花蜜作为传粉昆虫的营养成分，在植物-传粉昆虫的互作关系中扮演着重要角色，与被子植物及其传粉者的多样化具有密切关系^[1]。花蜜一般都含有糖类、氨基酸、无机离子、蛋白质和脂类等，有些花蜜还含有生物碱、萜类以及一些挥发性物质^[2]。许多研究者认为，花蜜特征可能决定着传粉者种类，这与访花动物觅食花蜜的行为有关^[3]。

兰科植物具有高度多样化和复杂的传粉机制。Jersakova等^[4]和任宗昕等^[5]综述了兰科植物的传粉机制，并将其分为有回报的昆虫传粉、泛化的食源性欺骗、拟态、性欺骗、产卵地欺骗、庇护所模拟和自花传粉等。有回报传粉会为传粉昆虫提供相应的报酬，由于兰科植物形成花粉块，因此许多兰科植物仅能分泌花蜜作为传粉回报^[6]。花蜜的产生是兰科植物的祖传特征(plesiomorphic trait)，随着不断的进化与环境的改变，所有兰科植物中有30%~50%失去了这种产生花蜜的能力，不再利用花蜜作为回报，而它们的授粉是通过欺骗实现的^[7]。一般来说，有报酬和无报酬兰科植物之间存在着很大的差异, 后者的繁殖成功率通常比前者低得多^[8]。花蜜的有无深刻影响了兰科植物与传粉昆虫的互作与协同进化，而欺骗性传粉的种类为花蜜特征变异的极端情况。因此，开展花蜜报酬兰科植物花蜜特征(包括花蜜体积和糖成分)的变异性研究，是研究兰科植物传粉机制的重要环节。

多叶斑叶兰(Goodyera foliosa)分泌花蜜作为传粉昆虫的报酬，目前已经发现有中华蜜蜂(Apis cerana)、橘尾熊蜂(Bombus friseanus)、东亚无垫蜂(Amegilla parhypate)和日本芦蜂(Ceratinidia japonica)等4种昆虫帮助其传粉，传粉的吸引机制可能有花色、花气味和花蜜(刘南南等，未发表数据)。目前国内外对于斑叶兰属植物的研究主要集中在野生资源调查^[9-10]、生殖分配^[11]、化学成分^[12]、无菌萌发和快速繁殖等方面^[13-14]，未见有关多叶斑叶兰花蜜可溶性糖成分、含量及其糖浓度与访花昆虫关系的研究报道。对多叶斑叶兰花蜜成分进行检测，为兰科植物花蜜成分及含量提供了基础实验资料，能够有效预测访花昆虫和有效传粉昆虫的种类以及昆虫访花的行为与觅食偏好，对探讨昆虫传粉机制具有十分重要的意义。

沃特世安捷伦e2695高效液相色谱仪(配备有2424蒸发光散射检测器，Waters公司，USA); BSA 224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司); EQ 3200 DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器科技公司)；Master-S Plus UF超纯水机(上海和泰仪器有限公司)。

多叶斑叶兰(Goodyera foliosa)的花采自江西省赣州市龙南县九连山自然保护区。

D-果糖(纯度为99.0%，Amresco)、D-无水葡萄糖(纯度为99.8%，Amresco)、蔗糖(纯度为99.9%, Amresco)、D-麦芽糖(纯度为99.0%，Sigma)，乙腈(色谱纯，阿拉丁)，实验用水为超纯水。

色谱柱：XBridge Amide (4.6 mm×250 mm, 5 µm, 安捷伦科技有限公司)，流动相为乙腈(A相)和水+ 0.02%三乙胺(B相), 流动相梯度洗脱程序: 0~12 min, 80% A; 12~14 min, 79% A; 14~24 min, 70% A; 24~ 25 min, 69% A; 25~30 min, 80% A。流速: 1.0 mL/min, 柱温：40℃，进样量10 μL，ELSD参数：雾化管温度为36℃，增益值为100，漂移管温度为80℃，氮气压力为50 psi。

糖标准储备液  精密称取D-果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品各0.050 g (精确至0.001 g), 用水溶解，定容至25 mL，过0.45 μm滤膜，于4℃冰箱中保存。

糖混合标准工作液  分别吸取4种糖的标准储备液2.5 mL于同一容量瓶中，加水定容至10 mL，得2 000 μg/mL的糖混合标准溶液, 然后分别用水稀释成200、600、1 000、1 500、2 000 μg/mL标准工作液，0.45 μm滤膜过滤，于–80℃冰箱中保存，待测。

