草莓(Fragaria×ananassa)是全球最受消费者欢迎的水果之一^[1]，现有的常规栽培种在抗性、风味等方面存在明显不足^[2]，利用野生草莓资源进行种质创新是突破传统育种瓶颈的途径之一。黄毛草莓(Fragaria nilgrrensis)俗称白泡、白猛、猛猛等，为亚洲东部和东南部地区所特有的一种野生二倍体草莓^[3]，黄毛草莓抗逆性强、果实有浓郁的蜜桃香味^[2-4]，还含有丰富的维生素、酚类等抗氧化物质，抗氧化功效也非常好^[5-8]，利用黄毛草莓的优良性状进行品种改良，可培育出具有更好商业价值的新品种。目前，在对野生草莓优良性状的利用方面, 多限于中间材料的获得^[9-14]，国内还未见利用野生草莓培育新品种(系)的报道，国外仅日本学者Noguchi等^[15-16]选育的2n=10x栽培品种‘桃熏’具有一定的栽培面积，但存在极晚熟的缺陷，在黔中地区还表现为桃香味淡，果实较软，产量低，不抗白粉病。本课题以栽培品种‘红颊’和黄毛草莓为材料，利用远缘杂交和倍性育种技术，成功将黄毛草莓的优良性状进行转移，获得了具有蜜桃香味的新株系，有望改进现有栽培种的缺陷及形成稳定可遗传的新品种，也为其它野生草莓资源利用及种质创新提供科学参考。

黄毛草莓(Fragaria nilgrrensis, 2n=2x)于2007年从贵州省毕节市七星关区收集，并种植于贵州省园艺研究所野生草莓资源圃，栽培品种‘红颊’(又名‘红颜’, ‘Benihoppe’, 2n=8x)种植于贵州省园艺研究所草莓园。

五倍体(2n=5x)植株的获得   2010年4月在贵州省园艺研究所育种棚用黄毛草莓(2n=2x)与草莓栽培品种‘红颊’(8x)进行正反交（表 1），杂交21 d后去袋，调查结实花朵数、杂交结实率和种子数, 采集种子置于4℃冰箱30 d后播种于营养土，2月后统计播种出苗数和出苗率。

表 1(Table 1)

表 1 黄毛草莓和‘红颊’的杂交结实和出苗情况 Table 1 Setting and emergence of cross between the Fragaria nilgerrensis and 'Benihoppe' 组合 Combination 花朵数 Number of flower 结实花朵数 Number of setting flower 结实率 Setting rate /% 种子数 Number of seed 出苗数 Number of seedling 出苗率 Emergence rate /% ‘红颊’×黄毛草莓‘Benihoppe’×F. nilgrrensis 96 38 39.58 217 61 28.11 黄毛草莓ב红颊’ F. nilgrrensisבBenihoppe’ 110 8 7.27 40 1 2.50

表 1 黄毛草莓和‘红颊’的杂交结实和出苗情况 Table 1 Setting and emergence of cross between the Fragaria nilgerrensis and 'Benihoppe'

十倍体(2n=10x)植株的诱导和倍性鉴定   2014年取远缘杂交五倍体后代(2n=5x)的匍匐茎茎尖，在无菌条件下诱导愈伤组织(MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L)，35 d后将愈伤组织转接至添加秋水仙素的培养基(MS+6-BA 0.1 mg/L)上培养(表 2)，将成活的愈伤组织分化成苗后移栽至育种棚，进行DNA倍性鉴定及根尖染色体数目观察。每处理接种7个愈伤块，3次重复。DNA倍性鉴定参考王爱华等^[17]的方法并稍做修改，采用德国Partec公司的CyFlow space流式细胞仪，以黄毛草莓植株做对照，通过DNA index确定植株倍性。根尖染色体数目观察采用常规压片法^[14]，于田间切取前天埋好的新生匍匐茎茎尖(长约5 mm)，常温下置于二氯苯饱和水溶液中预处理2 h，洗涤3~5次后先放入Canoy固定液中室温固定15~20 h，再置于5 mol/L浓盐酸中室温解离7 min，最后冲洗并置于载玻片上，加入1~2滴改良卡宝品红染色5~7 min制片并摄像。愈伤死亡率用褐化死亡的愈伤个数占接种愈伤来表示，五倍体、十倍体、混倍体的诱导率用经流式细胞仪鉴定的植株个数占总检测株数来表示。

表 2(Table 2)

