植物不同于动物，只能固着生长，常会暴露于各种各样的胁迫环境中，如高温等。面对高温胁迫, 植物进化出抵抗高温胁迫的复杂应答机制^[1]，其中植物获得耐热性是一种应对高温胁迫的重要机制, 即植物经历亚致死温度下的热适应，耐热性提高, 可以承受更严重的热胁迫^[1-2]。获得耐热性使植物能够成功地应对更高温度胁迫^[3]。

植物获得耐热性与热激蛋白(heat shock protein, HSPs)和热激转录因子(heat stress transcription factor, HSFs)的表达调控有关。HSPs根据分子量大小可分为5类：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子热激蛋白(sHSPs)^[4]。其中HSP101具有ATPase活性，属于HSP100家族的AAA+伴侣蛋白^[5]。而HSP101基因的突变株hot1是利用正向遗传学方法发现的第一个热敏感突变体^[3]。HSP70是细胞中最庞大的分子伴侣家族，在发生热胁迫时，HSP70具有防止蛋白变性并帮助已经变性的蛋白恢复活性的功能^[6-7]，并且参与热胁迫过程的反馈调节^[8]。HSP70功能的有效性需要许多辅助分子伴侣协助, 其中HOP (HSP organizing protein)和Fes1就是典型的HSP70辅助分子伴侣，HOP作为真核生物中高度保守的单体蛋白，起到链接HSP70和HSP90的作用^[9]，并且是HSP90-受体蛋白复合物组装时所必需的辅助因子^[10]，拟南芥(Arabidopsis thaliana) hop1-2-3三突变体呈现热敏感表型^[11]。Fes1A作为HSP70的另一辅助分子伴侣，是HSP70的核苷酸交换因子，敲除FES1A后的突变体获得耐热性明显下降^[12]。HSFs作为热激转录抑制因子，调控热诱导基因的表达^[13]。其中HSFA7A与热适应有关。此外，与自由基清除有关的apx2 (ascorbate peroxidase 2)突变体也具有明显的热敏感表型^[1]。

虽然目前已经报道了许多拟南芥热敏感突变体，由于试验条件不一致，还缺少热敏感突变体的横向比较数据，不清楚各耐热相关基因对植物获得耐热性的具体贡献如何。因此，本研究对拟南芥6个热敏感突变体hsp70-15、apx2、hop1-2-3、hsfa7a、fes1a和hot1的获得耐热性进行系统的比较分析, 探讨这几种基因对植物耐热性的贡献，为植物的获得耐热性研究提供科学数据。

试验所用拟南芥(Arabidopsis thaliana)热敏感突变体分别为hsp70-15 (AT1G79920)、apx2 (AT3G09640)、hop1 (AT1G12270)、hop2 (AT1G62740)、hop3 (AT4G12400)、hsfa7a (AT3G51910)、fes1a (AT3G09350)、hot1 (AT1G74310)，对应的T-DNA突变体分别是Cs_846012、Salk_067939、Cs_440234、Salk_ 001113C、Salk_023494、Salk_080138C、Cs_842189和Salk_066374。这些T-DNA插入突变体种子由美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)购得。

拟南芥植株的培育  拟南芥种子用70%乙醇和现配置的1% NaClO溶液进行灭菌消毒，用灭菌的去离子水清洗种子4~5次后，置于4℃春化3~ 5 d，置于培养皿在光照培养箱中培养，用Parafilm膜封口，光/暗时间为16 h/8 h，昼夜温度为22℃/ 18℃; 光照强度为30 μmol/(m²·s)；相对湿度为70%~80%, 10 d左右将幼苗移至育苗基质中培养。

突变体鉴定  取拟南芥莲座叶，采用CTAB小量法^[14]提取基因组DNA，并以基因组DNA为模板, 采用双引物法进行PCR鉴定, 所用PCR引物序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 PCR扩增所用的引物 Table 1 Primers used for PCR 引物Primer 序列Sequence (5ʹ~3ʹ) LBb1.3 GATTTTGCCGATTTCGGAACCAC LB1 CAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC Hsp70-15-RP GGAGAAGGAATTTGAGATGGC Hsp70-15-LP CGCTCTCGTCATTCATTTAGG Apx2-RP TGTTGAGATCACTGGAGGACC Apx2-LP ACCTGCAAAGGACATGATGAC Hop1-RP GCTTCCCGGGTTTTCTTTCAATCA Hop1-LP TTGCTTGTTATGTGCTACAATGGTG Hop2-RP GGTGAGACATATCAACATGGAGATAGC Hop2-LP TGTTGTGCTCAAAAAGAGTTCCGT Hop3-RP ATCTCCGGTTCAGGCTCTTTCCTCTC Hop3-LP AATGCAATCAAGCAGATTCTCACGAT Hsfa7a-RP TTGCTCACTCATGTGGACTTG Hsfa7a-LP GTTCCAGAAGCAAGTTTCGTG Fes1a-RP GTACGGACATTCATCTTGTAGTTGG Fes1a-LP CAAGTTCCTGACTTCTAGGATTGTTC Hot1-RP CAAGGCTTGATTGATCACTCTTTCAGC Hot1-LP CTTTTTTGTACATCTATTTTCAGAAGATCC

