2021, Vol. 29
b. 广州中医药大学, 中药学院, 广州 510006;
c. 广州中医药大学, 基础医学院, 广州 510006;
d. 广州中医药大学, 基础医学院中西医结合研究中心, 广州 510006
b. School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
c. Department of Biochemistry, School of Basic Medical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
d. Research Center of Integrative Medicine, School of Basic Medical Science; Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
菊科(Compositae)鬼针草属(Bidens)植物约有230种，广泛分布于全球热带及温带地区，尤以美洲的种类最为丰富。我国有9种2变种，遍布全国各地，已有数种可供药用，为民间常用草药[1]。目前从鬼针草(B. pilosa)、柳叶鬼针草(B. cernua )、狼杷草(B. tripartita)、婆婆针(B. bipinnata)和小花鬼针草(B. parviflora)中共分离得到300多个单体化合物, 主要包括黄酮类、多烯炔类、苯丙素类、萜类成分，此外还有挥发油类、氨基酸、无机盐等[2-3]，但关于该属植物白花鬼针草的药效物质基础和药效学研究则相对较少。
白花鬼针草(Bidens pilosa var. radiata)主要分布于亚洲和美洲的热带和亚热带地区，亦产于我国华东、华中、华南、西南各省区，生于村旁、路边及荒地中[4]。在我国，白花鬼针草常用于治疗上呼吸道感染、急性黄疸型肝炎、胃肠炎等疾病[4]。研究表明，鬼针草属植物中特征性的多烯炔类成分具有结构类型多样、含量高、药理作用显著等特点, 尤其在抗炎、抗肿瘤、抗疟疾、降血糖、杀虫等方面具有良好活性[5-7]。本研究对白花鬼针草的特征性成分多烯炔与其生物活性进行研究，采用多种色谱技术分离鉴定多烯炔类成分，并对其进行体外抗MRSA活性以及肝细胞毒性评价。
1 材料和方法 1.1 仪器、试剂及耗材核磁共振谱：Bruker Avance III 400 MHz核磁共振仪，δ (ppm)，以氘代试剂残留溶剂峰为内标; 液相色谱与质谱联用仪：Waters 2695 LC偶联Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS，分析色谱柱型号: Waters Sunfire® RP C-18，3.5 μm, 4.6 mm×100 mm; 质谱：Waters 3100 SQDMS (低分辨ESI)；CO2细胞培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；垂直超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；S1010低速离心机(美国赛洛捷公司)；FM-500型倒置荧光生物显微镜(上海普丹光学仪器有限公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；MK3型酶标仪(美国Thermo Fisher公司); 超低温冰箱(日本三洋SANYO公司)。
MTT噻唑兰(美国Sigma公司)；柱层析硅胶: 200~300和300~400目硅胶均为青岛海洋化工厂生产；TLC预制薄层板：HSGF254为德国Merck公司生产；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20：Pharmacia Bio- tech AB、Uppsala、Sweden；胎牛血清(FBS) (澳大利亚Gibco公司)；青霉素-链霉素(P/S) (Thermo公司)；RPMI-1640培养基(德国Biological Industries公司); DMEM培养基(美国Gibco公司)；96孔细胞培养板(美国CORNING公司)；DMSO溶液(美国Sigma公司); HPLC分析用乙腈(Merck公司); 实验用水由美国Milli- pore公司纯水、超纯水系统提供；其他有机溶剂均为国产分析纯产品；TLC显色剂为5%香兰素乙醇液。
1.2 材料白花鬼针草(Bidens pilosa var. radiata)于2018年10月采集自广东省广州市，标本号No. 20181001, 存放于广州中医药大学中医药数理工程研究院。
1.3 细胞株肝细胞株 人肝LO2细胞；购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
细菌细胞株 大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli ATCC8739)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus CMCC 44102)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MASA JCSC 4474)；购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
