2021, Vol. 29
表1(Table 1)
秋石斛(Dendrobium phalaenopsis)又称蝴蝶石斛，为兰科(Orchidaceae)石斛属常绿附生草本植物，是热带洋兰重要的切花和盆花之一。蝴蝶石斛原生种多分布于大洋洲的澳大利亚、新西兰和巴布亚新几内亚等国，杂交种多是由原产于新几内亚的热带原生种蝴蝶石斛为亲本育成[1]。21世纪初，中国开始从泰国、新加坡等国引进并大规模栽培，多见于三亚、昆明一带[2]。目前国内外关于蝴蝶石斛的研究较少，并且大多集中于栽培技术以及花色表现与基因表达方面，关于其提取物功效以及安全性的研究则极其少见。
花青素是构成植物花瓣和果实的主要色素之一，常见于花瓣、果实组织的表皮细胞与下表皮层，属于酚类物质中的类黄酮。大量研究表明，花青素具有较好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗衰老等功效，对于慢性疾病的治疗和预防、降低心血管疾病的发病率、糖尿病和肥胖症的预防等方面都有积极的作用，在医药行业、食品行业以及化妆品行业等都有较为广阔的应用空间[3–5]。
本研究主要对秋石斛‘三亚阳光’(D. phalae- nopsis ‘Sanya Sunny’)花瓣花青素提取物进行分析和评价。通过UPLC-QTOF-MS分析其主要花青素成分，通过DPPH自由基和FRAP自由基试验评价其体外抗氧化活性，通过家兔皮肤刺激和眼刺激试验评价其安全性，以期对秋石斛‘三亚阳光’的深度开发和应用提供理论和数据支持。
1 材料和方法 1.1 材料和试剂材料 健康秋石斛‘三亚阳光’(Dendrobium phalaenopsis ‘Sanya Sunny’)花瓣，由海南博大兰华科技有限公司提供。
试剂 分析纯矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(麦克林生化科技有限公司)，分析纯醋酸钠、硫酸亚铁(北京百灵威生物科技有限公司)，分析纯盐酸、乙酸、三氯化铁、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司), 三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine, TPTZ；上海华英化工有限公司)，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl, DPPH, 源叶生物科技有限公司), 抗坏血酸[维生素C, 阿法埃沙(中国)化学有限公司]。
仪器 UV-5500紫外可见分光光度计(上海元析仪器)，AR224CN分析天平(奥赛德仪器), JY92- ⅡN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，H1850离心机(湘仪离心机仪器有限公司); Acquity I-class超高效液相色谱，VION离子淌度四极杆飞行时间质谱联用仪(上海沃特世科技有限公司)。
1.2 花青素提取液的成分分析样品制备 取0.5 g秋石斛新鲜花瓣用液氮研磨，装入10 mL离心管中，加5 mL含有70%甲醇的0.1%盐酸水溶液，涡旋30 s，放入4℃冰箱冷藏24 h后，采用超声波提取30 min (超声频率75 Hz), 所得溶液在13 200×g离心10 min，取上清液1 mL进样，利用UPLC-QTOF-MS技术进行分析。
色谱条件 色谱柱: BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，(配备预柱)；柱温：45℃；流速：0.4 mL/min；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：0.1%甲酸乙腈(1/1)；洗针液：H2O/ACN (10/90)；进样体积：1 μL。依次用0~3 min, 95% A; 3~10 min, 80% A; 10~ 12 min, 0% A; 12~15 min, 5% A梯度洗脱。
质谱条件 采集模式：MSE (低能量/高能量切换扫描)；离子模式：电喷雾正离子/负离子分别扫描；毛细管电压：2 kV (positive)、2 kV (negative); 锥孔电压：40 V；雾化气温度：450℃；雾化气流量: 900 L/h；锥孔反吹气(Cone gas)：50 L/h；离子源温度(Source temp)：115℃；扫描范围：m/z 50~1 000; 扫描速度：0.2 s；碰撞能量：6 eV/20~45 eV；在线锁定质量(在线校正Lockmass)：250 pg/µL亮氨酸脑啡肽持续进样，流速：10 µL/min；采集间隔(sample time)：0.5 s；采集时间：0.5 s；碰撞能量：6 eV。
1.3 总花青素提取矢车菊素标准曲线制备 参照Hui等[6]的方法，在弱光下称取矢车菊素对照样品至50 mL容量瓶中，用0.1%盐酸水溶液和95%乙醇水溶液(1∶1)溶解、定容制成不同浓度的矢车菊素对照品溶液，在最大吸收波长518 nm下测吸光度，并绘制标准曲线。
