2021, Vol. 29
2. 南京林业大学, 南京 210037;
3. 中国林业集团有限公司, 北京 100026;
4. 中林集团雷州林业局有限公司, 广东 湛江 524043
2. Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;
3. China Forestry Group Corporation, Beijing 100026, China;
4. China Forestry Group Leizhou Forestry Bureau Co. Ltd., Zhanjiang 524022, Guangdong, China
花粉是单细胞雄配子体，主要执行繁殖任务, 花粉由孢粉蛋白组成[1-2]。花粉作为植物的生殖单位，其外形、大小及萌发孔沟特征以及外壁纹饰等都反映了植物的进化特征，因而孢粉形态研究较早应用于植物分类和系统演化研究中，是植物分类学的一个重要研究方法[3-5]。
研究植物种间亲缘关系需要通过各种表型特征或基因差异进行综合考虑，而花粉形态是其中一个重要参考因素。花粉形态特征有助于了解植物品种、种源间的谱系，并确定其在不同分类群中的地位[6-7]。从花粉形态分析亲缘关系具有独特优势, 花粉形态受外界环境影响很小，具有较强的遗传保守性和稳定性[8-9]，植物代际间的花粉形态基本不变，所以花粉形态特征是辨别植物品种的主要依据之一[10-11]，可见通过分析对比花粉形态鉴定种间亲缘关系具有可行性。被子植物花粉的大小为4.5~200 μm[12]，由于形态较小，必须在显微镜下观察研究[13]。
桉树隶属于桉属(Eucalyptus)、杯果木属(Ango- phora)和伞房属(Corymbia)，大多数种类自然分布于澳大利亚，是我国南方重要的造林树种，为造纸和生产人造板的主要原料。但目前国内外对桉树花粉形态的研究较少，本研究对我国应用较广的7种桉属树种的花粉形态进行观察测量，并对其亲缘关系进行综合分析，探讨这7种桉树的亲缘关系与其花粉形态关系是否具有一致性，以期更深入地了解这7种桉树的亲缘关系并为进一步的杂交育种等提供理论支持。
1 材料和方法 1.1 材料研究对象为7种国内常见的桉属(Eucalyptus)树种(表 1)，每树种采集3个种源单株花粉，共采集21个种源的单株花粉。其中窿缘桉(E. exserta)花粉采自云南昆明海口林场桉树种质资源试验林，巨桉(E. grandis)花粉采自广东广宁县桉树种质资源试验林，其他树种花粉均采自广东遂溪县南方国家级林木种苗示范基地。花粉采集后用硅胶干燥、过筛、密封，储存在-24℃冰箱中备用。
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表 1 试验材料 Table 1 Experimental materials |
花粉用4%戊二醛固定液固定，之后用0.3 mol/L磷酸缓冲液(PBS)清洗3次，每次20 min；用1%锇酸(Os04)固定4 h，0.1 mol/L PBS清洗3次, 每次20 min；依次用30%、50%、70%和90%乙醇脱水，每次15 min，再用100%乙醇脱水3次，每次15 min；使用界点干燥仪干燥；花粉黏台，用离子溅射仪喷金，在蔡司EVO MA15扫描电镜(SEM, 德国)下观察[14-17]，SEM工作电压5.0 kV。
每个种源随机选择20颗花粉粒分别在7k倍和15k倍下观察整体和局部形态并测量。参照国际惯用做法[18]，测量花粉赤道面长、赤道面宽，萌发沟的长度、宽度和深度，花粉形态描述参照《孢粉学手册》[19]。赤道面面积为赤道面长×赤道面宽，萌发沟大小为萌发沟的长度×宽度。
1.3 数据分析使用Microsoft Excel 2019进行数据整理，采用STATISTICA 8.0和SPSS 19.0进行数据的统计分析。