1.4 多炔类化学成分的提取分离将白花鬼针草的干燥地上部分(8.0 kg)剪成2 cm小段，在室温下用10倍体积的95%乙醇浸泡3次，每次5 d。将浸泡液减压浓缩，得浸膏747.1 g, 将得到的总浸膏用水悬浮，然后用乙酸乙酯萃取, 减压浓缩萃取液，得到水部位(579.9 g)和乙酸乙酯部位(167.2 g)。将乙酸乙酯部位用硅胶柱层析(200~ 300目)处理，以石油醚-乙酸乙酯(100:1~2:1, V/V)进行梯度洗脱，同时通过TLC薄层色谱分析进行合并，最终得到12个子组分A1~A12。A1组分经硅胶柱层析(300~400目)处理，用石油醚-乙酸乙酯(100:1~2:1, V/V)洗脱，得到化合物2 (5.73 g)。A2组分先进行凝胶柱层析处理，甲醇洗脱，再经硅胶柱层析(300~400目)处理，用石油醚-乙酸乙酯(100:1~ 10:1, V/V)洗脱，得到化合物3 (30.9 mg)。A5组分先经凝胶柱层析处理，甲醇洗脱，再通过制备型高效液相色谱分离，用乙腈-水(70%~90%, V/V)洗脱，得到化合物1 (208.8 mg)。A7组分先通过凝胶柱层析处理，甲醇洗脱，再用硅胶柱层析(300~400目)处理，石油醚-乙酸乙酯(100:1~10:1, V/V)洗脱, 得到化合物4 (1.88 g)。
1.5 结构鉴定化合物1 黄色油状物。ESIMS中显示准分子离子峰m/z 257.27 [M + H]+，结合13C NMR数据确定其分子式为C15H12O2S，不饱和度为10。化合物1的13C NMR谱中给出15个碳信号(表 1)，其中包括：1个伯碳、1个仲碳(为连氧仲碳)、7个叔碳以及6个季碳(其中包括1个酯羰基碳)。此外，由13C NMR谱可推导出10个烯烃碳信号和2个炔烃碳信号(δC 82.4, 93.6)。因此化合物1为多烯炔类成分。1H NMR图谱中，显示2组特征性信号δH 7.50 (2H, m)和7.36 (3H, m)(表 1)，该信号在1H-1H COSY图谱中相关，因此该2组信号应为苯环信号，提示化合物1结构中含有苯环结构单元。可知，化合物1中共含有10个烯烃碳信号，扣除苯环烯烃碳还剩余4个，共占2个不饱和度。而由化合物分子式推知，化合物的不饱和度为10，扣除1个羰基、1个苯环、1个炔基以及4个烯烃碳，还剩1个不饱和度, 故该化合物应该含有1个环结构。在1H-1H COSY图谱中，可观察到H-3与H-4相关，且结合它们较小的耦合常数以及分子式中存在的硫原子，可推导该两个烯烃键与硫原子形成噻吩环。苯环、炔基、噻吩环和乙酰基结构片段的连接位置可由HMBC图谱推导, ① C-2"与H-4"/H-8"相关，可推导炔基通过C-3"‒C-2"与苯环相连；② C-1"与H-3相关, 可推导炔基通过C-1"‒C-2与噻吩环相连；③ C-1′与H-4相关，可推导噻吩环通过C-5‒C-1′与乙酰基相连。因此，化合物1鉴定为5-acetoxy-2-phenyl- ethinyl-thiophene[8]，这是首次提供其核磁数据并进行结构解析(图 1)。
|
表 1 化合物1的氢谱和碳谱数据 Table 1 1H (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data of compound 1 |
|
图 1 多烯炔化合物的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of polyacetylenes compounds |
化合物2 黄棕色固体，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δH 7.50 (2H, m, H-2'/H-6'), 7.37 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-4'), 7.31 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-3'/H-5'), 2.00 (3H, s, H-7)。13C NMR (100 MHz, CDCl3): δC 4.73 (C- 7), 58.99(C-3), 64.93 (C-5), 67.45 (C-4), 74.64 (C-2), 75.23 (C-6), 78.31 (C-1), 121.14 (C-1'), 128.48 (C-3'/C- 5'), 129.53 (C-4'), 132.98 (C-2'/C-6')。化合物2的1H、13C NMR数据与1-phenylhepta-1, 3, 5-triyne[9]的一致。
