木芙蓉(Hibiscus mutabilis)隶属于锦葵科(Mal- vaceae)木槿属植物，原产于中国，是我国的传统名花，因其谐音福与荣，具美好寓意深受人们的喜爱与传颂^[1]。其花色丰富、花型美丽、花期较长，品种繁多，是园林绿化常用的秋季观花灌木或小乔木，现广泛分布于亚洲、非洲、北美、南美等热带亚热带地区。但长期以来的人工选育和自然杂交导致木芙蓉品种间遗传关系错综复杂、亲缘关系不明、分类和进化关系模糊，因此，对木芙蓉进行品种分类以及探讨其亲缘关系，对于木芙蓉品种间杂交以及新品种的选育具有重要意义。

花粉的遗传稳定性极强，花粉形态特征在一定程度上可反映植物演化和亲缘关系，并对物种鉴定有一定的分类价值^[2–4]。某些植物不同品种虽然在外观形态上十分相似，但其花粉形态特征仍有差异^[5], 花粉形态研究在植物分类、系统发育、起源与演化等方面得到广泛应用^[6–7]，然而目前针对木芙蓉品种花粉形态的研究尚属空白。本研究用扫描电镜对木芙蓉19个品种的花粉形态进行观察并进行聚类分析，以探讨木芙蓉品种间的亲缘关系以及其分类学意义，为木芙蓉的品种分类和优良品种的选育提供孢粉学依据。

供试材料为木芙蓉(Hibiscus mutabilis)的19个品种(表 1，表 2，图 1)，均采自成都市植物园。

表 1(Table 1)

表 1 木芙蓉品种信息及亲本来源 Table 1 Information of Hibiscus mutabilis cultivars 编号 No. 品种 Cultivar 花期 Florescence 亲本 Parents 花色 Flower color 1 ‘大红’ ‘Dahong’ 9-10 不详Unknow 红色Red 2 ‘醉红’ ‘Zuihong’ 9-11 ‘醉芙蓉’ב大红’ ‘Zuifurong’בDahong’ 红色Red 3 ‘锦碧玉’ ‘Jinbi yu’ 8-10 不详Unknow 红色Red 4 ‘C-7’ 9-10 不详Unknow 红色Red 5 ‘单瓣红’ ‘Danbanhong’ 7-9 不详Unknow 粉红色Pink 6 ‘玉蕊’ ‘Yurui’ 8-10 ‘单瓣红’ב大红’ ‘Danbanhong’בDahong’ 粉红色Pink 7 ‘牡丹红’‘Mudanhong’ 9-10 ‘单瓣红’ב大红‘Danbanhong’בDahong’ 粉红色Pink 8 ‘醉云’ ‘Zuiyun’ 8-10 不详Unknow 粉红色Pink 9 ‘金秋颂’ ‘Jinqiusong’ 9-10 ‘单瓣白’ב牡丹粉’ ‘Danbanbai’בMudanfen’ 粉红色Pink 10 ‘锦蕊’ ‘Jinrui’ 9-11 不详Unknow 粉红色Pink 11 ‘牡丹粉’ ‘Mudanfen’ 8-10 ‘单瓣红’ב大红’ ‘Danbanhong’בDahong’ 粉红色Pink 12 ‘台湾1’ ‘Taiwan Ⅰ’ 8-10 不详Unknow 粉红色Pink 13 ‘台湾2’ ‘Taiwan Ⅱ’ 8-10 不详Unknow 粉红色Pink 14 ‘台湾3’ ‘Taiwan Ⅲ’ 8-10 不详Unknow 白色White 15 ‘重瓣白’ ‘Chongbanbai’ 9-10 不详Unknow 白色White 16 ‘单瓣白’ ‘Danbanbai’ 6-10 不详Unknow 白色White 17 ‘醉芙蓉’ ‘Zuifurong’ 9-10 不详Unknow 粉白至红色Pink-white to red 18 ‘重瓣白变红’ ‘Chongban Baibianhong’ 9-10 不详Unknow 粉白至红色Pink-white to red 19 ‘单瓣白变红’ ‘Danban Baibianhong’ 9-10 不详Unknow 粉白至红色Pink-white to red

表 1 木芙蓉品种信息及亲本来源 Table 1 Information of Hibiscus mutabilis cultivars

表 2(Table 2)

