2020, Vol. 28
植物甾醇是以环戊烷多氢菲组成的4个环为主要骨架的3-羟基碳氢化合物[1]，不仅具有抗氧化和延缓衰老的功能[2-3]，还可通过抑制肿瘤细胞生长和转移，改变信号传导，诱导细胞凋亡，刺激产生肿瘤免疫应答等作用机制，对多种肿瘤的发生和发展起到预防和治疗作用[4-7]，是一类对人体非常有益的植物活性成分。
铁皮石斛(Dendrobium officinale)是名贵的传统中药材，具有益胃生津、滋阴清热、抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤等效果[8-9]。甾醇类物质是铁皮石斛的有效成分之一，已经从铁皮石斛干燥茎中检测到豆甾醇、22, 23-二氢豆甾醇、β-谷甾醇、γ-谷甾醇和油菜甾醇等植物甾醇，不同产地的铁皮石斛甾醇含量存在差异[10-11]。
植物甾醇的上游生物合成途径与三萜类化合物一致，2个分子的法尼基焦磷酸在鲨烯合酶(squa- lene synthase, SQS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase, SE)的催化下生成2, 3-氧化鲨烯，环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)催化2, 3-氧化鲨烯生成环阿屯醇，代谢流往甾醇方向[12-13]。根据侧链C-24位上烷基的有无植物甾醇可分为无烷基甾醇、甲基甾醇和乙基甾醇3类。甾醇C-24甲基转移酶(sterol C-24-methyltransferase, SMT)修饰甾醇侧链C-24位, 根据其功能分为2个家族SMT1和SMT2。SMT1把1个甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到环阿屯醇的C- 24位上，形成C-24甲烯基环阿屯醇，进而形成C-24甲基甾醇，SMT2催化24-亚甲基胆甾烯醇形成24-亚乙基胆甾烯醇，产生新分支24-乙基甾醇[14-16]。SMT2是乙基甾醇合成限速酶，目前，已经从雷公藤(Tripterygium wilfordii)[17]、大豆(Glycine max)[18]、陆地棉(Gossypium hirsuturm)[19]等植物中克隆了SMT2基因，但有关铁皮石斛SMT2基因的研究还未见报道。
本课题组通过转录组测序，对铁皮石斛植物甾醇的生物合成途径和相关基因进行分析[20]，从转录组数据中获得1条带5ʹ末端的铁皮石斛甾醇C- 24甲基转移酶基因(DoSMT2)片段。本研究通过3ʹ RACE技术克隆基因全长cDNA序列，对其编码的蛋白进行生物信息学、系统进化和原核表达分析，运用荧光定量PCR分析该基因在不同组织的表达模式，为进一步研究铁皮石斛DoSMT2基因功能，甲基化机制及甾醇化合物代谢途径改良奠定基础。
1 材料和方法 1.1 材料铁皮石斛(Dendrobium officinale)采自冠豸山崖壁，种植于福建省农业科学院亚热带农业研究所资源圃。于2018年8、10、12月取当年生茎和叶片用液氮速冻后，置于-70℃冰箱中保存，用于DoSMT2基因的克隆和组织表达特性分析。试验3次重复。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、BL21 (DE3)和原核表达载体pET-29a由本实验室保存。克隆载体pMD19-T、T4 DNA连接酶、RNAiso Plus、PrimeScriptTM Reverse Transcriptase和TaKaRa TB GreenTM Premix Ex TaqTM II (TliRNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。DNA胶回收试剂盒、Dia Spin柱式质粒DNA小量抽提试剂盒和SanTaq PCR Mix购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2 总RNA提取和cDNA第1链合成利用RNAiso Plus提取铁皮石斛的总RNA，用超微量紫外可见光分光光度计(ND-1000)分析RNA的质量和浓度，然后按照PrimeScriptTM Reverse Transcriptase说明书，用随机引物进行cDNA第l链的合成。取10 μL茎和叶的cDNA混合，用于DoSMT2基因全长cDNA和ORF的克隆，余下cDNA用于DoSMT2基因表达分析。
1.3 DoSMT2基因的克隆根据转录组测序获得的DoSMT2基因片段序列信息设计3ʹRACE引物3SMT1和3SMT2及接头引物dT-adaptor和adaptor (表 1)。用引物3SMT1和dT-adaptor进行第一轮PCR，引物3SMT2和adaptor进行第二轮PCR。第一轮PCR以混合的cDNA为模板，第二轮PCR以第一轮PCR产物稀释10倍为模板。反应体系总体积25 μL：包括Sterilized ddH2O 8.5 μL，2×SanTaq PCR Mix 12.5 μL，引物各1 μL, 模板2 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min, 然后94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min, 30个循环，最后72℃延伸10 min。