化合物3 淡黄色油状物，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δH 7.55 (2H, m, H-2''/H-6''), 7.36 (2H, m, H-3''/ H-5''), 7.29 (1H, m, H-4''), 7.14 (1H, d, J = 3.8 Hz, H-3), 7.07 (1H, d, J = 3.8 Hz, H-4), 2.10 (3H, s, H-3')。13C NMR (100 MHz, CDCl3): δC 4.75 (C-3'), 73.13 (C-1'), 90.82 (C-2'), 122.74 (C-3), 123.41 (C-5), 125.80 (C-2''/ C-6''), 127.76 (C-4''), 128.93 (C-3''/C-5''), 132.10 (C- 4), 133.89 (C-1''), 144.40 (C-2)。以上数据与5-phenyl- 2-(1-propynyl)-thiophene[9]的一致。
化合物4 黄色油状物，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δH 6.31 (1H, dd, J = 16.0, 5.4 Hz, H-1'), 5.79 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2'), 4.49 (1H, m, H-2), 3.96 (1H, m, H-5), 3.78 (1H, ddd, J = 9.3, 5.4, 1.4 Hz, H-1), 3.41 (1H, m, H-5), 2.20 (1H, m, H-3), 2.05 (3H, s, H- 3''), 1.99 (3H, s, H-9'), 1.70 (2H, m, H-4), 1.48 (1H, dd, J = 11.0, 5.2 Hz, H-3)。13C NMR (100 MHz, CDCl3): δC 4.68 (C-9'), 21.11 (C-3''), 24.74 (C-4), 29.26 (C-3), 58.90 (C-5'), 64.87 (C-7'), 67.38 (C-6'), 67.50 (C-5), 71.47 (C-2), 73.46 (C-3'), 75.62 (C-4'), 78.30 (C-8'), 78.74 (C-1), 110.23 (C-2'), 144.40 (C-1'), 169.93 (C- 2'')。以上数据与icthyothereol acetate[10]的一致。
1.6 生物活性筛选 1.6.1 体外抗MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)活性筛选采用梯度稀释技术[11]，测定化合物的最低抑菌浓度(MIC)。首先将指示剂溶液(100 μg/mL的刃天青水溶液)与待测菌溶液(1.25×106 CFU/mL)按3:2的比例混匀，即得混合菌液，并向第一列的所有测试孔中各加入200 μL混合菌液，向第二至第八列的所有测试孔中各加入100 μL混合菌液。然后，将含待测样品的DMSO溶液2 μL分别加入到第一列的各个板孔中，均匀混合后取出100 μL的溶液转移到第二列相应的板孔中，并依次稀释到第8列。最后，将孔板放入到恒温培养箱，37℃培养12 h。观察孔板中菌液的颜色，菌液变成红色为无抑菌活性，维持蓝色为有抑菌活性，菌液维持蓝色的最低给药浓度被认为是待测化合物的最低抑菌浓度。阳性对照为万古霉素，每个样品做2组并重复测定3次。
1.6.2 体外人肝细胞毒性评价采用MTT法[12]，测定化合物对人肝LO2细胞的毒性。收集对数生长期的人肝LO2细胞，加入含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基制成细胞悬液，以1×105 CFU/mL的浓度接种于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，设置给药孔、阴性对照孔(DMSO溶剂)、调零孔(培养基)，给药孔分别加入浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.12 μg/mL的待测药液，设置6个复孔。置于37℃、5% CO2培养箱中分别培养24 h。每孔加入20 μL新鲜配制的5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h，轻轻吸弃孔内液体，停止培养。每孔加入150 μL的DMSO，于水平摇床混匀10 min，后置于酶标仪490 nm波长处测定各孔的吸光值，计算细胞的存活率。
2 结果和讨论多烯炔类成分结构新颖独特，其生物活性的开发逐渐引起国内外研究学者的关注。有研究报道化合物2~4具有抗真菌、杀虫、抗疟等药理作用[9-10, 13-14]。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，被称为“超级细菌”，已成为全球院内感染的首要致病菌, 其对青霉素、头孢克洛等绝大部分临床常用抗生素表现出耐药性[15-16]。因此，寻找能抑制MRSA的新型抗生素迫在眉捷。本研究评价了多炔类化合物1~ 4对革兰氏阴性菌(大肠杆菌E. coli ATCC8739)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌S. aureus CMCC26003，蜡样芽孢杆菌B. cereus CMCC44102)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA JCSC4474)的抑制活性。结果表明(表 2), 化合物1~4对MRSA JCSC 4474表现出中等抑制活性, 化合物1、2、4的抑菌MIC值为50 μg/mL, 化合物3的为25 μg/mL。
