2021, Vol. 29
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 顺德职业技术学院, 广东 佛山 528300
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Shunde Polytechnic, Foshan 528300, Guangdong, China
植物展示出非凡的再生能力，保证发育的可塑性。植物干细胞是未分化的细胞，位于分生组织, 未分化的状态为稳定的遗传性、较高的线粒体活性以及很强的分化和自我更新能力等奠定了基础[1–2]，进而对环境变化信号快速响应和对植物发育进程参与调控[3]。植物细胞全能性在生物技术上具有广泛的应用市场。目前对于植物的干细胞研究主要在拟南芥(Arabidopsis thaliana)等的茎尖干细胞[4–5]、水稻(Oryza sativa)等的根尖干细胞[6]上，植物干细胞发生机理在种苗生产、生物技术等领域扮演举足轻重的角色。
WOX家族(WUSCHEL-related homeobox)是真核细胞homeobox (HB)超家族中的一员[7–8]。WOX转录因子具有“螺旋-环-螺旋-转角-螺旋”的典型结构[8–9]，在植物发育过程中扮演重要的调控角色[10–11]，包括在植物干细胞维持、胚胎形成及茎干、根和花的发育等。有研究表明，WOX5在根和茎分生组织中干细胞生态位的发育上具有重要作用[11–12]；植物的胚胎发育是个复杂的过程，不仅受到运输调控, 而且受到局部生长素反应的影响[13]，WOX可以决定植物胚胎发育的细胞命运[12]；在根发育中, WOX11在不定根基源细胞中表达[12, 14]以激活LBD16，进而保证根的正常发育；在形成层干细胞中，WOX4和其余WUS成员在干细胞维持中起重要作用[15–16]; WOX转录因子在花的结构和发育上具有重要的调控作用[17]，WUS被认为是花干细胞维持必需的基因[17–18], 在矮牵牛(Petunia hybrid)和烟草(Nicotiana tabacum)中WOX1是保证花器官结构正常的必需基因[19–20]。WUS家族蛋白成员可以分为3个进化支: 分别为WUS、Ancient和Intermediate[8]，但对其功能还不清楚。
铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科(Orchi- daceae)石斛属草本植物，有较高的药用价值, 具有抗肿瘤、增加免疫力和益胃生津等功效[21–22]。由于对过度采挖导致野生资源大量减少，因此从分子水平研究铁皮石斛的生长发育对保护其资源具有重大意义。目前关于WOX转录因子的功能研究主要在模式植物拟南芥和水稻上，对中药材如铁皮石斛[23–24]的相关研究鲜见报道。此外，兰科植物的花在结构上高度特化，如具有形态特异的萼片、唇瓣和合蕊柱[25]。本研究根据已报道的铁皮石斛基因组数据[26]，对其WOX家族进行鉴定和生物信息学分析，并分析WOX基因在不同生长发育阶段和花的不同组织中的表达模式，为探讨WOX转录因子在调控铁皮石斛生长发育中的作用提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料铁皮石斛(Dendrobium officinale)种植于中国科学院华南植物园苗圃。取约1 cm长的花蕾，分别收集萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱，液氮速冻15 min，保存于–80℃冰箱备用。
铁皮石斛组培苗在1/2MS+0.1%活性炭+2%蔗糖+0.6%琼脂培养基(pH 5.4)上培养，培养条件为(26±1)℃、32.57 μmol/(m2·s)、12 h光照/12 h黑暗, 相对湿度约为60%。采集的类原球茎、丛生芽(无根)和小苗(约3 cm高)经液氮速冻后保存于–80℃冰箱备用。
1.2 WOX转录因子家族成员的鉴定和序列分析从NCBI (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov)基因组数据库下载铁皮石斛基因组文件，利用Pfam、Swiss_Prot、eggNOG_class、NR注释结果检索WOX转录因子。然后对检索到的WOX蛋白序列与拟南芥WOX蛋白序列进行比对，并构建进化树，删除同源性低且遗传距离较远，剩余基因即为铁皮石斛DoWOXs。
1.3 多重序列比对和进化树分析采用DNAMAN8软件对铁皮石斛WOX家族成员的氨基酸序列进行比对。采用Clastal X version 2.0软件对铁皮石斛的WOX蛋白进行比对，输出Fasta格式文件，导入MEGA，利用邻接法(Neighbor- Joining)构建系统发育树(NJ树)，进行1 000次重复bootstrap统计学检测。