第二轮PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段, 把目的片段与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，复苏后把菌液涂在含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落，接种于含100 mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养，利用引物3SMT2和adaptor进行菌落PCR，产物经电泳检测，阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。用软件DNAMAN V 6.0对测序结果进行拼接和比对。
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表 1 PCR引物 Table 1 PCR primers |
根据拼接获得的全长cDNA序列信息设计引物SMT-F (带EcoR I酶切位点)和SMT-R (带Xho I酶切位点)，以2 μL混合的cDNA为模板，用引物SMT-F和SMT-R进行PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，58℃退火30 s, 2℃延伸2 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经胶回收，与pMD19-T载体连接、转化、菌落PCR验证后，阳性克隆送去测序。用软件DNAMAN V 6.0对测序结果进行比对分析。按DiaSpin柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明提取测序结果经比对正确的阳性克隆的质粒pMD19-T-DoSMT2，-20℃保存。
1.5 DoSMT2的生物信息学分析用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在线分析DoSMT2蛋白质的理化性质。利用在线工具SSPro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)和SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)预测DoSMT2蛋白的二级和三级结构。采用NCBI的BLAST P搜索DoSMT2的同源蛋白序列和保守结构域，用MEGA 6.0 (neighbor joining tree, boot- strap 1 000)构建系统发育进化树[21]。
1.6 表达分析根据DoSMT2基因全长cDNA序列信息设计荧光定量PCR引物SMT2-F和SMT2-R。选择铁皮石斛Actin基因为内参基因，引物为DoACT-F和DoACT-R, 把8、10、12月份采集的铁皮石斛茎和叶总RNA逆转录合成的cDNA，浓度定量为200 ng/μL。荧光定量PCR仪为Roche LightCycler 96，操作按照TaKaRa TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ (TliRNaseH Plus)说明书进行。反应体系总体积为20 μL：包括TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli-RNaseH Plus) 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL, ddH2O补足。反应程序为95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s, 45个循环；每处理设置3次生物学重复。利用2-∆∆CT法[22]计算相对表达量，方差分析采用DPS数据处理软件，多重比较采用新复极差法(Duncan’s法), 制图使用Excel软件。
1.7 原核表达载体的构建及诱导表达质粒pMD19-T-DoSMT2和载体pET-29a(+)经EcoR H I和Xho I双酶切，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收DoSMT2基因目的片段和pET-29a(+)载体片段。用T4 DNA连接酶连接DoSMT2基因目的片段和pET-29a(+)载体片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆过夜培养, 菌落PCR验证后送去测序。提取阳性克隆的质粒, 获得重组原核表达载体pET-29a-DoSMT2。
用冻融法将pET-29a-DoSMT2载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，在含有100 mg/L卡那霉素的LB平板上倒置培养过夜。挑取单克隆过夜培养，菌落PCR验证后吸取100 μL到3 mL含100 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下200 r/min振荡培养，蛋白诱导表达和SDS-PAGE电泳参照林江波等[23]的方法。