|
|
表 2 化合物1~4的体外抑菌活性[MIC (μg/mL)] Table 2 In vitro antibacterial activities [MIC (μg/mL)] of compounds 1-4 against bacteria strains |
近十年来，已上市的部分药物有潜在的肝毒性，或与其他药物相互作用所致的肝毒性陆续报道，而药物性肝毒往往在临床实践中具有很高的发病率和死亡率[17-18]。评价多烯炔类化合物的肝细胞毒性, 对此类化合物的开发和利用具有科学指导作用。因此，本研究采用MTT法测定人肝LO2细胞的存活率，结果表明，化合物1~4不具有肝细胞毒性作用。
本研究分离鉴定了白花鬼针草植物中的4个多烯炔类成分：5-acetoxy-2-phenylethinyl-thiophene (1)、1-phenylhepta-1, 3, 5-triyne (2)、5-phenyl-2-(1-propynyl)- thiophene (3)和icthyothereol acetate (4)。首次为化合物1提供核磁数据并进行结构解析，化合物3和4
为首次从该属植物中分离得到。同时，本研究评价了所获化合物的抗MRSA活性和肝细胞毒性。本研究所获得的多烯炔类化合物具有一定抗MRSA作用，为白花鬼针草的民间抗感染应用提供了科学依据；此外，化合物1~4不具有肝细胞毒性作用，具有抗MRSA活性多烯炔类成分的发现，将为新型抗菌药物的开发提供物质基础与科学依据。
| [1] |
Deletis Florae Reipublicae Popularis Sinicae, Agendae Academiae Sinicae Edita. Florae Reipublicae Popularis Sinicae, Tomus 75[M]. Beijing: Science Press, 1979: 369. 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志, 第75卷[M]. 北京: 科学出版社, 1979: 369. |
| [2] |
ZENG X Y, ZHANG T, PAN W S, et al. Research progress of chemical constituents of Bidens[J]. J Chin Med Mat, 2017, 40(3): 748-753. 曾晓燕, 张婷, 潘卫松, 等. 鬼针草属药用植物化学成分研究进展[J]. 中药材, 2017, 40(3): 748-753. DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2017.03.056 |
| [3] |
Silva F L, Fischer D C H, Tavares J F, et al. Compilation of secondary metabolites from Bidens pilosa L.[J]. Molecules, 2011, 16(2): 1070-1102. DOI:10.3390/molecules16021070 |
| [4] |
Deletis Florae Reipublicae Popularis Sinicae, Agendae Academiae Sinicae Edita. Florae Reipublicae Popularis Sinicae, Tomus 75[M]. Beijing: Science Press, 1979: 378. 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志, 第75卷[M]. 北京: 科学出版社, 1979: 378. |
| [5] |
WANG R, TONG L, LIU C Y, et al. Research progress of polyace-tylenes from Bidens genus plants and their biological activity[J]. Chin Trad Herb Drugs, 2018, 49(17): 4189-4196. 王瑞, 童玲, 刘彩云, 等. 鬼针草属植物中多烯炔类成分及其活性研究进展[J]. 中草药, 2018, 49(17): 4189-4196. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2018.17.034 |
| [6] |
CHEN Y M, PENG S Y, LUO Q Z, et al. Chemical and pharma-cological progress on polyacetylenes isolated from the family Apiaceae[J]. Chem Biodiv, 2015, 12(4): 474-502. DOI:10.1002/cbdv.201300396 |
| [7] |