1.4 WOX的生物信息学分析从铁皮石斛全基因组测序GFF文件中获得Do-WOXs的GFF注释，利用GSDS在线软件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制铁皮石斛WOX家族成员的基因结构。利用在线工具MEME (http://alternate.meme-suite.org/tools/meme)搜索铁皮石斛WOX基因家族成员的motif，用PlantCare在线软件(http://bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测DoWOXs启动子中的顺式作用元件，并用TBtools制图。
1.5 RNA的提取和反转录参照柱式植物RNAOut 2.0试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)说明书，分别提取铁皮石斛不同发育时期(类原球茎、丛生芽和小苗)和花的不同组织(萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱)的总RNA。提取的RNA经DNA酶消化后，取2 μL进行电泳检测，再采用Promega公司的GoScript™ Reverse Transcription System试剂盒，取4 µg已纯化的总RNA进行反转录，反应体系为20 μL。
1.6 表达分析采用美国BIO-RAD公司iTaq Universl SYBR Green supermix反应试剂对9个DoWOXs进行实时荧光定量PCR (qPCR)分析。使用Primer Premier 5.0软件在基因特异性区域设计引物(表 1)，以铁皮石斛Actin为内参基因(NCBI accession No.: JX294908), 于ABI 7500 Real-time PCR仪上进行qPCR，并使用其系统软件对数据进行处理, 采用2−ΔΔCT方法[27]计算相对表达量。铁皮石斛花的发育分为3个时期：小花蕾期(约0.5 cm)、中花蕾期(约1 cm)和全开期。采用qPCR对DoWOXs在花不同发育阶段和不同组织的表达模式进行分析。用百迈客云平台(http://www.biocloud.net/)在线软件绘制热图(heatmap)。
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表 1 实时荧光定量PCR所用引物 Table 1 Primers used for quantitative real-time polymerase chain reaction |
在NCBI基因组数据库下载铁皮石斛基因组文件，并利用Pfam、Swiss_Prot、eggNOG_class、NR注释结果检索WOX转录因子，共鉴定出9个铁皮石斛WOX家族基因成员，分别命名为DoWOX1、DoOX2、DoWOX3、DoWOX4、DoWOX5、DoWOX6、DoWOX7、DoWOX8和DoWOX9。
以铁皮石斛WOX家族蛋白和拟南芥WOX家族蛋白构建进化树(图 1)，结果表明, 铁皮石斛的WOX家族可分成3个进化支，分别为WUS、Ancient和Intermediate，其中WUS的成员数量最多，分别是DoWOX3、DoWOX4、DoWOX5、DoWOX6和DoWOX9；其次是Intermediate，分别是DoWOX1、DoWOX2和DoWOX7；Ancient的数量最少，仅有DoWOX8。此外，WUS支的DoWOX4和DoWOX5的分支长度差比其他DoWOXs间的分支长度差短、置信度最高，说明DoWOX4和DoWOX5亲缘关系最近、同源性最高，暗示他们具有相似的功能。
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图 1 铁皮石斛(Do)和拟南芥(At)的WOX家族成员构建的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of WOX family members in Dendrobium officinale (Do) and Arabidopsis thaliana (At) |
使用DNAMAN的默认参数对9个DoWOXs进行多重序列比对，结果表明，铁皮石斛WOX家族成员均含有保守的同源异型结构域(homeobox domain, HD)，具有“螺旋-环-螺旋-转角-螺旋”的结构特征(图 2)。此外，在螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ中存在许多高度保守的位点，暗示这些氨基酸残基可能在基因功能上发挥重要的作用。
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图 2 铁皮石斛WOX家族成员氨基酸序列的多重比对 Fig. 2 Multiple alignment of amino acid sequence in WOX family members of Dendrobium officinale |
利用MEME工具对铁皮石斛WOX家族成员的蛋白结构进行分析(图 3), 结果表明，所有DoWOXs都含有串联的Motif1和Motif2，说明其在WOX家族成员中较为保守。在Intermediate成员中存在Motif3的保守基序；WUS家族成员中除DoWOX9外，其余成员在C端都有保守的Motif4；Ancient成员DoWOX8含有的保守基序最少，说明WOX可能具有复杂的进化过程。此外，同一亚家族中的DoWOX4和DoWOX5的保守基序都是5个，且位置相近，表现了很强的一致性，说明DoWOX4和DoWOX5具有相似的蛋白质功能和结构，同时从侧面反映了系统进化树分析的可靠性。