2 结果和分析 2.1 花粉性状桉树花粉的赤道面接近正三角形。从表 2可见，粗皮桉花粉的赤道面长、宽都最大，赤道面面积也最大；窿缘桉的次之, 赤桉的最小, 尾叶桉的较小。多重分析表明，粗皮桉和窿缘桉的赤道面长差异不显著，但与其他树种的差异极显著。赤道面宽尾叶桉、韦塔桉、细叶桉差异没有达到极显著。粗皮桉和窿缘桉的赤道面面积和其他树种比较都达到差异极显著，说明这2种桉树花粉的赤道面积与其他树种有明显不同。
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表 2 7种桉树花粉性状 Table 2 Pollen traits of 7 Eucalyptus species |
窿缘桉花粉萌发沟的长、宽最大，粗皮桉的次之；韦塔桉花粉萌发沟宽度最小，萌发沟长度较小，其萌发沟最小；巨桉花粉的萌发沟长度最小。多重分析表明，窿缘桉和粗皮桉的萌发沟宽度差异不显著，但与其他树种差异极显著。萌发沟长方面窿缘桉自成一组，与其他树种差异极显著。各树种的萌发沟深差异达不到极显著水平。
从表 2可知，粗皮桉、窿缘桉花粉性状相近, 粗皮桉花粉的赤道面长、宽的变异系数较小，说明粗皮桉花粉大小变化不大；韦塔桉、细叶桉花粉的赤道面长的变异系数也较小；赤桉花粉的赤道面长、宽的变异系数较大，说明赤桉花粉大小不一。窿缘桉花粉的萌发沟长、宽的变异系数较小，说明萌发沟长、宽变化不大；巨桉花粉萌发沟长、宽的变异系数数据也较小；韦塔桉花粉萌发沟长的变异系数数据较小，但萌发沟宽的变异系数较大，说明其萌发沟形态差异较大。
2.2 聚类分析基于花粉的赤道面长、宽和萌发沟长、宽、深，采用Sorensen方法进行聚类分析(图 1)，若信息保留75%，7种树种的花粉可以分为2组, 其中粗皮桉、窿缘桉聚为一组，其余树种聚在一组, 说明粗皮桉、窿缘桉的花粉与其余树种有明显差异。若信息保留87.5%，7种树种可分为3组, 粗皮桉、窿缘桉聚在一组，韦塔桉、巨桉聚在一组，其余树种聚在一组，且韦塔桉和巨桉的花粉性状相似。若信息保留接近100%，尾叶桉和细叶桉仍聚在一组，说明这2树种的花粉性状差异非常小。
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图 1 基于花粉形态的7种桉树聚类分析 Fig. 1 Cluster analysis of 7 Eucalyptus species based on pollen morphology |
按照埃尔特曼[19]的孢粉NPC系统分类，7种的花粉都属于N3P4C5型(图 2)，这也是桃金娘科(Myrtaceae)植物花粉较典型的形态类型。
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图 2 7种桉树的花粉形态和外壁纹饰。标尺=2 μm Fig. 2 Pollen morphology and wall ornamentation of 7 Eucalyptus species. Bars=2 μm |
桃金娘科花粉外壁纹饰有8种类型[18]，本研究的7种树种花粉外壁纹饰可分为3类。粗皮桉与窿缘桉花粉外壁纹饰相似，比较光滑，同时花粉整体比较饱满，形态性状也比较接近，体积较大。细叶桉和赤桉的花粉外壁纹饰是桃金娘科常见的皱波状，介于粗糙和光滑之间。尾叶桉、韦塔桉和巨桉的花粉外壁纹饰比较粗糙，尾叶桉的非常粗糙。
从笔者以往桉树种间杂交的实践结果看，这7种树种的外壁纹饰类型与他们之间的杂交成功率有一定关联。细叶桉和赤桉的杂交成功率较高，尾叶桉、韦塔桉和巨桉间的杂交也较容易，粗皮桉与窿缘桉间的杂交研究报道较少，但是粗皮桉花粉外壁纹饰与其他种的不同，作为母本与细叶桉、尾叶桉、巨桉等的杂交成功率不高，这说明花粉外壁纹饰与亲缘关系有一定的关系。而且除粗皮桉、窿缘桉外，其余树种的亲缘关系都与桉树分类系统吻合，进一步说明通过花粉外壁纹饰分析桉树种间亲缘关系是可行的，但亲缘关系分析不能只考虑外壁纹饰类型。