表 2 19个木芙蓉品种的花部特征 Table 2 Flower characteristics of 19 cultivars of Hibiscus mutabilis 编号 No. 花瓣Petal (cm) 花径(cm) Flower diameter 柱头长(cm) Stigma length 花柄长(cm) Flower stalk length 长Length 宽Width 1 6.00±0.20cde 5.50±0.10gh 10.20±0.17ij 2.50±0.10hi 2.90±0.10a 2 5.10±0.10g 5.70±0.20fgh 10.60±0.10ghi 4.10±0.26ab 2.90±0.10a 3 4.05±0.31h 3.80±0.20m 10.00±0.20j 2.10±0.26j 2.93±0.15a 4 5.00±0.10g 4.20±0.20l 11.00±0.20efgh 3.00±0.10def 1.67±0.15def 5 6.80±0.10b 6.00±0.30ef 12.40±0.10c 3.80±0.30bc 1.93±0.06cd 6 7.00±0.36b 5.30±0.20hi 11.00±0.70efgh 3.00±0.20def 1.83±0.21cde 7 7.20±0.20a 6.10±0.36de 11.60±0.10de 3.50±0.30cd 1.50±0.20fg 8 7.00±0.20ab 6.00±0.17ef 13.80±0.20a 3.20±0.20de 2.30±0.20b 9 5.70±0.20ef 4.60±0.10k 10.40±0.40hij 2.80±0.26fgh 1.90±0.17cd 10 6.80±0.17b 7.30±0.10a 14.00±0.30a 4.30±0.20a 1.47±0.15fg 11 6.70±0.10b 6.40±0.10cd 13.20±0.10b 3.00±0.20def 2.00±0.00c 12 6.00±0.10cde 5.30±0.30hi 11.00±0.70efgh 3.70±0.30c 1.27±0.58g 13 5.60±0.20f 5.80±0.20efg 10.90±0.10fgh 3.00±0.00def 1.57±0.31ef 14 6.20±0.20c 6.80±0.10b 12.50±0.20c 3.10±0.10de 0.90±0.10h 15 6.20±0.10c 5.00±0.17j 12.00±0.10cd 2.70±0.10gh 1.47±0.58fg 16 6.30±0.36c 5.40±0.26hi 11.00±0.00efgh 2.90±0.17efg 3.03±0.30a 17 6.10±0.10cd 6.40±0.20cd 11.50±0.20def 2.30±0.10ij 2.57±0.12b 18 5.80±0.20def 5.20±0.10i 11.20±0.26efg 2.50±0.10hi 0.97±0.06h 19 6.80±0.26b 6.50±0.10bc 14.00±0.60a 3.00±0.20def 1.90±0.20cd n=3; 同列中不同字母表示差异显著(P < 0.05)。 n=3; Data followed different letters within column indicate significant differences at 0.05 level.

表 2 19个木芙蓉品种的花部特征 Table 2 Flower characteristics of 19 cultivars of Hibiscus mutabilis

图 1(Fig. 1)

图 1 19个木芙蓉品种花部形态。1~19见表 1。下图表同。 Fig. 1 Flower morphology of 19 varieties of Hibiscus mutabilis. 1-19 see Table 1. The same is following Tables and Figures.

花粉采集和处理    参考彭向永等^[8]的方法, 在木芙蓉盛花期, ‘单瓣红’、‘重瓣白变红’的花粉于9月26日，其余品种均于10月17日，当天天气晴朗，上午9-10点采集开放程度一致的花朵，每品种取同一植株的3个花朵，记录花部特征后用镊子夹取整个花序，放入硫酸纸盒中带回实验室，于室温下自然干燥24 h，收集自然散粉保存于密封玻璃容器中备用待测。

电镜制样及花粉形态观察    粘取经CO₂临界点干燥后的备用花粉用双面胶固定于载物台上, 真空喷金镀膜，在SU3500型扫描电子显微镜下选取有代表性的视野，观察花粉粒形态和外壁纹饰特征并拍摄。参考刘金兰等^[9]、彭焕文等^[10]对锦葵科植物花粉形态的描述，测量花粉直径、刺长、刺基部宽度、刺数量等指标，每个样品随机选取20粒花粉粒进行测量，取平均值。

采用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 20.0对数据进行统计分析，采用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行主成分分析和Q聚类分析。

花粉粒特征和大小    由图 2可见，19个木芙蓉品种的花粉粒均为单粒圆球形或近圆球形, 花粉(不含刺)直径为96.50~148.75 μm，平均为108.95 μm，其中‘锦蕊’的最大，为148.75 μm，‘金秋颂’的最小，为96.50 μm，变异系数分别为1.59%和2.95%。同时‘锦蕊’的花粉粒中有较多变形的, 形态差异明显。花粉粒表面为刺状纹饰且有小的颗粒状突起，刺为圆锥或圆台状，先端略尖或钝圆。花粉粒具散孔，萌发孔形状不规则, 大多位于两刺之间，均匀环绕分布于花粉表面，部分品种(‘金秋颂’、‘单瓣白’、‘醉芙蓉’、‘醉红’、‘锦碧玉’、‘C-7’、‘锦蕊’、‘醉云’)花粉的萌发孔有孔盖。‘牡丹粉’、‘牡丹红’、‘玉蕊’、‘锦蕊’花粉具有二型性现象。