表 2 秋水仙素对草莓十倍体诱导的影响 Table 2 Effect of different colchicine concentrations on decaploid induction in straberry 秋水仙素 Colchicine (mg/L) 时间 Days 总数 Total 五倍体数 Number of pentaploid % 十倍体数 Number of decaploid % 混倍体数 Number of mixoploid % 死亡愈伤数 Number of dead callus % 100 20 20 18 90.00 0 0 2 10.00 1 4.76 30 21 15 71.42 2 9.52 4 19.05 0 0 40 19 14 73.68 2 10.52 3 15.78 2 9.52 200 20 19 9 47.37 1 5.26 9 17.37 2 9.52 30 16 10 62.50 3 18.75 3 18.75 5 23.80 40 14 5 35.71 3 21.42 6 42.85 7 28.57 400 20 13 9 69.23 2 15.38 2 15.38 8 33.33 30 8 3 37.50 1 12.50 4 50.00 13 61.90 40 6 2 33.33 1 16.67 3 50.00 15 71.43 对照Control 21 21 21.00 0 0 0 0 0 0

表 2 秋水仙素对草莓十倍体诱导的影响 Table 2 Effect of different colchicine concentrations on decaploid induction in straberry

蜜桃香味草莓新株系的获得与性状比较  将十倍体植株经实生选种得到的4个优良株系分别于2018年8月和2019年8月下旬定植大棚，株行距20 cm×25 cm。以‘红颊’为对照，按照试验设计共栽种5个参试株系，每株系每小区10株，3次重复, 共150株，参考赵密珍等^[18]的草莓种质资源描述规范和数据标准进行植物学性状及果实性状比较，平均单果重采用一级序果实平均值，果实硬度用杭州托普仪器有限公司生产的GY-2型号水果硬度计测定; 可溶性糖、总酸、维生素C、总酚和类黄酮含量的测定按照苏州科铭生物技术有限公司试剂盒的说明书，3次重复，所有数据均使用DPS 16.05和Excel 2007软件进行统计分析。

在利用黄毛草莓(2n=2x)和栽培品种‘红颊’ (2n=8x)进行正反交，正反交的结实率和出苗率显著不同(表 1)，以‘红颊’为母本，黄毛草莓为父本，杂交结实率和出苗率较高(39.58%和28.11%)，以黄毛草莓为母本，‘红颊’为父本，杂交结实率和出苗率较低(7.27%和2.50%)。‘红颊’ (2n=8x)×黄毛草莓(2n=2x)的杂交后代大棚表现只开花不结果(图 1: A), 始花期在十月中旬，盛花期在10月下旬，经流式细胞仪及根尖染色体数目观察鉴定为五倍体(2n=5x)(图 2: D, 图 3: G)。

图 1(Fig. 1)

图 1 草莓五倍体(A)和十倍体(B)植株 Fig. 1 Pentaploid (A) and decaploid (B) strawberry

图 2(Fig. 2)

图 2 草莓二倍体(C)、五倍体(D)和十倍体(E)叶片的流式图 Fig. 2 Flow cytometry histograms of nuclei isolated from leaves of diploid (C), pentaploid (D) and decaploid (E) strawberry

图 3(Fig. 3)

图 3 草莓二倍体(F)、五倍体(G)和十倍体(H)根尖细胞分裂中期染色体(×100) Fig. 3 Chromosomes at metaphase of root tip cell of diploid (F), pentaploid (G) and decaploid (H) strawberry (×100)

将草莓五倍体(2n=5x)植株的匍匐茎茎尖诱导的愈伤组织接种在含有不同秋水仙素浓度的培养基上进行培养，植株叶片用流式细胞仪进行倍性检测，结果表明，高秋水仙素浓度、长时间诱导可得到较高加倍效果(表 2)，十倍体比率最高为21.42%，即用200 mg/L秋水仙素培养40 d，而对照(不加秋水仙素)和100 mg/L秋水仙素培养20 d均未检测到加倍植株。随着秋水仙素浓度的升高及处理天数的增加，愈伤组织死亡率也急剧增加，400 mg/L秋水仙素培养40 d的死亡率达71.43%。因此，适宜的十倍体诱导秋水仙素浓度为200 mg/L，培养30~ 40 d。取经流式细胞仪筛选出的五倍体、十倍体和黄毛草莓植株根尖进行染色体压片分析，结果表明，黄毛草莓的染色体数目2n=2x=14条(图 3: F), 草莓五倍体的染色体数目为2n=5x=35条(图 3: G), 草莓十倍体的染色体数目为2n=10x=70条(图 3: H), 故草莓五倍体(2n=5x)经秋水仙素诱导后的植株应为十倍体植株(2n=10x)，命名为5⁺。

