广西是世界上兰科(Orchidaceae)植物九大分布中心之一，其中地宝兰属(Geodorum)的地宝兰(G. densiflorum)、多花地宝兰(G. recurvum)和贵州地宝兰(G. eulophioides)分布于广西雅长兰科植物自然保护区内^[1]。1999年，多花地宝兰被列入《国家重点保护野生植物名录》，是国家二级重点野生保护植物, 具有观赏与药用价值^[2-3]。由于人为活动破坏及生境斑块化的影响，多花地宝兰在保护区内的分布仅局限在海拔500 m，100 m×100 m的坡地内，生境为疏林下、灌木丛中、草坡等透光处，同时，由于资源开发、气候异常等原因，地宝兰属植物面临灭绝危险，亟待保护^[4]。虽然对兰科植物胚胎学发育的研究已有报道，但对多花地宝兰的研究多集中在离体快繁技术上, 而对胚胎学研究未见报道^[5-8]。2016年作者在广西大学校园多处绿化带中发现了多花地宝兰，开始观察其生长发育习性，并对其大孢子发生、雌配子发育和胚发育进行解剖学观察，以期为地宝兰属的种质资源保护和开发利用提供理论依据。

材料采自广西大学校园绿化带草地上野生的多花地宝兰(Geodorum recurvum), 4月中旬采集花葶上不同发育时期的花蕾，每隔7 d采集1次，至花序上花朵开放。花开后，每隔5 d采集1次果实，共采集6次；此后每隔10 d采集1次果实，至果实成熟，共采集3次。材料放入FAA固定液中固定24 h。然后依次浸泡于梯度酒精中进行真空抽气脱水，再依次浸泡在不同比例的酒精和TO透明剂混合液中使材料透明。加入石蜡在恒温烘箱中透蜡10 d，用石蜡包埋，在石蜡切片机上连续切片，切片厚度为8~15 μm。切片完成后，依次经过梯度酒精复水，再用铁矾-苏木精煤法染色，然后加拿大树胶封存，制成永久切片，在Leica DMLB型光学显微镜下观察并拍照。

花亭抽出后，随着子房膨大，腹缝线处的胎座细胞加速分裂形成原始胚珠原基凸起(图 1: A)。胚珠原基顶端两侧细胞快速分裂，先形成平端凸起，然后再逐渐形成“二杈指状结构”的胚珠原基(图 1: B)。授粉前胚珠原基发育缓慢，至开花时仅有少量“树状分枝”形成(图 1: C)，开花授粉后5 d内可观察到胚珠原基快速发育形成大量的“树状二杈分枝结构”(图 1: D)，随着胚珠原基的发育，在每个“分枝结构”末端表皮细胞内有3~7个细胞分化形成一列整齐排列的珠心细胞。随后，末端的珠心细胞分化形成细胞核大而明显的孢原细胞(图 1: E)，与孢原细胞相连的两个珠心细胞随着胚囊发育逐渐发育(图 1: E~I)。孢原细胞不分裂，直接经过体积膨大形成造孢细胞(图 1: F)，细胞核大而明显，造孢细胞经过细胞延长形成胚囊母细胞(图 1: G)。胚囊母细胞经过减数分裂形成四分体，四分体靠近珠孔端大孢子形成功能大孢子(图 1: H)，而合点端的3个大孢子退化。在大孢子发育过程中，珠被也同时发育，首先在造孢细胞时期，内珠被开始发育，随着孢子的发育，外珠被逐渐形成，在四分体时期内珠被完全包裹住珠心组织，外珠被则显著短于内珠被(图 1: F~H)。

图 1(Fig. 1)