花蜜的采集  随机选择多叶斑叶兰盛花期植株30株，8:00-16:00每隔2 h，从每株上各采摘盛花期花朵1朵，共30朵。参照李左栋等^[15]的方法，将花解剖开，用5 µL的毛细管在解剖镜下反复采集多次，直到采集完全。

花蜜的前处理  精密称取0.10 g花蜜溶于5 mL纯水中，定容至10 mL，用0.45 μm的过滤膜将样品溶液过滤入样品瓶中待测。

用配制的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液绘制以峰高为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标的标准工作曲线，保证样品溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的响应值均应在标准工作曲线的线性范围内。样品溶液及平行试样和空白试样与标准工作溶液按上述步骤处理，等体积进样，在同样的色谱条件下测定。

随机选择多叶斑叶兰盛花期植株30株，进行套袋，同时称量配套的带盖离心管和毛细吸管(华西医科大学仪器厂，0.3 mm)的初始质量并用自封袋密封备用。第2天8:00-16:00每隔2 h (与套袋时间相隔24 h左右)，从每株上选取盛花期花朵1朵，共30朵，用5 µL毛细吸管将花蜜吸入到离心管中，密封并带回实验室再次称离心管和毛细吸管质量，并用手持折光仪(陆恒LH-T10，0~50%, 杭州，中国)直接测定糖浓度，同时根据质量差计算单花花蜜体积，最后对单花花蜜体积及糖浓度进行数据分析^[16]。

连续2年在花期内，每日的8:00-18:00, 累计约400 h，选择天气晴朗的时候用摄相机(LUMIX D100, 日本)对访花昆虫定点拍照、摄像，记录访花行为、访花时间、访花频率等。用捕虫网捕捉昆虫，固定标本送往中国科学院动物研究所和昆明植物研究所进行鉴定，标本存放在南昌大学江西省植物资源重点实验室。

吸取4、8、12、16、20 μL标准混合液进样分析，以峰面积对数y为横坐标，标准样质量对数x为纵坐标进行线性回归分析，得到线性回归方程和相关系数(表 1)。可见，回归方程呈线性，相关系数为0.994 7~0.996 2，说明数据是有效的。

表 1(Table 1)

表 1 4种糖标准曲线参数 Table 1 Parameters of standard curve of 4 kinds of sugar 标准品 Standard 回归方程 Regression equation 线性范围 Linear range (μg/mL) 相关系数 Correlation coefficient (R2) 果糖Fructose y=1.7373x+4.0085 200~200 0 0.996 2 葡萄糖Glucose y=1.7932x+3.9897 200~200 0 0.994 7 蔗糖Sucrose y=1.683x+4.2242 200~200 0 0.995 0 麦芽糖Maltose y=1.6002x+4.205 200~200 0 0.995 8

表 1 4种糖标准曲线参数 Table 1 Parameters of standard curve of 4 kinds of sugar

对果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准品进行检测，出峰时间分别为8.673、10.912、17.138和18.715 min，且能较好地区分(图 1: A)，制作标准曲线用于定量分析。从多叶斑叶兰花蜜的可溶性糖提取液中，检测到蔗糖和果糖，检测不到葡萄糖和麦芽糖(图 1: B~F)。从图 2可见，花蜜的2种可溶性糖中，果糖在上午10:00的含量达到最高, 为78.310 mg/g；蔗糖在下午16:00的含量达到最高, 为247.600 mg/g。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同时段花蜜的糖成分。A:标准品; B: 8:00; C: 10:00; D: 12:00; E: 14:00; F: 16:00。 Fig. 1 Composition of sugar in nectar at different periods. A: Standards; B: 8:00; C: 10:00; D: 12:00; E: 14:00; F: 16:00.

图 2(Fig. 2)

图 2 不同时段花蜜中糖含量的变化 Fig. 2 Changes in contents of sugars in nectar at different periods

根据不同时段单花花蜜体积与糖浓度分析可知(图 3)，单花花蜜体积在早上10:00达到最大, 为(7.19±2.29) μL (n=10)，不同时段单花花蜜体积有显著差异(Kruskal Wallis, P=0.029)，变化趋势为10:00 > 8:00 > 16:00 > 14:00 > 12:00。糖浓度在下午16:00达到最大，为(25.85±1.83)% (n=10)，不同时间段糖浓度也有显著差异(Kruskal Wallis, P=0.001), 变化趋势为16:00 > 10:00 > 12:00 > 14:00 > 8:00。不同时间段单花花蜜体积与糖浓度间无相关性(Peaeson, P=0.73)。

图 3(Fig. 3)