图 2(Fig. 2)

图 2 19个木芙蓉品种花粉粒显微形态。标尺: 1~9, 11~19=50 μm, 10=70 μm; 20: 花粉局部放大, 标尺为15 μm Fig. 2 Pollen micromorphology of 19 Hibiscus mutabilis cultivars. Bars: 1-9, 11-19=50 μm, 10=70 μm, 20: Enlarged pollen, bar=15 μm

表面纹饰    19个木芙蓉品种花粉粒表面纹饰为刺状，刺基部较平，‘醉红’的刺基部略微隆起，刺表面分布有细小点状颗粒突起。刺长为11.65~ 17.79 μm，平均15.35 μm，变异系数为4.62%，‘锦蕊’的最长，为17.79 μm；‘金秋颂’的最短，为11.65 μm, 变异系数分别为6.54%和2.58%。‘大红’花粉的刺基部宽度最大，为8.27 μm，‘单瓣白变红’的最小，为5.40 μm。刺间距离平均为24.87 μm，变异系数为9.16%，以‘锦蕊’的最大，为27.41 μm，‘金秋颂’的最小，为22.48 μm。刺长/刺基部宽度和花粉直径/刺长可以反映刺状纹饰的形态, ‘单瓣白变红’的刺长/刺基部宽度最大，为2.64，说明刺状纹饰较为细长；‘醉芙蓉’的刺长/刺基部宽度最小，为1.87, 说明刺状纹饰粗短。‘重瓣白变红’的花粉直径/刺长最大，为8.75，说明刺状突起较短；‘台湾芙蓉1’的最小，为5.51，说明刺状突起较长。

萌发孔    木芙蓉具散孔，大部分品种(‘单瓣红’、‘大红’、‘牡丹红’、‘牡丹粉’、‘玉蕊’、‘台湾芙蓉1’、‘台湾芙蓉2’、‘台湾芙蓉3’、‘重瓣白’)花粉的萌发孔呈圆形或长椭圆形，且呈环状等距离排列于花粉表面^[11]。部分品种(‘单瓣白’、‘单瓣白变红’、‘重瓣白变红’、‘金秋颂’)萌发孔具圆形或者椭圆形孔盖，‘锦蕊’花粉的萌发孔不明显，但萌发孔位置略微突起。

为了确保所选指标的有效性与相关性，对花粉粒9个数量指标进行主成分分析，包括直径、刺长、刺尖宽、刺中宽、刺基宽、刺间距、刺数目、刺长/刺基宽、花粉直径/刺长。结果表明，影响品种分类的第一主成分主要包括刺长、刺间距、刺长/刺基宽；第二主成分以直径、刺尖宽、刺数目为主; 第三主成分主要为刺基宽和刺中宽。3个主成分可以包含木芙蓉花粉形态指标的大部分信息，累计贡献率为84.501%，且各主成分所含指标具有代表性, 可以用于对木芙蓉花粉进行Q型聚类分析。

表 3(Table 3)