图 1 胚珠与胚囊发育过程。Ar:孢原细胞; NC:珠心细胞; DM:退化大孢子; FM:功能大孢子; Nuc:合点端雌配子核; Num:珠孔端雌配子核; Anc:反足细胞; EC:卵细胞; SC:助细胞; PN:极核。A:腹缝线处胎座细胞凸起形成原始胚珠原基(箭头); B: “二杈状”胚珠原基(箭头); C:开花时胚珠原基(箭头); D:授粉5 d胚珠原基形成“树状二杈分枝结构”(箭头); E:胞原细胞期; F:造孢细胞(箭头); G:胚囊母细胞(箭头); H:四分体时期珠孔端形成功能大孢子; I:二核胚囊, 示珠孔端雌配子核(箭头); J:四核胚囊; K:八核胚囊期, 3个反足细胞和1个卵细胞、1个助细胞(连续切片); L:八核胚囊期, 2个极核(连续切片)。 Fig. 1 Development of ovule and embryo sac. Ar: Archesportial cell; NC: Nucellar cell; DM: Degenerated megaspore; FM: Functional megaspore; Nuc: Nucleus toward chalaza; Num: Nucleus toward mcropyle; Anc: Antipodal cell; EC: Egg cell; SC: Synergid cell; PN: Polar nucleus. A: Initial ovule primordium (arrow); B: Binary ovule primordium (arrow); C: A few branching of ovule primordium in bloom (arrow); D: Branching system 5d after pollination (arrow); E: Archesportial cell; F: Sporogenous cell (arrow); G: Megaspore mother cell (arrow); H: Megaspore in micropylar end develp into functional megaspore; I: Two-nucleate embryo sac, arrow show the nucleus toward micropyle; J: Four-nucleate embryo sac; K: Eight-nucleate embryo sac, 3 antipodal cells, 1 egg cell and 1 synergid cell (serial section); L: Eight-nucleate embryo sac, 2 polar nuclei (serial section).

功能大孢子经过一次横列形成二核胚囊，二核胚囊的液泡膨大使一个核移向珠孔端，另一个核移向合点端(图 1: I)。之后，二核胚囊两端的核子分别进一步分裂形成四核胚囊(图 1: J)，四核胚囊的核再进一步分裂形成八核胚囊(图 1: K~L)。八核胚囊合点端和珠孔端分别各有1个核移向中央，形成极核，靠近合点端的3个细胞形成反足细胞，靠近珠孔端的3个细胞发育形成1个卵细胞和2个助细胞，胚囊发育成熟(图 1: K~L)。因此，多花地宝兰胚囊发育类型属于单孢子蓼型胚囊。

在胚囊发育成熟时，精核已经进入到胚囊，与卵细胞融合形成受精卵(图 2: A)，而与极核融合形成初生胚乳核(图 2: B)。多花地宝兰授精完成后, 受精卵珠孔点端形成大液泡，将受精卵核推向合点端(图 2: C)。合子经过一次横裂形成二细胞原胚, 靠近合点端的细胞为顶细胞, 靠近珠孔端的细胞为基细胞(图 2: D)。基细胞经过多次不定向分裂形成细胞团，随后靠近合点端的细胞团细胞向不同方向延长膨大形成多个胚柄细胞，同时胚柄细胞积累填充物(图 2: E~N)。顶细胞有2种分裂方式，一是顶细胞经过多次横裂先形成2个等大的二细胞原球胚(图 2: E)，再形成5~6个细胞呈线形排列的原球胚，然后线形排列原胚细胞合点端的第2个细胞体积增大, 核染色加深(图 2: F)，膨大的细胞先进行纵裂，形成“棒形”原球胚(图 2: G)，此后，原球胚细胞继续向不同方向分裂增大体积形成球胚(图 2: H~I)，这是藜型胚发育过程；顶细胞首先与一个来自基细胞的原胚细胞形成不等体积的二细胞原球胚(图 2: J)，然后顶细胞进行一次纵裂形成“T”形原球胚(图 2: K)，同时原胚细胞经过2~3次橫裂使“T”形原球胚伸长(图 2: L)，此后这些胚细胞向不同方向分裂形成球形胚(图 2: M~N)，这是紫苑型胚发育过程。在种子成熟期，两种不同胚发育方式最终形成两种不同的球胚形态(图 2: I, N)。开花后约30 d，胚发育停止，但是种子发育成熟约在开花后45 d, 种子成熟时胚为球形胚。在胚的发育过程中没有观察到胚乳核的发育。

图 2(Fig. 2)

