2020, Vol. 28
b. 湖南农业大学 园艺学院, 长沙 410128
b. College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
狭叶薰衣草(Lavandula angustifolia)系唇形科(Labiatae)薰衣草属植物，多年生草本或半灌木, 素有“芳香药草之后”的美誉[1]。狭叶薰衣草挥发油含有具特殊香味的多种成分，有镇静安神，抗菌消炎[2–3], 增强免疫活性等功效，可用来开发为植物精油[4]、喷雾制剂、日用化妆品等，具有很高的药用、保健价值和经济价值[5]。由于狭叶薰衣草种子发芽率低，且出苗很不一致，要达到60%~70%的出苗率，需2~3个月的时间，生长周期较长，且通过扦插繁殖生根率较低。目前，国内对薰衣草挥发油主要成分的研究主要是以新疆薰衣草为材料，取其干花进行挥发油提取[6–8]。但从薰衣草无菌苗鲜样提取的研究较少。因此，通过组织培养建立薰衣草优良种质快速繁殖体系，研究其离体培养产物挥发性成分对于推广优良薰衣草的种植及离体培养产物的开发与利用具有重要实践指导意义[9]。
1 材料和方法 1.1 材料供试材料取自湖南农业大学园林花卉基地盆栽的狭叶薰衣草(Lavandula angustifolia)。
1.2 方法种子萌发 用无菌水将薰衣草种子分别浸种0、3、6、9 h；在超净工作台上先用70%的酒精消毒30 s, 用无菌水冲洗1次，再用0.1%的升汞溶液消毒薰衣草种子8 min，最后用无菌水冲洗3次，在无菌纸上将种子切开，分别接种于6-BA (0, 0.5, 1, 2 mg/L)+2, 4-D (0.5, 1, 2 mg/L)的种子发芽和MS愈伤组织诱导培养基上，每瓶10粒，每处理5瓶。观察并记录种子出芽率，筛选适宜的种子萌发培养基。
愈伤组织的诱导 以消毒后的狭叶薰衣草茎、叶为外植体，将茎切断，叶切片，分别接种于附加不同浓度配比6-BA和2, 4-D的MS愈伤组织诱导培养基上。观察并记录愈伤组织诱导率，筛选适宜的愈伤组织诱导培养基。
分化与增殖培养 将外植体脱分化诱导产生的愈伤组织切块，转接到不同浓度配比的6-BA (0.5, 1, 2 mg/L)+NAA (0.5, 1, 2 mg/L)培养基上，诱导愈伤组织产生丛芽，观察诱导结果，统计增殖率。
生根培养 将2~3 cm的丛芽切割接入1/2MS培养基，并添加不同配比的NAA (0.5, 1, 2 mg/L)和6-BA (0, 0.5 mg/L)，诱导丛芽产生不定根，观察统计生根率。
以上培养温度均为(25±2)℃，以日光灯为光源，连续光照12 h/d。
1.3 挥发性成分提取分离和分析挥发性成分提取 分别取30 g未开花的盆栽和培养的狭叶薰衣草茎叶切碎，放入蒸馏瓶，加水500 mL，浸泡30 min后，用电炉加热，水蒸气蒸馏6 h，收集蒸馏产物。
挥发性成分分析 通过GC-MS检测[10]获得气质图谱，对图谱数据进行分析。GC-MS条件:前进样口温度250℃；接口温度150℃；离子源: 230℃; 质量扫描范围m/z: 45~500，最小峰面积比例: 1.5%。升温程序：80℃保持5 min；以10 ℃/min升至270℃, 保持10 min；分析时间共34 min。无菌苗挥发油样品稀释100倍后进样，进样量：1 μL。
2 结果和分析 2.1 种子发芽从表 1可见，随着浸泡时间的延长，种子的出芽时间相对缩短；浸泡时间为6和9 h，出芽时间均为6 d，因此可以判断6 h为最适浸泡时间。是否切开对种子出芽率影响很大，未切开的种子出芽率很低。
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表 1 不同浸泡时间对诱导种子出芽的影响 Table 1 Effects of different immersion time on seed germination |
种子浸泡6 h切开后，接种在含不同浓度配比的2, 4-D和6-BA培养基上，诱导种子萌发。从表 2可见，2, 4-D诱导种子的愈伤质量不高，根毛多容易褐化。6-BA诱导种子出芽效果较好，随着浓度的升高，出芽量增多，分化增多，因此，诱导薰衣草种子出芽的培养基为MS+6-BA 2 mg/L。