十倍体植株5⁺ (2n=10x)结合了‘红颊’和黄毛草莓的特性(图 1: B)，植株形态似‘红颊’，植株矮壮, 叶片大而厚实，叶色深绿，叶柄、花序梗粗壮，花朵较大，田间表现与2n=10x草莓相符，始花期在10月中旬，盛花期在11月上旬，匍匐茎较五倍体(2n=5x)少发，果实始熟期在12月上旬，果实粉红或红色，果肉软，汁多，口感甜, 具有黄毛草莓浓郁的蜜桃香味，但植株易感白粉病，畸形果多。经过连续4代实生选种，选育出4个结果早、果形正、蜜桃香味浓郁、感病轻的优良株系(图 4: I, J, K, L)。

图 4(Fig. 4)

图 4 4个具有蜜桃香味的草莓新株系和‘红颊’。I: 5+-01; J: 5+-02; K: 5+-03; L: 5+-04; M: ‘红颊’ Fig. 4 Four new strawberry strains with honey peach aroma and 'Benihoppe'. I: 5+-01; J: 5+-02; K: 5+-03; L: 5+-04; M: 'Benihoppe'

选育的4个蜜桃香味草莓新株系的植株高度和长势均稍矮于‘红颊’(表 3)，植株高度为15.50~ 19.33 cm，其中5⁺-01和5⁺-03号株系较粗壮，长势较壮(图 4: I, K)，5⁺-02和5⁺-04号植株稍纤细，长势一般(图 4: J, L)；‘红颊’植株姿态直立(图 4: M), 4个蜜桃香味草莓新株系姿态中间，‘红颊’和4个株系花序连续抽生性好，单花序花数8~18枚，在贵州省黔中地区，始花期均在10月中旬，始熟期在11月中旬到12月上旬，其中5⁺-02和5⁺-04号株系果实成熟期较长，始熟期相比‘红颊’晚半个月左右。

表 3(Table 3)

表 3 ‘红颊’和4个蜜桃香味草莓新株系的植物学性状比较 Table 3 Comparison of botanical characteristics between 'Benihoppe' and 4 new strawberry strains with honey peach aroma 株系 Strain 生长势 Growth vigor 株高 Height (cm) 姿态 Posture 花数 Number of flower 始花期 First flowering date 果实始熟期 Fruit ripening date 株产(g) Yield per plant 5+-01 壮Strong 18.57±0.40BC 中间Middle 9~12 10月中旬Mid. Oct. 11月下旬Late Nov. 210.84±3.33B 5+-02 中Middle 17.10±0.66CD 中间Middle 9~12 10月中旬Mid. Oct. 12月上旬Early Dec. 185.30±10.14C 5+-03 壮Strong 19.33±0.76B 中间Middle 13~18 10月中旬Mid. Oct. 11月中旬Mid. Nov. 193.67±6.35BC 5+-04 中Middle 15.50±0.50D 中间Middle 8~18 10月中旬Mid. Oct. 12月上旬Early Dec. 200.67±4.04BC ‘红颊’ ‘Benihoppe’ 壮Strong 24.02±1.40A 直立Erect 8~15 10月中旬Mid. Oct. 11月中旬Mid. Nov. 257.00±8.89A 同列数据后不同字母表示经邓肯氏多重极差检验差异显著(P < 0.01)。下表同。 Data followed different letters within column indicate significant difference at 0.01 level by Duncan’s multiple range test. The same is following Tables.

表 3 ‘红颊’和4个蜜桃香味草莓新株系的植物学性状比较 Table 3 Comparison of botanical characteristics between 'Benihoppe' and 4 new strawberry strains with honey peach aroma

‘红颊’果形为圆锥形(图 4: M)，选育的4个株系(表 4)果形为楔形或卵形，果形一致，平均单果重及果实硬度均极显著低于‘红颊’，平均单果重在19.02~24.08 g之间，果实硬度在1.03~1.57 kg/cm²之间，髓心空洞无、小或中，其中，5⁺-01和5⁺-03号株系果面光泽强，果面颜色深红，果肉颜色分别为红和橙红(图 4: I, K)，5⁺-02和5⁺-04号株系果面光泽中，果面颜色红，果肉颜色白(图 4: J, L)。

表 4(Table 4)