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图 3 DoWOXs蛋白的保守基序 Fig. 3 Conservative motifs of WOX proteins |
利用在线软件GSDS构建铁皮石斛DoWOXs基因的内含子-外显子结构图(图 4)，可见，大部分DoWOXs有内含子1~3个，外显子1~3个。结合系统进化树，不同进化分支的基因结构差异明显, 即使是相同分支的基因间也存在一定差异，但同源性最高的DoWOX4和DoWOX5的基因结构极其相似。此外，同为WUS支的DoWOX3，其基因结构与DoWOX4和DoWOX5相似，皆为2个外显子，1个内含子，说明WUS支的基因结构较为保守。Ancient支中的DoWOX8有3个外显子和2个内含子。
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图 4 DoWOXs基因结构 Fig. 4 Gene structure of DoWOXs |
对DoWOXs的启动子用PlantCARE进行分析(图 5)，结果表明，9个DoWOXs共含有13个与生长发育相关的顺式作用元件，不同基因间的顺式作用元件不同。其中，顺式作用元件meristem expre- ssion共有6个，DoWOX1含有3个，说明其可能在铁皮石斛分生组织的生长上扮演重要角色。与激素相关的顺式作用元件有auxin-responsive、gibbe- rellin-responsive、MeJA-responsive、abscisic acid responsive、salicylic acid responsive等，在植物和环境胁迫的适应中扮演重要角色；与逆境胁迫相关的非生物激素的顺式作用元件有drought-inducibility、defense and stress responsive、low-temperature responsive和anaerobic induction等，间接影响生长发育。这说明WOX家族成员在铁皮石斛生长发育过程中，参与胚胎发育、种子萌发、分生组织生长、根系发育和环境胁迫的调控等活动。
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图 5 DoWOXs启动子中的顺式作用元件 Fig. 5 cis-Acting elements of DoWOXs promoter |
铁皮石斛类原球茎被认为是体胚[28]，可增殖, 亦可分化成完整的植株，而WOX成员在维持植物的干细胞状态中起着重要的作用。采用qPCR技术分析了DoWOXs在铁皮石斛不同发育阶段中的表达模式(图 6)，结果表明，除DoWOX3外，其余DoWOXs在类原球茎、丛生芽和小苗中有表达。DoWOX1、DoWOX2、DoWOX3、DoWOX4和DoWOX9在类原球茎中的表达量最高，表明WOX在铁皮石斛的类原球茎发育中扮演重要角色。DoWOX5在丛生芽中的表达量最高，DoWOX6在小苗中最高, DoWOX7和DoWOX8在3个不同发育时期表达量均较高。此外，不同发育时期优势表达的DoWOXs不同，如DoWOX3在类原球茎特异表达，可能与其具有不同的启动子顺式作用元件有关。
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图 6 DoWOXs基因在铁皮石斛不同发育时期的表达 Fig. 6 Expression of DoWOXs in Dendrobium officinale at different development stages |
开花是植物发育中非常重要的阶段，WOX参与植物花发育过程[18]。利用本实验室建立的铁皮石斛花发育数据库，获取了DoWOXs在小花蕾(S1)、中花蕾(S2)和全开花(S3)中的表达数据，利用百迈客云平台在线软件绘制热图(图 7)，可见，DoWOX4、DoWOX5的表达模式较为相似，在S1时期的表达量最高，其次为S2时期，S3时期最低，暗示这2个基因在花发育过程中功能相似。DoWOX8在3个时期的FPKM值均大于20，S2时期的表达量最高，而其他DoWOXs在3个时期的FPKM均小于5。
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图 7 DoWOXs在铁皮石斛不同开花期的表达谱。S1: 小花蕾; S2: 中花蕾; S3: 全开花; 红色: 上调; 绿色: 下调。 Fig. 7 Expression profile of DoWOXs in Dendrobium officinale at different flowering stages. S1: Small flower bud; S2: Medium flower bud; S3: Full bloom; Red: Up-regulation; Green: Down-regulation. |