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表 2 不同生长调节剂组合配比对愈伤组织诱导的影响 Table 2 Effects of growth regulation combination on callus induction |
分别将幼嫩狭叶薰衣草的叶片切块、茎切段, 接种在不同浓度配比的6-BA和2, 4-D培养基上。从表 3可见，随着2, 4-D浓度的增加，茎的愈伤组织诱导率也逐步上升，达到1 mg/L后有所下降，随着6-BA浓度的增加，愈伤组织越来越致密。但过高的6-BA浓度反而抑制愈伤组织的诱导。以茎为外植体的愈伤组织诱导率最高，可达95%；叶片的诱导率最低，为35%。因此，茎的最适愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2 mg/L+2, 4-D 1 mg/L，叶的最适愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2 mg/L+2, 4-D 0.5 mg/L。
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表 3 不同生长调节剂组合配比对愈伤组织诱导的影响 Table 3 Effects of different plant growth substances combination on callus induction |
将诱导产生的愈伤组织切块，转接到含不同浓度配比的6-BA和NAA培养基上，诱导愈伤组织产生丛芽，从表 4可见，6-BA浓度低时，丛芽稀疏, 随着6-BA浓度增大，丛芽更加密集，可见6-BA浓度对诱导狭叶薰衣草分化丛芽的影响较大。在6-BA浓度到2 mg/L，NAA浓度超过1.0 mg/L时丛芽开始扭曲。将丛芽接在6-BA浓度为1 mg/L，NAA浓度为0.5 mg/L的培养基上，30 d后，丛芽增值率高达521.05%。丛芽生长密集、壮实、自然。因此，诱导狭叶薰衣草愈伤分化产生丛芽最适的培养基为MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L。
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表 4 不同生长调节剂组合配比对诱导分化丛芽的影响 Table 4 Effects of different plant growth substances combination on callus differentiation |
将愈伤诱导产生的丛芽(2~3 cm高)取出，转接入1/2MS培养基，并加以不同的NAA、6-BA配比，诱导丛芽产生不定根，观察诱导结果。从表 5可见，接种30 d后，根系已基本生长出来。不同生长调节剂的浓度变化使得根的生长情况差异较大。NAA浓度变化对诱导丛芽生根影响较大，浓度超过1 mg/L后，根系形态从细长均匀发展成粗短扭曲，不适宜植株生长。诱导生根最适培养基为1/2MS+ NAA 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+3%活性炭，此时不定芽生根数量最多, 生根均匀且不容易褐化，而且芽的生长也很好。
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表 5 不同生长调节剂组合配比对诱导生根的影响 Table 5 Effects of different plant growth substances combination on root origination |
将盆栽1 a生的试管苗和离体培养的狭叶薰衣草茎叶分别用水蒸汽蒸馏提取，正己烷溶解后，进行GC-MS分析，采用wiley7n.1标准谱图库检索，通过色谱峰面积归一法计算各组分含量。从表 6可见，盆栽狭叶薰衣草茎叶挥发油中的主要有效成分有：龙脑(4.75%)、表双环倍半水芹烯(3.50%)、叶绿醇(1.78%)和香豆素(0.56%)。龙脑，俗称冰片, 具有较高的药用价值，但有毒，使用需谨慎[11]。从表 7可见，狭叶薰衣草无菌苗茎叶挥发油中的主要成分有：叶绿醇(4.87%)、氧化石竹烯(3.44%)、2, 4-二叔丁基苯酚(3.18%)、丁香油烃(1.46%)和邻苯二甲酸二异丁酯(1.30%)。叶绿醇是合成维生素K和维生素E的原料[12]；氧化石竹烯，具有镇痛和消炎的作用[13]；2, 4-二叔丁基苯酚，用于合成抗氧剂168、紫外线吸收剂、再生胶活化剂460等[14]；丁香油烃，可用作化妆品香料；邻苯二甲酸二异丁酯，主要用作增塑剂[15]。