图 2 两种类型胚发育过程。AN:反足核; DS:退化助细胞; EN:卵核; SN:精核; DA:退化反足细胞; EE:卵器; PN:极核; AC:顶细胞; BC:基细胞; ES:延长胚柄细胞; TGPC:藜型二细胞原球胚; EEC:顶端胚细胞; Enec:膨大胚细胞; LDE:膨大胚细胞纵向分裂; TDE:顶端细胞横向分裂; TGPA:紫苑型二细胞原球胚; TW:横向壁; LW:纵向壁。A:精细胞与卵核融合; B:精核与极核融合; C:受精卵(箭头); D:二细胞原胚; E:藜型二细胞原球胚，两个胚细胞等大; F:多细胞线性原球胚; G: “棒形”原球胚; H:藜型胚发育中早期球形胚; I:藜型胚发育中种子成熟期的球形胚; J:紫苑型二细胞原球胚，两个胚细胞不等大; K: “T”形原球胚; L:进一步发育的“T”形原球胚; M:紫苑型胚发育中早期球形胚; N:紫苑型胚发育中种子成熟期球形胚。(E~I:藜型胚发育；J~N:紫苑型胚发育) Fig. 2 Development of embryo in two types. AN: Antipodal nucleus; DS: Degenerated synergid; EN: Egg nucleus; SN: sperm nucleus; DA: Degenerated antipodal cell; EE: Egg epparatus; PN: Polar nuclei; AC: Apical cell; BC: Basal cell; ES: Elongated suspensor; TGPC: Two-celled globular proembryo in Chenopodiad type; EEC: End embryo cell; Enec: Enlarged embryo cell; LDE: Longitudinally divisional enlarged-cell; TDE: Transversely divisional end-cell; TGPA: Two-celled globular proembryo in Asters type; TW: Transverse wall; LW: Longitudinal wall. A: Egg nucleu is fertilizing with sperm cell; B: Polar nucleus and sperm cell is melting; C: Zygote (arrow); D: Two-celled proembryo; E: Two-celled globular proembryo in Chenopodiad type, two embryonic cells are similar; F: Filamentous globular proembryo; G: Clavate globular proembryo; H: Early globular proembryo in chenopodiad type; I: Globular embryo of chenopodiad type in the mature seed; J: Two-celled globular proembryo in Asters type that contains two different cells; K: T-shaped proembryo; L: Further developmental T-shaped proembryo; M: Early globular proembryo in asters type; N: Globular embryo of asters type in the mature seed. (E-I: Chenopodiad type; J-N: Asters type)

胚囊发育  兰科植物胚囊的发育过程具有多样性，体现在母细胞减数分裂、功能大孢子选择、雌配子形成过程的多样性。减数分裂过程的多样性体现在二分体细胞进行第二次减数分裂的时间和方式，第一种类型是2个二分体细胞同时进行，形成呈线性排列的四分体；第二种是珠孔端二分体细胞先进行第二次减数分裂形成3细胞的线性胚囊, 然后合点端的二分体细胞再进行第二次减数分裂, 最终形成4细胞的线性胚囊；第三种是珠孔端二分体细胞完成第二次减数分裂形成3细胞线性胚囊后, 合点端二分体细胞进行1次纵裂，形成四核“T”形胚囊^[9–11]。多花地宝兰大孢子形成的方式属于第一种分裂方式。减数分裂完成后，功能大孢子选择的多样性体现在功能大孢子数目上，仅形成1个功能大孢子为单孢型，如文心兰(Oncidium flexuosum)^[12]、蕙兰(Cymbidium faberi)^[13]等；形成2个功能大孢子则为双孢型，如小叶兜兰(Paphiopedilum barbigerum)^[14]。多花地宝兰胚囊在珠孔端形成1个功能大孢子, 属于单孢型。功能大孢子发育完成后进行有丝分裂形成雌配子。兰科植物雌配子发育具有显著的多样性，主要体现在四核胚囊期合点端雌配子核的发育上，最终成熟胚囊雌配子核数目不同。天麻(Gastrodia alata)的4核成熟胚囊是在四核胚囊期合点端的雌配子核退化，珠孔端的4个细胞发育成1个极核和3细胞的卵器，胚囊中没有反足核^[15]。火烧(Epipactis helleborine)在四核胚囊期，合点端的2个雌配子核不再分裂，因此由合点端2个核和珠孔端的4个核发育成6核成熟胚囊^[16]。而美冠兰(Eulophia graminea)的7核胚囊则是由于在四核胚囊期，合点端仅有1个雌配子核进行分裂，最终成熟胚囊由合点端3个核和珠孔端4个核组成^[10]。8核胚囊是最为常见的类型，在四核胚囊期合点端和珠孔端的核均能进行分裂，各形成4个核, 组成8核胚囊，如鹤顶兰(Phaius tankervilliae)^[17]、文心兰(Oncidium flexuosum)^[12]等。多花地宝兰成熟胚囊属于8核胚囊，是大孢子经过3次有丝分裂形成8个雌配子核；8核胚囊进一步发育形成具有2个极核、1个卵细胞、2个助细胞和3个反足细胞的成熟胚囊, 这个发育过程属于蓼型胚囊。植物胚囊发育的多样性，是植物系统进化过程的自然选择，同物种可以存在1种或多种胚囊的发育方式，如铃兰(Convallaria majalis)的胚囊发育同时存在单孢蓼型和双孢英地百合型两种类型^[18]。在植物系统演化中，一般认为单孢蓼型胚囊是原始类型，而其他胚囊发育类型均从蓼型胚囊演化而来。多花地宝兰胚囊发育类型是单孢蓼型，因此，多花地宝兰的胚囊发育在兰科植物中属于较为原始的类型^[19-21]。同时根据珠被系统演化特点，多层珠被为原始性状，多花地宝兰具有2层珠被，属于较为原始的类型^{[19-20, 22]}。因此推测多花地宝兰的进化程度在兰科植物中较为原始。