表 4 ‘红颊’和4个草莓优良株系果实外观性状比较 Table 4 Comparison of fruit appearance characters between 'Benihoppe' and 4 new strawberry strains with honey peach aroma 株系 Strain 形状 Shape 质量 Weight (g) 光泽 Glossiness 果面颜色 Face color 果肉颜色 Flesh color 硬度 Firmness (kg/cm2) 髓心空洞 Fruit cavity size 5+-01 楔形Wedge 24.08±2.20B 强Glossy 深红Dark red 红Red 1.57±0.35B 无None 5+-02 卵形Oval 19.02±1.13C 中Middle 红Red 白White 1.03±0.18B 小Small 5+-03 卵形Oval 20.89±1.02BC 强Glossy 深红Dark red 橙红Orange-red 1.35±0.21B 小Small 5+-04 卵形Oval 23.52±2.41B 中Middle 红Red 白White 1.14±0.13B 中Middle ‘红颊’ ‘Benihoppe’ 圆锥形Conic 30.73±2.41A 强Glossy 深红Dark red 橙红Orange-red 2.34±0.21A 中Middle

表 4 ‘红颊’和4个草莓优良株系果实外观性状比较 Table 4 Comparison of fruit appearance characters between 'Benihoppe' and 4 new strawberry strains with honey peach aroma

选育的4个株系(表 5)均具有黄毛草莓的蜜桃香气，风味佳，其中5⁺-01和5⁺-03株系果实果肉质地绵，5⁺-02和5⁺-04株系果实果肉质地松，‘红颊’和4个株系的可溶性糖、可滴定酸和维生素C含量差异均不显著，4个株系的类黄酮和总酚含量均极显著高于‘红颊’，类黄酮含量为5.23~8.76 mg/g，总酚含量为8.93~13.93 mg/g，其中5⁺-01株系的维生素C含量、类黄酮和总酚含量最低，5⁺-04株系的维生素C含量、类黄酮和总酚含量最高。

表 5(Table 5)

表 5 ‘红颊’和4个草莓优良株系果实品质性状比较 Table 5 Comparison of fruit quality characters between 'Benihoppe' and 4 new strawberry strains with honey peach aroma 株系 Strain 蜜桃香气 Honey peach aroma 果肉质地 Fruit texture 风味 Flavor 可溶性糖 Soluble sugar (mg/g FW) 可滴定酸 Soluble acidity /% 维生素C Vitamin C (μg/g FW) 类黄酮 Flavonoid (mg/g DW) 总酚 Total phenol (mg/g DW) 5+-01 淡Weak 绵Mealy 酸甜适中 Sweet-sour 57.36±2.83A 0.63±0.11A 663.59±85.11A 5.23±0.18A 8.93±0.32A 5+-02 浓Dense 松Soft 酸甜适中 Sweet-sour 53.62±5.75A 0.51±0.03A 703.77±131.85A 8.56±2.69A 12.25±3.12A 5+-03 淡Weak 绵Mealy 酸甜适中 Sweet-sour 51.72±13.67A 0.52±0.05A 557.16±39.21A 8.66±1.21A 11.76±1.41A 5+-04 浓Dense 松Soft 酸甜适中 Sweet-sour 55.31±8.59A 0.59±0.07A 744.39±145.32A 8.76±0.87A 13.93±0.89A ‘红颊’ ‘Benihoppe’ 无No 脆Crisp 甜酸 Sour with some sweet 62.86±7.57A 0.64±0.05A 512.67±29.40A 0.71±0.15B 1.87±0.08B

表 5 ‘红颊’和4个草莓优良株系果实品质性状比较 Table 5 Comparison of fruit quality characters between 'Benihoppe' and 4 new strawberry strains with honey peach aroma

草莓被称为“水果皇后”，由于含有丰富的营养物质(维生素、糖、矿物质、膳食纤维)和生物活性物质(多酚)，可有效预防心血管、肥胖、癌症和衰老等疾病，是全球最受消费者欢迎的水果之一^[19-21]。现有草莓栽培品种多为八倍体凤梨草莓(2n=8x)的后代，遗传背景狭窄，近几十年来，草莓育种家以提高农艺性能为目标，选育出了各种果实大，色泽艳丽，产量高的草莓新品种^[22]，但是这些草莓栽培种香型单一、香气淡，而野生草莓虽果实小、产量低，但蕴藏的香型丰富、香气浓，因此被育种家认为是新型香味分子的重要供体^[19]。