WAN S Q, XU H H, ZHAO S H, et al. Study on bioactivity of polyac-etylene compounds to Pieris rapae[J]. J S China Agric Univ, 2007, 28(2): 56-60. 万树青, 徐汉虹, 赵善欢, 等. 多炔类化合物对菜粉蝶的生物活性研究[J]. 华南农业大学学报, 2007, 28(2): 56-60. DOI:10.3969/j.issn.1001-411X.2007.02.014 |
| [8] |
MARCHANT Y Y, GANDERS F R, WAT C K, et al. Polyacetylenes in Hawaiian Bidens[J]. Biochem Syst Ecol, 1984, 12(2): 167-178. DOI:10.1016/0305-1978(84)90030-9 |
| [9] |
KIMURA Y, HIRAOKA K, KAWANO T, et al. Nematicidal activities of acetylene compounds from Coreopsis lanceolata L.[J]. Z Naturforsch C, 2008, 62(11/12): 843-847. DOI:10.1515/znc-2008-11-1210 |
| [10] |
RAGASA C Y, CO A L K C, RIDEOUT J A. Antifungal metabolites from Blumea balsamifera[J]. Nat Prod Res, 2005, 19(3): 231-237. DOI:10.1080/14786410410001709773 |
| [11] |
WU J W, LI B L, XIAO W J, et al. Longistylin A, a natural stilbene isolated from the leaves of Cajanus cajan, exhibits significant anti-MRSA activity[J]. Int J Antimicrob Agents, 2020, 55(1): 105821. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2019.10.002 |
| [12] |
MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65(1/2): 55-63. DOI:10.1016/0022-1759(83)90303-4 |
| [13] |
ALVAREZ L, MARQUINA S, VILLARREAL M L, et al. Bioactive polyacetylenes from Bidens pilosa[J]. Planta Med, 1996, 62(4): 355-357. DOI:10.1055/s-2006-957902 |
| [14] |
TOBINAGA S, SHARMA M K, AALBERSBERG W G L, et al. Isolation and identification of a potent antimalarial and antibacterial polyacetylene from Bidens pilosa[J]. Planta Med, 2009, 75(6): 624-628. DOI:10.1055/s-0029-1185377 |
| [15] |
XIAO Y H, WANG J, LI Y. Bacterial resistance surveillance in China: A report from Mohnarin 2004-2005[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2008, 27(8): 697-708. DOI:10.1007/s10096-008-0494-6 |
| [16] |
ARÊDE P, MILHEIRICO C, DE LENCASTRE H, et al. The anti-repressor MecR2 promotes the proteolysis of the mecA repressor and enables optimal expression of β-lactam resistance in MRSA[J]. PLoS Pathog, 2012, 8(7). DOI:10.1371/journal.ppat.1002816 |
| [17] |
BUNCHORNTAVAKUL C, REDDY K R. Drug hepatotoxicity: Newer agents[J]. Clin Liver Dis, 2017, 21(1): 115-134. DOI:10.1016/j.cld.2016.08.009 |
| [18] |
PARVEZ M K, RISHI V. Herb-drug interactions and hepatotoxicity[J]. Curr Drug Metab, 2019, 20(4): 275-282. DOI:10.2174/1389200220666190325141422 |