表 3 木芙蓉孢粉刺的形态特征(n=20) Table 3 Morphological characteristics of spine on Hibiscus mutabilis pollen (n=20) 编号 No. 直径 Diameter (D, μm) 长度 Length (L, μm) 宽度Width (μm) 间距 Distance (μm) 数量 Number 长度/基宽 L/BW 直径/长度 D/L 尖部 Tip 中部 Middle 基部 Base (BW) 1 112.35±2.96 16.27±0.63 3.03±0.42 4.29±0.23 8.27±1.24 27.35±1.42 113.60±6.14 2.01 6.91 2 103.42±4.39 14.83±1.03 3.42±0.38 3.80±0.32 5.94±0.83 23.26±2.42 111.20±10.67 2.48 7.15 3 103.98±2.68 14.15±0.60 2.84±0.28 3.86±0.38 7.02±0.93 24.36±1.68 119.60±8.89 2.02 7.35 4 108.36±4.88 16.25±0.92 3.27±0.31 4.61±0.29 7.70±0.79 25.69±2.68 111.00±5.93 2.11 6.74 5 109.63±3.70 16.96±0.99 3.47±0.32 4.47±0.25 7.63±1.12 23.76±2.18 117.80±7.40 2.26 6.49 6 112.41±2.67 15.46±0.53 3.14±0.41 4.17±0.31 8.17±1.01 22.86±5.32 114.55±8.81 1.92 7.28 7 117.72±1.69 16.12±1.09 3.33±0.32 3.96±0.26 7.62±1.03 24.73±2.46 106.50±4.84 2.16 6.96 8 108.17±3.30 16.50±0.85 3.83±0.39 4.34±0.26 6.89±0.57 23.62±1.96 120.00±8.71 2.41 6.57 9 96.50±1.53 11.65±0.76 2.91±0.24 3.65±0.24 6.05±0.67 22.48±1.90 114.00±4.62 1.95 8.31 10 148.75±4.38 17.79±0.46 3.65±0.25 4.18±0.35 6.82±0.68 27.41±2.51 170.90±10.47 2.63 8.41 11 119.90±3.73 16.57±0.49 3.56±0.36 4.48±0.41 6.85±0.78 26.26±2.23 109.05±9.28 2.45 6.76 12 100.44±2.18 18.30±0.51 2.55±0.20 4.00±0.36 7.35±0.67 28.31±3.25 104.80±6.82 2.50 5.51 13 103.26±4.06 17.00±0.82 2.58±0.22 4.03±0.25 7.11±0.65 26.47±2.29 107.20±7.74 2.41 6.08 14 106.97±2.56 15.88±0.69 2.89±0.21 4.05±0.26 6.93±0.82 26.77±1.71 117.80±9.04 2.32 6.77 15 106.28±4.05 15.85±0.65 2.84±0.44 4.15±0.45 7.33±0.84 26.06±1.73 105.40±8.64 2.19 6.71 16 110.97±3.61 13.79±0.41 3.45±0.29 3.79±0.24 5.52±0.64 24.86±1.71 113.00±7.09 2.53 8.06 17 100.52±4.78 11.84±0.58 3.32±0.40 4.20±0.42 6.38±0.62 22.35±1.89 122.85±12.83 1.87 8.51 18 107.25±9.19 12.30±0.58 2.97±0.39 4.05±0.36 6.20±0.65 20.03±1.51 136.00±10.38 2.01 8.75 19 107.16±4.92 14.07±0.74 2.88±0.39 3.30±0.28 5.40±0.79 25.98±2.11 122.00±8.32 2.64 7.73

表 3 木芙蓉孢粉刺的形态特征(n=20) Table 3 Morphological characteristics of spine on Hibiscus mutabilis pollen (n=20)

根据花粉粒直径、刺长、刺尖宽、刺中宽、刺基宽、刺间距、刺长/刺基宽和直径/刺长等指标, 对19个木芙蓉品种采用平方欧氏距离法进行Q聚类分析。结果表明(图 3)，在遗传距离为12时，19个品种可分为3类，类型Ⅰ包含‘重瓣白’、‘台湾芙蓉3’、‘牡丹红’、‘锦碧玉’、‘单瓣红’、‘C-7’、‘大红’、‘玉蕊、‘牡丹粉’、‘醉云’、‘台湾芙蓉1’和‘台湾芙蓉2’共12个品种，具有花粉粒直径较大(除‘台湾芙蓉1’、‘台湾芙蓉2’外)，刺细尖的特征; 类型Ⅱ仅有1个品种‘锦蕊’，花粉直径最大，刺长最长，刺数量最多；类型Ⅲ有‘重瓣白变红’、‘金秋颂’、‘醉芙蓉’、‘单瓣白’、‘醉红’、‘单瓣白变红’共6个品种，具有花粉粒直径较小(除‘重瓣白变红’、‘单瓣白变红’、‘单瓣白’外)，刺间距较小, 刺短粗的特征。

图 3(Fig. 3)

图 3 19个木芙蓉品种基于花粉形态的聚类图 Fig. 3 Cluster map of 19 cultivars of Hibiscus mutabilis based on pollen morphology

前人的研究结果表明^{[10, 12–13]}，锦葵科植物花粉形态的进化趋势如下：(1) 花粉形状：近球形→球形；(2) 花粉大小：中等(直径25~50 μm)→较大(直径50~100 μm)→大(100~200 μm)；(3) 萌发孔：3孔沟→少量散孔→大量散孔；(4) 表面纹饰：刺短钝→刺长尖；基部膨大→基部平整；具单型刺→具二型刺；花粉表面平滑或少量突起→花粉表面密集颗粒状突起。19个木芙蓉品种的花粉直径为96.50~148.75 μm，属大粒花粉；具大量散孔，基部平整，说明木芙蓉在锦葵科中可能属于较为进化的类群。