果香是由多基因位点控制的复杂性状^[23]，目前草莓香气的研究主要集中在果实香气成分的鉴定及比较方面，香气物质积累的生物合成途径及其内在的遗传规律和调控机制并不十分清楚^[22]。Negri等^[19]对2个野生草莓麝香草莓(F. moschata)和森林草莓(F. vesca)的香气成分进行了比较分析；Urrutia等^[22]基于GC-MS技术探讨了森林草莓/布哈拉草莓(F. bucharica)近等基因系(near isogenic line, NIL)果实品质的遗传变异特征，并认为NIL是野生草莓果实香气物质积累遗传剖析的良好工具，也是挖掘可以增强栽培草莓果实香气的基因和等位基因的来源。本研究利用黄毛草莓进行品种改良，经实生选种，选育出的4个草莓新株系均遗传了黄毛草莓的蜜桃香气，但各株系蜜桃香气浓郁不同，其中5⁺-02和5⁺-04株系蜜桃香气浓郁，5⁺-01和5⁺-03株系的蜜桃香气较淡，说明存在微效多基因效应, 蜜桃香气具有数量性状遗传的特点。在后续的研究中，如以‘红颊’为轮回亲本，经过5~7代的回交选育，则有望选育出以蜜桃香气为目的性状的近等基因系，以作为黄毛草莓蜜桃香气关键基因的挖掘及调控基因位点解析的珍贵理想材料。

与草莓商业品种相比，野生草莓还具有酚类等抗氧化物质含量高的优点^[24]，尽管F. vesca草莓的基因组和果实大小都比凤梨草莓小很多，但它是多种多酚类物质的丰富来源^[25]，Urrutia等^[1]基于LC- MS技术分析F. vesca草莓近等基因系果实的代谢组，定性出22种酚类物质，映射出控制酚类化合物累积的76个QTL；Skender等^[26]对草莓果实中维生素C和总酚含量的分析结果表明，野生草莓中抗氧化成分的含量显著高于商业品种。本研究选育出的4个草莓优良株系酚类等抗氧化物质含量均显著高于栽培品种‘红颊’，不足之处是果肉质地软，平均单果重和株产稍低(接近于栽培品种)，这可能与亲本性状在F₁代可表现出近高亲本遗传和近低亲本遗传有关^[27]。据报道利用黄毛草莓育成的栽培品种‘桃熏’，在日本促成栽培条件下，其果实始熟期在1月末^[16]，本研究选育的4个蜜桃香味的草莓优良株系始熟期比桃熏早，比栽培品种‘红颜’稍晚。就植株形态、果色及风味等总体而言，5⁺-01和5⁺-03株系偏向于其母本‘红颊’，5⁺-02和5⁺-04株系偏向于其父本黄毛草莓。因此，有必要经过进一步回交选育，以期在果实硬度及产量等方面有所提升，进而育成具有广泛应用前景的草莓新品种。

种间或属间远缘杂交时经常会出现正反交结果不同的现象^[28]。本研究中，‘红颊’(2n=8x)×黄毛草莓(2n=2x)结实率约为黄毛草莓(2n=2x)ב红颊’ (2n=8x)结实率的5倍，说明正反交组合亲和性不同，即存在“种间杂交单向不亲和”(unilateral cross- incompatibility)^[14]，同时也启示在不同倍性的杂交育种中，为获得较高的结实率，需高倍性草莓作母本低倍性草莓作父本进行杂交，这与雷家军^[29]的研究报道一致。黄毛草莓与栽培种亲缘关系较远，其远缘杂交后代多为五倍体种间杂种，奇数倍的草莓种间杂种不能正常结实，因此，野生种的优良性状并未真正被利用。针对此问题，我们采用染色体加倍技术来克服远缘杂交障碍。本研究采用秋水仙素对草莓五倍体种间杂种的愈伤组织进行加倍时，加倍率低而死亡率高，因此加倍技术仍需完善。柳觐等^[30]认为应用流式细胞术能快速、准确地测定巴西橡胶树的染色体倍性，但流式细胞仪的测定是相对倍性，可能会出现较大的误差，本研究在流式细胞仪鉴定五倍体(2n=5x)及十倍体(2n=10x)植株的基础上，进一步用根尖染色体数目观察进行鉴定。植物的有性生殖受内因和外因的共同影响, 植物生活史周期的任何一个环节都对生殖成功与否至关重要^[31]，本研究中5⁺实生苗(2n=10x)畸形果较多，可能是花器畸形、孢子发育异常导致，也可能是奇数染色体不能配对所致，多数报道指出, 多倍体形成初期并不稳定^[32]，除了生长缓慢、严重不育外，还存在回复原来倍性的可能，所以有必要对其进行扩繁稳定、育苗移栽，形态及倍性筛选也应延续几个世代^[17]。