2021, Vol. 29
2. 温州科技职业学院农业与生物技术学院, 浙江 温州 325006
2. College of Agriculture and Biotechnology, Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, Zhejiang, China
GRAS基因是植物特有的一类转录因子，由GAI、RGA和SCR等3个基因家族成员的特征字母命名而来[1-2]。GRAS家族通常包含SAW、亮氨酸重复序列I (LFRI)、NLS、VHIID和亮氨酸重复序列II (LHRII)、PFYRE和LXX-LL等几个典型的结构域，可分为SHR、SCL、SCR、RGA、RGL (RGA- like)、GAI和PAT1等8个分支[3]。目前，GRAS转录因子已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、白菜(Brassica pekinensis)、蓖麻(Ricinus communis)、玉米(Zea mays)和番茄(Lycopersicon esculentum)等植物中克隆出来[4-9]。
GRAS家族成员数量众多，在植物逆境胁迫应答中发挥着重要作用。Torres-Galea等的研究表明干旱、盐、低温等非生物胁迫可促进拟南芥AtSCL13的表达[1]。李雪燕等报道柽柳(Tamarix hispida)的GRAS转录因子启动子含有多个逆境相关元件，推测其可参与植物的逆境胁迫响应[10]。过表达水稻中的OsGRAS23基因和甘蓝型油菜中的GRAS基因，可提高植株对干旱胁迫的耐受性[11]。
青花菜(Brassica olreacea var. italica)为十字花科(Brassicaceae)芸薹属一二年生草本植物。水分是青花菜生长发育过程中重要的调控因子，水分过多会严重影响生长，甚至造成整株死亡。因此对青花菜渍水胁迫的响应机理进行研究，对于青花菜生产具有重要的现实意义。
本试验从青花菜中克隆得到1个BoSCL3基因, 对其编码的BoSCL3蛋白进行生物信息学分析，并采用荧光定量PCR技术检测BoSCL3基因在渍水胁迫下的表达特性，为揭示青花菜BoSCL3基因响应渍水胁迫的分子机制提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料供试材料为青花菜(Brassica olreacea var. ita- lica ‘WN12-95’)。种子催芽后，播种到营养钵中, 放置于光照培养箱内进行培养。昼夜温度为25℃/ 18℃, 光照周期为16 h/8 h。待植株长至五叶期时开始渍水胁迫处理，每处理3次重复。分别在处理后0、2和6 d采集叶片，液氮冷冻后置于超低温冰箱保存。
1.2 总RNA提取及cDNA合成参照TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒(TaKaRa公司)的操作说明提取青花菜叶片的总RNA。总RNA质量检测合格后，使用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)反转录合成cDNA第一条链。
1.3 基因的克隆根据转录组unigene库中青花菜BoSCL3基因设计全长克隆引物，F：5'-TCGCTTTGATATGGTGGTT- ATGT-3'；R：5'-TCATTCACTTCTTGCATCTCCA-3'。PCR反应体系包括1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL、10 μL Taq mixture，7 μL ddH20。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃复性50 s，72℃延伸1 min，36个循环；72℃延伸10 min。PCR产物回收后进行TA克隆，选取阳性克隆测序。
1.4 生物信息学分析采用InterPro软件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)进行结构域分析；采用在线软件ProtParamtool (http://web.expasy.org/protparam/)预测氨基酸多肽链的氨基酸组成、等电量、相对分子量、分子式等[12-14]; 使用DNAMAN软件预测多肽链的亲/疏水性; 采用GOR4工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cginbin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)对编码蛋白的二级结构进行预测。蛋白序列同源性比对和进化树的构建采用Mega 6.0软件[15]。
1.5 BoSCL3基因的表达分析根据获得青花菜BoSCL3基因的cDNA序列，设计定量引物，F: 5'-CTTAACGCAACTCAGACAA-3'和R: 5'-CCATCTTCTCACCTTCCA-3'。以actin基因(引物分别为5'-GACAACTTACAACTCCATCAT-3'和5'-CTCATACGGTCAGCGATA-3')为内参基因。使用SYBR Premix Ex Taq (大连TaKaRa公司)试剂盒在ABI Prism 7500定量扩增仪上进行实时荧光定量分析。反应体系为：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL, SYBR 10 μL，ddH2O 12 μL。反应程序为94℃预变性2 min；94℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40个循环，最后72℃延伸10 min。每个反应设3次重复，采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。