2 结果和分析 2.1 DoSMT2基因的3ʹRACE以随机引物反转录的混合cDNA为模板，利用引物组合3SMT1、dT-adaptor和3SMT2、adaptor进行两轮PCR扩增，PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，在880 bp左右处有1条亮带(图 1: A)，利用DNAMAN V 6.0对测序结果和已经获得的DoSMT2基因片段进行序列拼接及ORF预测分析。结果表明，获得了全长为1 446 bp的DoSMT2基因cDNA序列，ORF长度为1 089 bp，编码362个氨基酸, 5ʹ末端非翻译区132 bp，3ʹ末端非翻译区225 bp (图 2)。
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图 1 PCR产物电泳图。A: 3ʹRACE; B:开放阅读框; M: DNA marker Fig. 1 Electrophoresis of PCR products. A: 3ʹRACE; B: ORF; M: DNA marker |
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图 2 铁皮石斛DoSMT2基因cDNA序列和推导的氨基酸序列。阴影部分为S-腺苷蛋氨酸结合位点; 黑色方框部分为底物结合位点 Fig. 2 cDNA sequence of DoSMT2 gene and deduced amino acid sequence from Dendrobium officinale. Shadows are S-adenosylmethionine binding sites; Black boxes are substrate binding sites |
以随机引物反转录的混合cDNA为模板，利用引物SMT-F和SMT-R进行PCR，扩增DoSMT2基因ORF，从图 1: B可见，在1 089 bp左右有1条亮带，大小与预测的DoSMT2基因ORF一致。PCR产物经过克隆及验证后送去测序，结果表明获得了带EcoR I和Xho I酶切位点的DoSMT2基因ORF。提取阳性克隆的质粒pMD19-T-DoSMT2, 供后续实验。
2.3 DoSMT2的生物信息学分析Protparam在线预测和分析结果表明，DoSMT2蛋白的分子量为40.345 kD，理论等电点为8.13, 负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为42，正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为44。不稳定系数是31.28, 脂肪系数是84.28，总平均疏水性是-0.143，属于一种稳定的亲水性蛋白。
采用SSPro在线预测DoSMT2蛋白的二级结构，结果表明(图 3)，有136个氨基酸残基形成无规则卷曲，占37.57%；176个氨基酸残基形成α螺旋，占48.62%；50个氨基酸残基形成β折叠，占13.81%。SWISS-MODEL在线预测DoSMT2蛋白3D结构, 结果见图 4，以5gm1.1.A为同源建模模板，序列一致性为28.42%，建模范围在63~248位氨基酸残基。
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图 3 铁皮石斛DoSMT2蛋白的二级结构预测。大写字母:氨基酸序列; 小写字母:二级结构; c:无规则卷曲; h: α螺旋; e: β折叠 Fig. 3 Predicted secondary structure of DoSMT2 from Dendrobium officinale. Capital letters: Amino acid sequence; Small letters: Secondary structure; c: Random coil; h: α-Helix; e: β-Sheet |
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图 4 预测的DoSMT2三维结构 Fig. 4 3D model prediction of DoSMT2 |
使用BLAST P检索DoSMT2氨基酸序列的同源性和保守结构域，结果表明，DoSMT2氨基酸序列与深圳拟兰(Apostasia shenzhenica, PKA61629.1)、油棕(Elaeis guineensis, XP_010918151.1)、海枣(Phoenix dactylifera, XP_008785060.1)等植物的SMT2氨基酸序列相似度分别为85%、84%和85%，属于AdoMet-MTases超级家族，含有4个S-腺苷蛋氨酸结合位点：VGCGVGG、TI、GNF和I等(图 1)，在第129~224位有1个甲基转移酶保守结构域，E值为1.64×10-25，在第292~356位点有1个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域，E值为1.10×10-26。此外, DoSMT2还含有3个底物结合位点(图 1)：YEWGW- GQSFHF、YSIEATCH和KPGGLYVSYEW[24]。将DoSMT2蛋白的氨基酸序列与其他物种的SMT1和SMT2氨基酸序列进行系统进化分析，结果表明(图 5)，SMT蛋白可分为SMT1和SMT2两大类，铁皮石斛DoSMT2与其他物种的SMT2归为同一类，与深圳拟兰(PKA61629.1)的亲缘关系最近，确定其属于SMT2家族。