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表 6 盆栽狭叶薰衣草挥发油主要化学成分 Table 6 Main chemical components of volatile oil in potted Lavandula angustifolia |
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表 7 离体培养狭叶熏衣草挥发油主要化学成分 Table 7 Main chemical components of volatile oil from Lavandula angustifolia in vitro |
本研究结果表明，不同浸泡时间对狭叶薰衣草种子的无菌出芽时间影响显著，但浸泡时长也有一个较为明显的临界点，超过临界点，出芽时间不再随着浸泡时间的延长而缩短。这与李珊珊等的新疆薰衣草种子发芽试验结果一致[16]。本研究结果还表明，浸泡种子时是否切开对出芽率影响显著，未切开种皮的种子出芽率比切开种皮的低，这可能和种子自身性质有关，狭叶薰衣草种皮角质化且外包蜡质，种子较小[17]。同时，2, 4-D对诱导种子产生愈伤组织的质量不高，根毛多容易褐化，而6-BA的诱导种子出芽效果较好。
3.2 不同培养条件对愈伤组织诱导、分化出苗的影响结果表明，狭叶薰衣草的茎比叶容易诱导产生愈伤组织，而叶片最容易诱导的部位是幼嫩叶片的叶脉；从不同植物生长调节剂对愈伤组织的诱导效果来看，植物生长调节剂的量并不是越多越好，对不同的材料应选择合适的浓度。
结果表明，当6-BA浓度升高时，丛芽分化数量显著增多，但当6-BA浓度达到2 mg/L时，玻璃化苗率增加，而且植株形态不正常，发生扭曲。这与黄珊珊等[18]的研究结果一致，说明在丛芽的诱导过程中，并不是生长调节剂的浓度越高越好[19]，因为玻璃化苗会不利于植株的生长发育。另外，添加0.3%的活性炭会使培养基更清澈，植株长势更好。左丽娟等报道添加微量IBA对薰衣草的分化增殖起到促进作用[20]，说明多种植物调节剂协同作用会对薰衣草的分化增殖有促进作用。因此, 在MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3%活性炭的培养基配方上进行适当调整，会有利于狭叶薰衣草的离体培养。
在诱导不定根的过程中，植株容易褐化，影响根的生长，而在培养基中添加少量的6-BA和0.3%活性炭，能有效抑制褐化促进生根。
3.3 狭叶薰衣草挥发性成分的分析盆栽狭叶薰衣草茎叶的挥发油得率为1.02% (V/m)，而离体培养的狭叶薰衣草无菌苗挥发油极微量，这可能是离体培养的狭叶薰衣草取材时还处于幼嫩时期，油细胞尚处发育阶段，数量较少，因此分泌和积累挥发油类物质不足。另外，与新疆薰衣草的挥发油成分[21–23]进行比较，本试验的狭叶薰衣草中未检测出芳樟醇和乙酸芳樟酯等成分，这可能是采用的材料是未开花的茎和叶鲜样，没有花; 这与王强等[24]的研究结果一致。本试验地湖南常年降水充足，年日照时长远低于新疆地区，离体培养的光照、温度等条件也与新疆地区不同，这也会影响薰衣草挥发油成分的稳定性[25]。另外，提取和检测方法不同也会使挥发油成分产生差异[5, 8, 26–27]。狭叶薰衣草无菌苗具有浓烈香味，虽然两种培养方式的薰衣草挥发油成分差异较大，但均含有龙脑、叶绿醇和肉桂酸类化合物，这些是薰衣草挥发油的重要组成成分。同时，离体培养的薰衣草挥发油中还检测出具有抗氧化作用的2, 4-二叔丁基，可用作防晒剂成分[28]；氧化石竹烯具有消炎镇痛作用，这说明可通过不断改进培养条件，有针对性地进行培养和繁殖来获取不同挥发性成分。
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