兰科植物的花具有较高的观赏价值主要源于其独特的花型，有3个瓣化的萼片，2个花瓣，1个唇瓣和1个合蕊柱[29]。进一步选取S2时期的花蕾进行不同组织的表达分析，结果表明(图 8), DoWOX1和DoWOX2在花蕾的4个组织中均未表达；DoWOX3仅在唇瓣和合蕊柱中表达；其余6个DoWOXs在中花蕾的不同组织中均有表达，其中DoWOX4在唇瓣中表达较高，DoWOX5在萼片中表达最高，DoWOX6在花瓣中表达最高，DoWOX7和DoWOX9在合蕊柱中表达最高。这暗示DoWOXs家族成员在铁皮石斛花生长发育过程中具有不同的调控作用。此外, DoWOX3和DoWOX7在合蕊柱的表达量远高于其他花器官，可能与花形态发育密切相关。
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图 8 DoWOXs在铁皮石斛中花蕾不同组织中的表达模式 Fig. 8 Expression pattern of DoWOXs in different tissues of medium flower buds of Dendrobium officinale |
参与调控植物发育的基因在形态建成中起着关键的作用。WOX转录因子是参与植物发育的重要家族之一。本研究从铁皮石斛全基因组中鉴定出9个WOX转录因子(DoWOX1~DoWOX9)，生物信息学和表达分析表明，WOX转录因子在铁皮石斛的生长发育尤其是类原球茎和花发育中起重要的调控作用。DoWOX4和DoWOX5在开花时期表达量的变化规律一致，且DoWOX4和DoWOX5氨基酸序列相似度高(图 1)，暗示这2个转录因子可能在调控花发育过程中的功能相似。此外，DoWOX4、DoWOX5和AtWOX3在系统进化树上的亲缘关系最近，AtWOX3在拟南芥花发育尤其是花表型构成中起作用[18]。
9个DoWOXs编码蛋白的同源异型结构域(HD)保守性高，具有典型的“螺旋-环-螺旋-转角-螺旋”结构，这与其他物种[30–31]的研究结果一致，表明该同源异型结构域在进化上具有较高的保守性。该同源异型结构域可以特异地和DNA序列结合而发挥重要的作用[32]，如作为HOX蛋白的辅助因子影响植物、动物和真菌的发育[8]。基因结构分析表明, WUS支的DoWOXs成员基因结构较为保守。不同支系DoWOXs蛋白的保守基序在数量、位置上具有较高的相似性，这与系统进化树的结果一致。此外，Motif1和Motif2基序的保守程度更高。
基因的表达调控是一个复杂的过程，转录因子通过结合基因的顺式作用元件来调控基因的表达。DoWOXs的启动子上含有响应植物激素和逆境胁迫等相关的顺式作用元件，生长素可调控胚胎发育[33]、脱落酸影响种子休眠和萌发[34]，茉莉酸甲酯(MeJA)参与植物防御反应[35]，因此，DoWOXs可能参与植物生长发育和防御反应。
类原球茎、芽和小苗是铁皮石斛3个典型的生长发育阶段。5个DoWOXs在类原球茎中高表达, 说明DoWOXs在调控铁皮石斛类原球茎发育具有重要的作用，这与梁易等[24]的研究结果一致。类原球茎发育是铁皮石斛的特有阶段。DoWOX3在类原球茎中表达量最高，在芽和小苗中不表达，与同源性最高的AtWOX2的表达模式相似[36]。有大量研究表明，WOX在植物的胚胎发育中扮演不同的角色，如 WOX2、WOX5、WOX8和WOX9影响拟南芥的胚胎模式[12]，WOX2调控云杉(Picea asperata)的体细胞胚胎发生[37]。DoWOX5在芽中表达最高，可能与铁皮石斛芽发育有关。WOX参与调控植物芽的发育，如WUS在拟南芥芽再生发育过程是必需的[38]、WOX11通过招募相关蛋白影响水稻芽的发育[39]。除DoWOX3外，其余DoWOXs在小苗中均有表达，说明DoWOXs可能调控铁皮石斛小苗发育。花发育是植物生殖阶段的重要过程，DoWOXs在小花蕾、中花蕾和全开花时期都有表达，说明DoWOXs在铁皮石斛花发育中起着重要的调控作用。WOX调控花发育的作用在拟南芥、矮牵牛和烟草等植物中已有报道[17–20]。除DoWOX1和DoWOX2外，其余DoWOXs均在中花蕾不同组织中表达，说明在中花蕾时期DoWOX1和DoWOX2可能和其他DoWOXs存在功能冗余的情况，具体功能还需进一步研究。合蕊柱是兰科植物花的独特结构，DoWOX3和DoWOX7在合蕊柱中的表达量远远高于其他组织，推测两者调控铁皮石斛花的发育，但具体功能有待进一步研究。同一亚家族成员存在一些相似的功能，有研究表明WUS分支的其他成员存在不同程度替代WUS在芽和花干细胞维持方面的功能[16]，这为寻找WOX家族的共性提供一个突破口。
植物组织培养技术是目前解决铁皮石斛种苗较难繁殖的主要方式，干细胞的形成与分化是组织培养中的重要环节，因此，研究铁皮石斛干细胞的相关分子机理具有十分重要的意义。兰科植物的花是重要的生殖器官，而且具有较高的观赏价值，研究兰科植物花器官发育对了解其花形成机制及品种选育提供了重要的理论基础。本研究为进一步挖掘铁皮石斛WOX转录因子功能奠定了基础。
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