40 叶宽Leaf width (cm) ≤2.90 3.00~3.70 3.80~4.70 4.80~5.50 ≥5.60 叶厚度Leaf thickness (mm) ≤0.29 0.30~0.34 ≥0.35 叶绿素含量Content of chlorophyll (SPAD) ≤28.80 28.90~31.60 31.70~35.50 35.60~38.30 ≥38.40

表 6 重齿当归数量性状的分级 Table 6 Grading range of quantitative characteristics of Angelica biserrata

本研究采用方差分析、变异分析、K-S检验、相关性分析和主成分分析，对2 a生重齿当归叶片的数量性状进行取舍，去除叶序数、复叶回数、叶面积、叶周长和叶长5个性状，保留独立性较强的9个数量性状进行分级研究，8个数量性状被分为了5个连续分布的分级，1个数量性状被分为了3个连续分布的分级，这可作为今后开展重齿当归DUS测试指南研制、资源评价、新品种选育等工作的依据。

植物品种数量性状分级方法主要有极差等距法、概率分级法等。极差等距法分级计算简便，但分级点选取人为误差大，可靠性差。概率分级法一般用于正态分布，及偏度和峰度绝对值均小于或等于1的偏态分布性状的分级^[8]，以实测数据拟合数学分布函数，再计算概率分布，因此更加科学合理^[9]，已在多种植物的数量性状分级方面有所应用^[10–11]，并取得了比较理想的结果。

数量性状分级过少，可能会无法区分差异较小的品种，增加工作量和错误概率；分级过多，则无法排除品种内的差异、校正测量误差，可能会将相同品种的两个样本判定具有差异而造成错判^[12]。本研究中，所采用的数量性状的数据都符合正态分布、或近似正态分布，8个数量性状采用概率分级法分为5级，1个数量性状采用概率分级法分为3级。重齿当归的9个数量性状，理论上有100余万个赋值组合。我国独活还处于农家种时代，还没有经过审(认)定的品种出现，使用概率分级的结果为其数量性状赋值，有极大概率将重齿当归各个种质资源(或农家种，或品种)完全区分开。

数量性状间可能存在显著相关关系^[13]，本研究结果表明，叶宽与叶面积、叶周长，叶长与叶面积、叶周长的相关系数非常高，因此可考虑去除叶面积、叶周长性状，以减小误差，同时减少DUS测试的工作量；部分数量性状间虽有显著相关性，但相关系数较小，说明性状间存在较好的相对独立性，也证明这些数量性状作为测试性状是合理可行的。

重齿当归人工种植，第1年播种培育种苗，第2年移栽生产独活药材，第3年抽薹开花结实。不同生长发育时期，重齿当归的形态特征有明显差异，研制重齿当归DUS测试指南应考虑不同时期的性状差异。本文仅对第2年移栽的处于营养生长过程中的重齿当归叶片数量性状进行了研究，对其生殖生长过程中的数量性状(如株高、茎粗，以及花序与花朵、种子等方面)并未涉及，后续需要对其开展研究，为重齿当归DUS测试指南提供更为充分的参考依据。

重齿当归人工种植规模较小，集中在湖北、甘肃、重庆、陕西、宁夏等地。本研究的参试资源覆盖了重齿当归的主产区，资源代表性强，叶片8个性状上表现出显著差异，适合作为数量性状分级研究的对象。但参试资源均集中种植于鄂西地区，考虑到植物在不同生态区可能会有不同的表现，本研究结果可以作为鄂西、渝北等地区开展重齿当归DUS测试指南研制、资源评价、新品种选育等工作的依据。