2 结果和分析 2.1 BoSCL3基因的克隆及序列特征分析采用特异引物，经PCR扩增后，从青花菜叶片中克隆了BoSCL3基因(图 1)。序列分析表明该基因cDNA全长1 355 bp，推导编码446个氨基酸(图 2)。InterPro分析表明，该基因具有保守的GRAS结构域，属于GRAS基因家族。
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图 1 青花菜BoSCL3基因的PCR扩增。L: DL 2000 Marker; 1: BoSCL3。 Fig. 1 PCR amplification of BoSCL3 gene in Brassica olreacea var. italica. L: DL 2000 Marker; 1: BoSCL3. |
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图 2 BoSCL3基因的全长序列和推测的氨基酸序列。下划线为引物序列。 Fig. 2 Full-length sequence of BoSCL3 gene and deduced amino acid sequence. Primer sequence is marked with underline. |
青花菜BoSCL3蛋白的分子量为49.96 kDa，理论等电点为6.14；带负电残基总数为51，带正电残基总数为45；疏水性最大值为3.04，亲水性最大值为2.38，同时疏水性氨基酸多于亲水性氨基酸，说明该蛋白为疏水性蛋白。
通过GOR4工具对蛋白氨基酸序列的二级结构进行分析, 结果表明，青花菜BoSCL3蛋白的二级结构包括无规则卷曲(Cc)(44.62%)、延伸链(Ee) (12.33%)和α-螺旋(Hh)(43.05%)。
2.3 系统进化树利用BLAST对BoSCL3蛋白的氨基酸序列同源性进行分析，结果表明，BoSCL3基因编码的氨基酸序列与甘蓝(Brassica oleracea)、油菜(B. napus)、芜菁(B. rapa)、白菜、萝卜(Raphanus sativus)、拟南芥中的SCL3氨基酸序列的同源性分别是100%、98%、98%、98%、91%和90%, 与烟草、长叶马先蒿、可可、毛果杨的相似性也都在60%以上。
将青花菜BoSCL3蛋白的氨基酸序列与甘蓝、油菜、芜菁、白菜、萝卜、拟南芥(Arabidopsis lyrata subsp. lyrata)、榴莲(Durio zibethinus)、长蒴黄麻(Corchorus olitorius)、黄花蒿(Artemisia annua)、除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)、莴苣(Lactuca sativa)、绒毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)、蓖麻(Ricinus communis）、毛果杨(Populus trichocarpa)等14种植物的SCL3氨基酸序列进行多重比对并构建进化树(图 3)，可见，青花菜的BoSCL3与甘蓝、油菜的SCL3亲缘关系较近。同属于十字花科的甘蓝、油菜、芜菁、萝卜、白菜和拟南芥聚在同一分支上，表明同科植物的SCL3蛋白具有较高的同源性。
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图 3 基于SCL3蛋白氨基酸序列构建的系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic trees based on amino acid sequence of SCL3 protein |
利用实时荧光定量PCR技术检测青花菜BoSCL3渍水处理不同时间的表达特征。结果表明(图 4)，青花菜BoSCL3基因在渍水胁迫处理2 d时的表达受到抑制，相对表达量仅为0.11。其后随着渍水胁迫时间的延长，表达量呈现上升的趋势，处理6 d的相对表达量为1.18。
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图 4 渍水胁迫下BoSCL3基因的表达 Fig. 4 Expression of BoSCL3 gene under waterlogging stress |
本研究从青花菜中成功克隆到BoSCL3基因, 对其编码蛋白的亲/疏水性、结构域、二级结构和同源性进行了预测分析并构建了系统进化树。对渍水胁迫下青花菜BoSCL3基因的表达进行了分析，为进一步揭示青花菜BoSCL3基因响应渍水胁迫的应答机制提供了一定的理论依据。
转录因子对于增强植物对逆境的抵抗力和适应能力具有重要作用[16-17]。本试验克隆得到1个青花菜BoSCL3基因，其编码的蛋白具有GRAS家族的保守结构域，为疏水性蛋白。石瑞等[18]报道的佛手(Citrus medica var. sarcodactylis)的GRAS和陈裕坤等[19]报道的龙眼(Dimocarpus longan)胚性愈伤组织DlGRAS4与DlGRAS54的结构、性质相似。将BoSCL3蛋白的氨基酸序列与荠蓝、油菜、萝卜、白菜、拟南芥等植物中GRAS家族的SCL3的氨基酸序列进行比对，表明约有80%以上的同源性，推测SCL3在功能上存在一定的保守性。
逆境胁迫是限制作物生长的重要因子，严重时可导致植株形态发生变化。GRAS基因可在植物受到逆境胁迫时，产生应答机制来提高植物的抗逆性，直接表现为表达量的变化。本研究中，渍水胁迫处理可对BoSCL3基因的表达量产生影响，说明BoSCL3基因可能参与了青花菜的渍水胁迫响应。前人的研究表明，水稻OsGRAS1的表达量在受到盐、干旱和外源ABA的胁迫时表达上调[20]。郭华军等的研究也表明拟南芥13个GRAS基因在干旱和渗透胁迫处理下的表达均比对照显著上升[21]。本试验中青花菜BoSCL3基因的表达量随着渍水胁迫时间的延长，呈先急剧下降后快速上升的变化趋势，表明BoSCL3基因可能在青花菜渍水胁迫调控过程中具有重要作用。
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