表 1 PCR扩增所用的引物 Table 1 Primers used for PCR

拟南芥幼苗的耐热性分析  幼苗在光照下于38℃预处理2 h，然后在45℃下处理1~3 h。处理后的幼苗重新放入光照培养箱中继续培养7 d后, 观察表型并拍照。每种突变体均重复试验3次。

首先，利用结合在T-DNA上的特异性引物LB3 (SAIL类型的突变体)或LBb1.3 (SALK类型的突变体)和热敏感突变体所对应基因的特异性引物RP为第一轮引物，对T-DNA进行扩增(图 1: 1, 3)。然后，利用位于T-DNA插入位点两侧的LP和RP为第二轮引物对目的基因进行扩增(图 1: 2, 4)。对扩增的T-DNA分别进行电泳验证，结果表明，T-DNA分别插在对应基因的外显子上(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 1 突变体的PCR鉴定。M: D2000 DNA标记; 1, 3: RP+LBb1.3/LB3引物; 2, 4: RP+LP引物。 Fig. 1 PCR identification of mutants. M: D2000 DNA Marker; 1, 3: RP+LBb1.3/LB3 primers; 2, 4: RP+LP primers.

图 2(Fig. 2)

图 2 T-DNA在突变基因中的位置 Fig. 2 Locations of T-DNAs in mutated genes

为了验证6个拟南芥突变体hsp70-15、apx2、hop1-2-3、hsfa7a、fes1a和hot1之间的热敏感差异, 对其进行获得耐热性表型分析。在热处理前，野生型WT和6个突变体株系均发育正常(图 3: A), 但经过38℃热适应2 h后在高温45℃处理90 min, 继续培养7 d，hot1株系逐渐白化死亡(图 3: B), 而其他株系仍正常生长，说明hot1热敏感性最高。45℃高温处理105 min后，不但hot1株系白化死亡，fes1a株系也出现大量白化死亡，表明fes1a的热敏感性低于hot1，但高于其他4个突变体(图 3: C)。

图 3(Fig. 3)

图 3 不同热敏感突变体的热敏感表型比较 Fig. 3 Phenotypic comparison of thermosensitive mutants

对突变体hsp70-15、apx2、hsfa7a和fes1a继续进行高温胁迫，以WT为对照。当胁迫2 h后, fes1a幼苗全部白化死亡，apx2与hsfa7a出现轻度的损伤，两者的热损伤均比hsp70-15严重；hsp70-15与WT均没有出现明显的损伤现象(图 3: D)。当高温胁迫2.5 h后，apx2与hsfa7a株系均出现大量的白化死亡且损伤程度大致相同，他们的热损伤均比hsp70-15严重，但hsp70-15的热损伤程度大于WT (图 3: E)。由此可见，apx2与hsfa7a的热敏感性低于fes1a，但是高于hsp70-15。

对突变体hsp70-15、apx2、hsfa7a、hop1-2-3和WT进行高温胁迫处理135 min后，hop1-2-3的损伤程度与apx2和hsfa7a几乎相同，因此，apx2、hsfa7a和hop1-2-3的热敏感性基本相同。

为了进一步证实突变体热敏感表型的准确性, 以hot1为参照，将6个热敏感突变体和野生型WT幼苗竖立放置于光照培养箱中，经过38℃获得耐热性处理和42.5℃高温处理2 h后，继续竖立培养7 d, 观察幼苗根系的生长情况(图 3: G, H)。结果表明, 经过高温处理之后，5个突变体hsp70-15、apx2、hop12-3、hsfa7a 和fes1a的根长均比hot1长，其中fes1a与hot1的差异显著(P < 0.05)，而其余4个突变体与hot1的差异极显著(P < 0.01) (图 4)。这与地上部热敏感表型结果一致。

图 4(Fig. 4)

图 4 热胁迫后突变体的根系长度。n=3。 Fig. 4 Root length of mutants that was subjected to a heat stress. n=3.