图 3 不同时段单花花蜜体积与糖浓度的变化 Fig. 3 Changes in nectar volume and sugar concentration in single flower at different periods

通过录像观察，夜间未见有昆虫来访，白天共有10种昆虫访问多叶斑叶兰。小黑斑凤蝶(Chilasa epicydes)和胡蜂科(Vespidae)昆虫在进行访花时只会在花的表面游走，未见有接触花粉及柱头的行为。青背长喙天蛾(Macroglossum bombylans)与曲纹袖弄蝶(Notocrypta curvifascia)在访问过程中，只有口器前端部分伸入花中，并没有带出花粉块。狡臭蚁属(Technomyrmex)和盘腹蚁属(Aphaenogaster)的蚁类会长时间停留在蜜囊内，吸食花蜜，但并不能带走花粉块，为盗蜜者。

多叶斑叶兰传粉昆虫为中华蜜蜂、橘尾熊蜂、东亚无垫蜂和日本芦蜂。中华蜜蜂、橘尾熊蜂与东亚无垫蜂的头部长宽均大于花的开口长宽，其口器长度与合蕊柱长度的比例分别为1:1、2:1和4:1, 其在访花时，头部不能伸入花内，只能将口器伸入唇瓣囊内，退出时，花粉块背面的粘盘分别粘在口器的末端、中部与前中部；日本芦蜂的头部长宽小于花的开口长宽，口器长略短于合蕊柱长度，其在访花时，口器虽较短，但其头部能够伸入花内, 退出时，花粉块背面的粘盘亦能粘在口器的末端。中华蜜蜂访花时间为每天9:00-15:00，访花高峰期在10:00-14:00，橘尾熊蜂访花时间为每天8:00-16:00, 访花高峰期在上午10:00-12:00与下午16:00-18:00, 东亚无垫峰与日本芦蜂访花次数较少，未有较详细的记录。

一般情况下，在花蜜糖浓度低于8%时，蜜蜂不去采集或采集的频率较低，糖浓度高于8%时, 蜜蜂才开始采集。若外界的蜜源丰富，蜜蜂一般要在糖浓度达到15%~20%以上时才去采集^[17]。对多叶斑叶兰花蜜1 d内糖浓度进行测定，结果表明，花蜜的糖浓度为23.73%~25.85%，且在下午16:00达到最大，不同时间段的糖浓度有显著差异，观察发现中华蜜蜂访花高峰期在10:00-14:00, 橘尾熊蜂访花高峰期在10:00-12:00与16:00-18:00，说明昆虫访花频率与多叶斑叶兰单花花蜜体积有较高的相关性，昆虫更倾向于访问较高浓度糖含量与花蜜体积的花朵。花蜜体积在一定范围内进行波动的原因也有可能是中午温度过高，或者是调动昆虫访花积极性的一种策略。

Wykes等用纸层析法对多种花蜜中的糖类进行半定量分析，发现其大多数都是由葡萄糖、果糖和蔗糖组成^[18]。Baker根据花蜜中3种常见糖间的比值[蔗糖/(葡萄糖+果糖)]，将其划分为4种类型: (1)蔗糖占优势(大于1.0)；(2)富含蔗糖(0.5~1.0)；(3)富含己糖(0.1~0.5)；(4)己糖占优势(小于0.1)^[19]。花蜜中各种糖的成分在一定情况下能够反映出传粉昆虫特有的先天偏好^[20-21]，例如，蜜蜂采集含有蔗糖、葡萄糖和果糖(1:1:1)的草木犀(Melilotus spp.)的花蜜比采集蔗糖占优势的苜蓿(Medicago spp.)、红三叶草(Trifolium repens)或杂三叶草(T. hybridum)的花蜜频率更高^[22]。长吻蜂、蝶类、蛾类、蜂鸟和旧大陆蝙蝠一般喜欢富含蔗糖的花蜜植物, 而短吻蜂、蝇类、栖鸟类和新大陆蝙蝠一般喜欢富含己糖的花蜜植物^[23]。通过对多叶斑叶兰花蜜可溶性糖成分及糖浓度的测定，发现其花蜜中蔗糖/(葡萄糖+果糖)=2.96，为蔗糖占优势的花蜜，所以多叶斑叶兰能有效吸引各种蜂类、蝶类和蚁类访花, 且访花频率较高。通过观察共发现4种形态、大小各异的昆虫能够为其进行传粉，由于昆虫头部大小与口器长度的不同，使得花粉块粘在口器的位置也各有差异，保证了形态各异的昆虫能够巧妙的与多叶斑叶兰的花结构相适应，达到传粉目的。