总花青素的提取 采用超声波辅助提取法。取新鲜秋石斛花瓣，60℃烘箱烘干至恒重，粉碎后过60目筛，称取0.05 g干粉加入2.5 mL提取剂进行超声提取，超声时间30 min，功率55 W。之后在9 000×g下离心10 min，取上清液，稀释10倍后在518 nm处测定吸光度值A，根据标准曲线计算总花青素的含量，重复3次。
1.4 总抗氧化能力的测定参考Yang等[7]的FRAP方法绘制标准曲线和测定。量取0.1 mL样品溶液置于10 mL离心管中, 加入3 mL FRAP工作液，再加入去离子水至4 mL, 混合均匀，精确反应5 min，以去离子水为参比, 测量593 nm波长处的吸光度，并根据标准曲线计算抗氧化活性，以抗坏血酸为阳性对照，重复3次。
1.5 DPPH∙自由基的清除能力测定参照Cheng等[8]的方法，取2 mL 0.5 mmol/L的DPPH溶液与1 mL各浓度样品提取液、70%乙醇水溶液混合，精确反应10 min，测量波长517 nm处的吸光度值A1。以抗坏血酸作为阳性对照，2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL 70%乙醇水溶液的吸光度值A0, 1.0 mL样品溶液+3.0 mL 70%乙醇水溶液的吸光度值A2。DPPH∙清除率K1=[1-(A1-A2)/A0]×100%。
1.6 花青素提取液刺激性分析皮肤刺激性评价 参考Qian等[9]的方法稍作修改。雄性家兔分为4组，每组3只。在给药前24 h, 在家兔背部两侧对称各剪出两块2.5 cm× 2.5 cm的皮肤，剃净兔毛，左侧两块用无菌刺血针作“井”字形划痕。用盐酸乙醇溶液稀释后得1.0、0.5、0.25 g/L的秋石斛花青素提取液，取提取液0.2 mL, 涂抹完整皮肤和破损皮肤各1块。涂药后纱布覆盖, 用无刺激胶布固定。用药24 h后用温水清洗掉受试物，分别于1、24、48、72 h后在同一自然光线下观察和记录用药部位出现红斑和水肿的情况。出现红斑情况划分为5级，即无红斑、勉强可见、明显红斑、严重红斑和紫红色红斑并有焦痂形成，分别赋予0~4分；出现水肿情况也划分为5级，即无水肿、勉强可见、皮肤隆起(边缘高出周围皮肤)、水肿隆起约1 mm和水肿隆起大于1 mm且范围扩大，分别赋予0~4分。根据皮肤刺激反应评分标准进行评分并计算积分，积分值=(Σ1红斑+Σ2水肿)/动物总数, 0~0.5分为无刺激性；0.6~2.0分为轻度刺激性; 2.1~ 6.0分为中度刺激性；6.1~8.0分为强刺激性。依据皮肤刺激强度评价提取物对皮肤的刺激强度。
眼刺激性评价 参照Zhang等[10]的方法稍作修改。家兔分为4组，每组3只，取各浓度花青素提取液各0.1 mL，滴入家兔一侧眼睛的结膜囊中, 上下眼睑被动闭合1 s；另一侧眼睛不滴，24 h内也不冲洗，作为对照。滴入受试物1、24、48、72 h以及4和7 d后检查家兔眼睛，若72 h未出现刺激反应可终止实验。若有累积角膜或者眼的其他刺激作用, 并且7 d内不恢复，则需要延长观察时间以确定该损伤是否可逆。按照眼损伤的评分标准(表 1)记录眼刺激反应的积分，积分值=(Σ1角膜+Σ2虹膜+Σ3结膜充血+ Σ4结膜水肿+Σ5结膜分泌物)/动物总数[9]。0~3分为无刺激性; 4~8分为轻度刺激性；9~12分为中度刺激性; 13~ 16分为重度刺激性。
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表 1 眼损害的评分标准 Table 1 Scores of stimulus response on eyes |
花青素是酸性化合物，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为洗脱流动相，用TOF/MS全扫描检测，正离子扫描模式，用UNIFI质谱软件分析确定每个离子峰的质谱裂解规律，对比相关文献和标准品进行化合物鉴定。结果从秋石斛兰花青素提取液中共检测出15个花青素成分，苷元有飞燕草素、矢车菊素、锦葵素、矮牵牛素和芍药素(表 2，图 1)。
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表 2 秋石斛的花青素类成分 Table 2 Anthocyanins in Dendrobium phalaenopsis |
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图 1 秋石斛的花青素提取液总离子流图 Fig. 1 Total ion flow diagram of anthocyanin extract of Dendrobium phalaenopsis |
获得的硫酸亚铁标准曲线的拟合方程为y=0.0053x+0.0948，相关系数R2=0.999，表明线性关系良好，线性范围为0~160 μmol/L。从图 2可见, 以抗坏血酸(Vc)为阳性对照，在一定浓度范围内, Vc与秋石斛花青素提取液的总抗氧化能力(FRAP)均随浓度上升而增强，且呈现出一定的线性趋势, 但花青素的FRAP明显高于同浓度的Vc。
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图 2 秋石斛兰花青素提取液的总抗氧化能力 Fig. 2 Total antioxidant capacity of anthocyanin extract of Dendrobium phalaenopsis |