植物的热敏感相关基因及其分子机制是耐热植物生物学研究的热点，本文研究了6个拟南芥热敏感突变体的热敏感性，即fes1a、apx2、hsp70-15、hsp101、hsfa7a和hop1-2-3，其中hot1表现出最大的获得耐热性缺陷。有研究认为，热激会导致植物内蛋白质错误折叠和蛋白聚集体形成，从而影响细胞的存活^[5]。而HSP101是蛋白质聚集体的解聚蛋白酶，它与sHSP和HSP70分子伴侣协同促进这些变性蛋白聚集体的解聚，有助于恢复细胞内蛋白质稳态^[5]。HSP101是瓦解聚合蛋白的关键分子伴侣。拟南芥细胞质中HSP101为单基因编码^[3]，当该基因发生突变时，拟南芥瓦解聚合蛋白的功能基本丧失, hot1表现出明显的热敏感表型，说明瓦解高温导致的变性蛋白聚合体，是植物耐高温的关键机制。

本研究结果表明，fes1a的热敏感性仅次于hot1, 说明Fes1A相关途径与植物获得耐热性途径密切相关。Fes1A作为HSP70的核苷酸转换因子, 促进细胞溶质HSP70周转，Fes1A与HSP70结合，可以阻止HSP70的降解^[12]。尽管Fes1A是HSP70的结合蛋白，但fes1a的热敏感性明显高于hsp70-15, 其原因可能是HSP70为家族蛋白，在拟南芥中编码HSP70的有18个基因^[15]，HSP70基因的功能各不相同，HSP70-1和植物的耐热性相关^[16-17], HSP70-4参与维持细胞质中低水平的蛋白质前体和胚胎发生等过程^[17-18]，hsp70-6突变体在种子阶段经历热激处理后表现出热敏感表型^{[17, 19]}，本试验中HSP70-15在耐热性中扮演重要角色，但也只是HSP70基因家族的重要成员之一。FES1A是拟南芥中唯一表达的FES1基因^[12]，fes1a突变意味着钝化了HSP70家族的大多数成员，因此，fes1a突变体表现出比hsp70-15突变体更加热敏感。

HSFs作为热激转录因子，调控着热激蛋白的转录，在植物受到热胁迫时起重要作用，但本试验结果表明，hsfa7a突变体的热敏感性却低于hot1和fes1a。原因可能是，拟南芥中共有21个HSF，根据结构特征分为3类：A、B和C类^[20]。功能研究表明，拟南芥中A类的HSF被认为是转录激活因子，并且A1类成员在激活热诱导基因的转录中起重要作用，当植物受到热胁迫时，通过诱导多种转录调节因子(包括其他类别的HSF、DREB2A、DREB2B、MBF1C和bZIP28)的表达来触发转录级联反应，这些转录调节因子中有几种参与热应激反应和耐热性^[21]。可见，在热激响应机制中，HSFs的表达受到多个HSF的调控。当HSFA7A发生突变后，仅仅是热激调控部分环节被破坏，其他途径仍然独立发挥作用，这也解释了hsfa7a不是极度热敏感突变体。

hop1-2-3三突变体的热敏感性与hsfa7a基本相同。HOP作为一个辅助分子伴侣，衔接HSP70和HSP90，从而促进蛋白质的折叠与激活^[9]。而HSP70和HSP90仅仅是热激响应机制的一部分，因此当HOP发生突变时，破坏了HSP70和HSP90衔接, 但对其他的HSPs功能影响不大，hop1-2-3也不归属于极度热敏感突变体，说明HSP70和HSP90是否衔接对植物耐热有一定影响。

APX2作为一种代表性的ROS (reactive oxygen species)清除酶，通常在热激条件下被激活^[22]。植物经历高温后，ROS在组织中迅速积累，而ROS通常会对生物分子(如DNA和蛋白质)和细胞结构造成氧化损伤。因此，快速激活ROS清除系统对于热适应是必须的^[23]。在众多抗氧化酶中，APX和过氧化氢酶(CAT)为植物热激下ROS的主要清除剂^[24]。由于APX并不是ROS的唯一清除酶，因此，当APX2发生突变后，ROS响应通路仅仅可能部分受到损坏，热激产生的ROS仍然能够通过CAT等清除，apx2表现出与hsfa7a基本相同的热敏感表型，说明ROS途径对植物耐热性有重要作用。