窿缘桉的萌发沟比较宽，其次是粗皮桉，两者相近，而韦塔桉萌发沟狭窄，这与花粉外壁纹饰的分类结果相同。大部分树种的花粉萌发孔有突起, 只有赤桉的突起不明显(图 2)。
3 结论和讨论 3.1 粗皮桉和窿缘桉的亲缘关系植物分类方法有很多种，如形态学、孢粉学、解剖学、细胞学、化学和分子标记等分类法[20], 随着研究手段的发展，对某物种的分类研究也不断有新的数据补充，对植物的科学分类通常采用多种方法。
本研究的7种树种在桉树分类系统中都属于桉属双蒴盖亚属(subgen. Symphyomyrtus)，粗皮桉、尾叶桉、韦塔桉和巨桉属于横脉组(sect. Transver- saria), 而细叶桉、赤桉、窿缘桉属于窿缘组(sect. Exsertaria)[21]，韦塔桉是从尾叶桉分出来的种，传统上认为两者的亲缘关系较近；细叶桉、赤桉表型特征比较接近，也认为亲缘关系较近。
粗皮桉和窿缘桉处于不同的组，理论上可杂交，亲缘关系不远不近。本研究结果表明，他们的花粉均比较大，形态性状也相近，在聚类分析中也聚在一组，且花粉外壁纹饰也类似，均较光滑，说明两者花粉的相似性，值得一提的是，很多学者认为在花粉的比较研究中，外壁纹饰比体积大小更可靠[22-25]。生物地理学分析表明，两者的自然分布有重叠，在澳大利亚昆士兰州都有分布，且都喜热[26]。表型上看，两者树皮都有条状纵裂，但叶子形态差异明显。因此，两者的亲缘关系应该比现在公认要更亲近，两者在叶片形态上的明显差异，可能是其分在不同组的原因[27]。本研究对两者亲缘关系的补充，在桉树育种研究中有一定的指导意义，后续可以尝试两者的杂交育种。
3.2 其他5种桉树的亲缘关系细叶桉、赤桉的花粉外壁纹饰比较接近，属于桃金娘科常规类型[18]，且都属于窿缘组，比较耐干旱、贫瘠，在澳大利亚自然分布较广，叶形相似, 杂交成功率较高，这体现了他们的亲缘关系较近, 与传统分类基本吻合。但在花粉形态性状上却有差异，赤桉花粉较小，因此不能以单个性状来判定种间的亲缘关系。
尾叶桉、韦塔桉、巨桉的花粉外壁纹饰都属于粗糙的，尾叶桉和细叶桉的花粉形态性状非常相近，韦塔桉和巨桉的比较相近。韦塔桉是从尾叶桉分出来的种，他们的亲缘关系应该非常近，但他们的花粉形态有明显差异，尾叶桉成龄叶阔披针形, 韦塔桉为窄披针形；尾叶桉蒴果直径 < 10 mm，韦塔桉的可达15 mm[26]。因此，尾叶桉、韦塔桉的亲缘关系可能没有想象中那么近，理论上认为韦塔桉与尾叶桉的亲缘关系应该比巨桉和尾叶桉的关系更近，本研究结果初步表明3者的亲缘关系在一个水平。巨桉、韦塔桉和尾叶桉间杂交较容易，且巨桉花粉纹饰与尾叶桉、韦塔桉相似，所以传统分类系统上归为一组是合理的。
3.3 花粉形态和亲缘关系从本研究结果表明，花粉形态是亲缘关系的重要判断依据，武海霞等[28]的研究表明，桉树花粉形态差异可作为桉树种间鉴别的重要依据；夏骞等[29]也采用花粉形态来分析鸡血藤属和崖豆藤属的系统学意义，可见花粉形态与系统分类关系紧密。花粉形态分析结果与传统分类系统物种间亲缘关系不一定完全吻合，但不会完全偏离原有分类系统, 而是有助于完善传统分类系统。虽不能完全依照花粉形态来分析亲缘关系，但能为传统分类系统提供更多补充，从而对种间关系有更深入了解。
粗皮桉、窿缘桉花粉形态相似，花粉赤道面长、宽相近，萌发沟形态也相近，花粉外壁纹饰都较光滑，其亲缘关系可能较近，但他们在传统分类中归为不同的组，因此还有待于更深入研究。细叶桉、赤桉的花粉形态基本体现了他们在分类系统中的位置。尾叶桉、韦塔桉的花粉形态反映的亲缘关系没有之前认为的那么近。而从巨桉花粉形态看，传统分类系统将巨桉、尾叶桉、韦塔桉分在一组是合理的。本研究补充完善了这7种常见桉树的亲缘关系，对后期的杂交育种研究有一定的指导意义。
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