从图 3可见，在一定浓度范围内，抗坏血酸与秋石斛花青素对DPPH·清除率均随浓度的升高而增大，在0.02~0.06 g/L时二者曲线呈现一定的线性趋势，后期斜率下降，表明此时抗氧化剂浓度的增高对清除率的影响降低。当浓度大于0.12 g/L时, 二者对DPPH·的清除率均达到96%。秋石斛花青素和抗坏血酸对DPPH·的半数最大清除浓度(IC50)分别是0.027和0.034 g/L，说明秋石斛花青素对DPPH·自由基有较强的清除能力。
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图 3 秋石斛兰花青素提取液对DPPH·的清除能力 Fig. 3 DPPH· scavenging ability of anthocyanin extract of Dendrobium phalaenopsis |
从表 3可见，小于1.0 g/L的花青素提取液对家兔的正常皮肤和破损皮肤均没有刺激性。花青素提取液涂抹1 h后，部分家兔皮肤出现勉强可见的红斑，正常皮肤对照组在1 h后未见红斑和水肿，但在24 h后出现红斑，可能是家兔的个体差异导致刺激反应的延迟。48 h后所有家兔皮肤均恢复正常。
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表 3 秋石斛兰花青素提取液的皮肤刺激反应 Table 3 Skin irritation of anthocyanin extract of Dendrobium phalaenopsis |
从表 4可见，低于1.0 g/L的花青素提取液对家兔眼睛无刺激性，而1.0 g/L提取液的刺激性较大。72 h后，所有家兔的眼睛均能恢复。
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表 4 眼刺激反应实验结果 Table 4 Stimulus response on eyes |
本研究选取广泛应用于切花、盆栽的重要热带兰秋石斛‘三亚阳光’品种，提取并分析了其花瓣花青素成分，并对其体外抗氧化性和刺激性进行了研究。目前对秋石斛花青素组成的研究很少。20世纪80年代，Kanchit采用高效液相色谱方法研究了秋石斛属28种植物及杂交后代的类黄酮苷元组成, 花瓣中含有矢车菊素和芍药花素、天竺葵素[11]；李崇晖等[12]用HPLC-MS技术分析了6个蝴蝶石斛兰品种的花青素成分，以矢车菊素苷元为主。本试验中检测出4个以飞燕草素为苷元的花青素苷，此前尚未在蝴蝶石斛兰中检出, 这可能是品种和检测技术不同造成的, UPLC的灵敏度和分离能力均高于HPLC。
本研究结果表明，在花青素提取物中共检出15个花青素成分，苷元为飞燕草素、矢车菊素、芍药素、矮牵牛素和锦葵素，此前在大马士革玫瑰(Rosa damascene)、蓝莓(Vaccinium corymbosum)、杜鹃花(Rhododendron simsii)等的花青素提取液中有检出以飞燕草色素为苷元的花色素[13–15]，但并未在秋石斛中检出，可能是品种间的差异以及检测技术灵敏度的强弱不同导致的。飞燕草色素是一种天然的抗氧化剂，且具有治疗炎性疼痛的临床潜力[16–17]，也有研究表明飞燕草色素可减少阿尔兹海默症模型大鼠海马区淀粉样蛋白斑块的形成，有辅助治疗阿尔兹海默症等认知障碍疾病的潜力[18]。
不同抗氧化剂发挥作用的机制不同，但通常包括自由基清除、减缓或抑制脂质氧化等[19–20]，总抗氧化能力以及对DPPH·的清除能力常用于评价植物提取物的抗氧化性[21]。本研究表明秋石斛‘三亚阳光’花青素提取物具有良好的抗氧化效果，花青素提取物浓度为0.13 g/L时，FRAP值达到了285 μmol/L, 而同浓度的抗坏血酸则是136 μmol/L。花青素提取物和抗坏血酸清除DPPH·的IC50值分别是0.027和0.034 g/L，花青素提取物的DPPH∙自由基的清除能力强于同浓度的抗坏血酸。
安全性是评价提取物能否进行后续开发利用的重要评判标准，而刺激性是安全性的重要指标之一。刺激性通常包括对皮肤和眼睛的刺激。本研究结果表明，低于1.0 g/L的花青素提取液对家兔皮肤和眼睛均没有刺激性。按照美国CIR的植物提取物安全评价决策树[22]，秋石斛一般是用于切花和盆花，也被广泛应用于餐桌花中，但是，对于其提取物的表征还不够完善，以后对其进行安全评价时应进一步完善。此外，本试验中花青素提取物浓度最高为1.0 g/L，以后可探讨对眼和皮肤无刺激反应的最高使用剂量。
秋石斛‘三亚阳光’作为一种广泛应用于盆栽和切花的热带兰品种，在医药、食品、化妆品等领域也都具有潜在的应用价值。兰科石斛属的种类繁多，但石斛作为一种重要的中药材，自然繁殖难, 生长周期长，远不能满足目前的市场需求，所以从石斛属的植物中筛选出更多的药用品种是解决目前石斛资源短缺的方法之一[23–26]。本研究为秋石斛的深度开发提供了理论依据和数据支撑，以期秋石斛‘三亚阳光’能够在更广泛的领域实现更大的价值。
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