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图 5 不同物种间SMT1和SMT2蛋白的系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of SMT1 and SMT2 from different species |
以铁皮石斛Actin基因为内参基因，利用qRT- PCR技术检测DoSMT2基因在8、10和12月份茎和叶中的表达情况。结果表明(图 6)，茎和叶都能检测到DoSMT2基因的表达，DoSMT2基因在茎和叶中的表达量以10月份最高，10月份叶片DoSMT2基因的表达量与8、12月份的差异显著，8和12月份之间差异不显著，茎DoSMT2基因的表达量在8、10和12月间均差异显著；相同月份, 叶片DoSMT2基因的表达量都显著高于茎。
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图 6 DoSMT2基因在茎和叶中的相对表达量。柱上不同字母表示差异显著(P < 0.05) Fig. 6 Relative expression of DoSMT2 in stems and leaves. Different letters upon column indicate significant difference at 0.05 level |
与BL21未诱导、BL21诱导和携带质粒pET-29a- DoSMT2的BL21未诱导表达相比较，携带重组质粒pET-29a-DoSMT2的大肠杆菌BL21经诱导表达后出现了1条约40.345 kD的蛋白条带，表明DoSMT2基因能在大肠杆菌中有效表达(图 7)。
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图 7 DoSMT2基因在大肠肝菌中表达的SDS-PAGE。M: Marker; 1: BL21未诱导; 2: BL21诱导; 3:携带pET-29a-DoSMT2 BL21未诱导; 4:携带pET-29a-DoSMT2 BL21诱导 Fig. 7 SDS-PAGE of DoSMT2 expressed in Escherichia coli. M: Marker; 1: Non-induction (BL21); 2: Induction (BL21); 3: Non-induction (BL21 with pET-29a-DoSMT2); 4: Induction (BL21 with pET-29a-DoSMT2) |
本研究从铁皮石斛中克隆到DoSMT2基因, ORF长度1 089 bp，编码362个氨基酸，属于AdoMetMTases超级家族，含有4个S-腺苷蛋氨酸结合位点、1个甲基转移酶保守结构域、1个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域，与深圳拟兰、油棕和海枣的SMT2氨基酸相似度高，分别为85%、84%和85%, 系统进化分析将其归为SMT2家族，与深圳拟兰的亲缘关系最近，推断其具有甲基化24-亚甲基胆甾烯醇形成24-亚乙基胆甾烯醇的酶活性。BOUVIERNAVE等[25]的研究表明，烟草NtSMT2-1除了甲基化24-亚甲基胆甾烯醇活性外，还有SMT1甲基化环阿屯醇的功能，但甲基化24-亚甲基胆甾烯醇活性是甲基化环阿屯醇活性的33倍。本研究把DoSMT2基因与原核表达载体pET-29a连接，并转化大肠杆菌BL21，IPTG成功诱导BL21表达出目的蛋白, 为进一步研究DoSMT2基因的催化功能和甲基化机制奠定基础。
植物甾醇是细胞膜的重要成分，帮助维持膜的完整性和渗透性[26]。植物甾醇还可以作为植物体内的信号分子，参与调节光合作用、生殖和免疫等多种生理活动[27]。24-亚甲基甾醇是油菜素甾醇生物合成的前体物质[28]，含量的变化影响油菜素甾醇生物合成。油菜素甾醇合成缺陷会引起植物矮化[29], SITBON等[30]研究发现烟草AtSMT2转化株24-甲基甾醇含量减少，谷甾醇含量增加，但总甾醇含量没有明显的变化，开花期植株矮化，推测与油菜素甾醇合成的改变有关。铁皮石斛枝条一般10月份开始进入封顶期，停止营养生长。DoSMT2在10月份的上调表达，是否降低了24-甲基甾醇含量，引起油菜素甾醇水平下调；铁皮石斛封顶与油菜素甾醇含量下降之间是否存在关联，还有待于进一步对铁皮石斛油菜素甾醇代谢的研究来验证。
铁皮石斛叶片约占总生物量的38%，功效成分的研究主要集中在多糖和总黄酮等[31-32]，植物甾醇方面的研究鲜有报道。本研究结果表明叶片的DoSMT2表达量显著高于茎，说明叶片植物甾醇代谢比茎活跃，今后应加强铁皮石斛叶片植物甾醇的研究与开发利用。
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