胚的发育  兰科植物花授粉之后，花粉作为激素源刺激胚珠开始快速发育，使其完成受精。完成受精后，目前被子植物受精卵第一次分裂一般为橫裂，形成顶细胞和基细胞。根据顶细胞与基细胞的发育方式，被子植物的胚发育划分为5种类型:柳叶菜、紫苑型、茄型、石竹型和藜型^[19-23]。在柳叶菜型和紫苑型中，顶细胞进行1次纵裂形成“T”形原胚，柳叶菜型胚的基细胞基本不参与胚的发育，如无耳沼兰(Dienia ophrydis)^[24]，而紫苑型胚的基细胞参与胚发育，如大花杓兰(Cypripedium macranthos)^[25]；而在茄型、石竹型和藜型胚中，顶细胞首先进行1次橫裂形成线性原胚，茄型、石竹型胚的基细胞基本不参与胚的形成，藜型胚的基细胞参与胚的形成，如苞舌兰(Spathoglottis plicata)^[26]; 茄型胚的基细胞经过1~2分裂形成少量的胚柄细胞, 目前兰科植物中尚未报道有茄型胚发育类型^[27], 而石竹型胚的基细胞不进行分裂，胚柄细胞由顶细胞衍生而来，如无距虾脊兰(Calanthe tsoongiana)^[28]、扇脉杓兰(Cypripedium japonicum)^[29]。布袋兰(Calypso bulbosa)同时存在藜型和柳叶菜型两种胚发育类型^[30]，而多花地宝兰也同时出现藜型和紫苑型两种胚发育类型，但是这种胚发育类型的系统学意义尚未明确。有研究表明，兰科植物胚柄的发育具有多种形态，如扇脉杓兰^[29]、文心兰^[12]胚柄细胞整齐排列，其中1至多个细胞膨大伸长；鹤顶兰^[22]、无距虾脊兰^[28]仅1个膨大的胚柄细胞。多花地宝兰胚柄的发育方式与美冠兰^[27]相似，基细胞分裂的细胞团向不同方向延长形成多个“绒毛状”胚柄细胞。同时，在多花地宝兰胚的发育过程中没有观察到胚乳的发育。有研究表明，兰科植物种子成熟期无胚乳，多数兰科植物胚发育过程中难以观察到胚乳的发育, 而发达的胚柄细胞代替胚乳细胞在胚的发育过程提供营养^[16]。因此，多花地宝兰中胚发育的营养主要来源于“绒毛状”的胚柄细胞。

兰科植物花从授粉到胚发育停止所需时间差异较大，大花杓兰约28 d^[25]、鹤顶兰约需41 d^[22]、无距虾脊兰约51 d^[28]、小叶兜兰约135 d^[14]，而多花地宝兰则需要约30 d。

被子植物为了适应不同环境下的传粉效率，增加受精机会和繁殖系数，多种科属中存在多胚囊、多胚的现象，不同植物中胚囊和胚的发育过程也是复杂多变的^[31]。在植物系统演化上，兰科植物是较为特化的群体，其生活环境复杂多样^[32-33]。兰科植物胚和胚囊发育的多样性可能与生长环境和进化程度有关，即在进化过程中为了适应不同的环境形成不同的发育方式。