与植物其他形态特征相比，花粉形态在植物系统发育过程中具有遗传稳定性和保守性，是建立植物高等级分类阶元的重要依据。观赏植物如欧洲栎(Quercus robur)、牵牛花(Pharbitis nil)、木兰(Magnolia liliflora)等^[14–16]采用孢粉学特征进行亲缘关系的鉴定和分类研究已取得较好的效果。有学者认为植物品种间的花粉特征存在差异，据此可以进行归类并大致判断亲缘关系^[17–20]。因此，本研究根据木芙蓉不同品种间花粉表面刺状纹饰的差异进行归类，对大致了解品种间的亲缘关系有重要的参考价值。有研究表明，花粉表面刺由短到长，花粉体积由小到大是锦葵科植物花粉的进化方向^[12], 本研究中第Ⅲ类品种的花粉直径较小，表面刺状纹饰较短，刺间距离较小，刺短粗，推断这些品种属于相对原始的品种，且亲缘关系较近。另一方面, ‘醉红’是以‘醉芙蓉’为母本培育的杂交后代，‘金秋颂’是以‘单瓣白’为母本的杂交后代，且‘醉红’和‘醉芙蓉’花粉形态特征与形态学特征表现出一定的相关性，这也进一步佐证了孢粉学结果的可靠性。类型Ⅰ花粉表现出较为进化特征(花粉较大、刺细尖), 说明这12个品种的亲缘关系较近且较为进化，同时，从遗传背景来说，‘牡丹红’、‘牡丹粉’、‘玉蕊’等3个品种是分别以‘大红’和‘单瓣红’为父母本培育而来的杂交后代，这也说明孢粉学聚类分析结果对于品种分类及亲缘关系的鉴定具有一定的参考价值。‘锦蕊’被单独归为一类，其花粉特征最为进化。

研究表明，同一植物个体产生不同的花粉形态有利于植物的进化^[21]，引起花粉形态出现差异的原因主要有环境条件或者遗传因素，地理分布和生态因子会对种内不同群体间的花粉形态产生影响^[22], 针对不同野生居群间的植物而言，不同生态因素及地理历史隔离对于花粉形态的影响作用较大^[23]。而相对于栽培品种来说，花粉形态差异则可能与遗传因素更为相关。不同品种间的花粉形态存在差异, 可以作为品种分类和亲缘关系鉴定的依据，研究表明，同一栽培品种内花粉可能也存在明显的差别。本研究结果表明，在相同的花粉处理条件下，‘锦蕊’品种花粉出现皱缩变形、破裂空瘪或大小差异明显的现象，这在三角梅(Bougainvillea spectabilis)、小苍兰(Freesia hybrid)、八仙花(Hydrangea macro- phylla)栽培品种中也有出现^[24–26]，推测可能是在人工的品种选育过程中栽培品种的遗传组成高度杂合，导致花粉性状差，出现花粉败育、生殖能力减弱和不能正常结实的概率增加，‘锦蕊’的花粉性状特点就与其自身的雌雄蕊发育变异、花粉败育、结实率低等生物学特性相吻合。

本研究表明，花粉形态在木芙蓉不同品种间存在许多共性，具有区别于锦葵科木槿属其他种的特征^{[10, 28]}。然而，不同品种的花粉间也存在一定的差异，是进行品种间鉴定的重要依据。木芙蓉花粉粒直径较大，具散孔，表面具刺状纹饰且有许多大小不一的颗粒状突起，刺基部平坦，由此，可以通过花粉刺的数目和萌发孔位置来区分木槿(Hibiscus syriacus)^[27]和木芙蓉。栽培品种间在花粉粒大小、刺数目、外壁纹饰存在的差异表明了木芙蓉品种间存在遗传多样性和遗传分化。花粉形态直观反映了木芙蓉19个品种间亲缘关系和分类地位，杂交子代与亲本的亲缘关系越近，遗传距离越小，这为分析亲本与杂交子代的关系提供参考依据。然而，个别品种(‘锦蕊’)的花粉形态与亲本的差异较大，可能属于超亲表达现象^[28]。

随着科学技术的发展，育种进程的不断加快, 亟需在形态学以外拓展分类标准，本文首次对19个木芙蓉品种的花粉进行扫描电镜观察，将孢粉学形态特征作为辅助分类方法，为木芙蓉栽培品种的分类及其亲缘关系鉴定提供了孢粉学的科学依据。但这种方法也存在因选取不同特征指标对分类结果及准确性产生较大影响的不足。因此，还应结合形态学、分子标记等试验方法进行验证和修正。