2019, Vol. 27
2. Agriculture Victoria, AgriBio, Centre for AgriBioscience, Victoria 3086, Australia
2. Agriculture Victoria, AgriBio, Centre for AgriBioscience, Victoria 3086, Australia
我国是典型的农业大国，畜牧业是我国农业的重要组成部分，优良牧草草种选育是草食畜牧业的发展关键[1]，而目前饲料粮短缺已经成为我国粮食安全问题中亟需解决的重要问题[2]。旋扭山绿豆(Desmodium intortum)，又名绿叶山绿豆、绿叶山蚂蝗，是华南师范大学生物固氮专家莫熙穆教授1979年从澳大利亚引种的一种具有饲料、绿肥、水土保持兼用的多年生草本豆科牧草[3]。上个世纪80-90年代，旋扭山绿豆曾在广东鉴江流域被推广应用[3]，但之后并未在南方各省推广开来。其中低温可能是限制其推广应用的重要因素之一。而低温胁迫是牧草栽培中遇到的常见灾害之一，它不仅会对植物生长造成严重损伤，甚至会引起植株死亡，在生产上造成严重损失[4]。我国南方地区水热条件优越，适宜农作物种植。但是许多热带亚热带牧草仍然会出现冬季生长缓慢甚至停止生长的现象，从而导致冬季青饲料供应的短缺[5]。且近年来全球极端气候频发, 南方多次出现强降雨、雪天气，对农牧业生产造成极大损失[6]，如1999、2016年的寒害分别给广东农业生产造成108和61亿元的巨大损失[7-8]。随着最低气温变化的不稳定性增加，极端寒害的影响将会进一步加重[9]。因而在优质冬青饲料草种缺乏的背景下[5]，研究引种牧草旋扭山绿豆对低温的耐受性非常必要，有助于解决人畜争粮的矛盾，也对更好地发展畜牧业及保护生态环境具有重要的指导意义。
很多研究表明，低温逆境下植物可提高抗氧化酶活性并且主动积累更多的亲水性渗透物质，这些物质的大量积累一方面可以清除大量有害的活性氧自由基，另一方面能够增强细胞的保水能力，从而维持细胞渗透平衡以适应胁迫生境，与植物的抗寒性密切相关[10-13]。而叶绿素荧光参数也有助于探明光合机构受逆境胁迫伤害的部位和程度[14]。但是目前对旋扭山绿豆的研究主要在引种栽培技术[3, 15]、营养器官及品质评价[16-18]、根瘤菌的抗碱性与共生固氮[19]、结瘤因子与诱导表达[20-21]、作物间作[22]、养分与微生物互作[23]和果园套种对害虫的生态防控[24-25]等方面。最近虽有研究表明，旋扭山绿豆可在广州冬季保持青绿越冬，具有较强的抗寒性[4]，但尚未见旋扭山绿豆对低温胁迫生理响应的报道。
在引种和培育抗寒品种过程中，确立评价植物抗寒性的方法是其中的重要环节。目前植物抗寒性鉴定常用的方法主要有电导率法、组织褐变法和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑还原法[26]。但这些生化指标测定不仅操作繁琐，还会损害植物，所以不适合作为植物抗寒性的快速鉴定方法进行推广。叶绿素荧光技术由于其操作简单，在植物抗冷性、抗冻性方面的研究逐渐增多。这一技术已在杏树(Prunus armeniaca)幼苗[27]和冬小麦(Triticum aestivum)[28]等植物抗寒性检测中得到应用。同样抗氧化酶活性和渗透调节物质含量可以在短时间内反映胁迫强度, 高灿红等[29]对玉米(Zea mays)的研究也证实了这一观点。因此，本文以在南方5省(海南、广西、广东、福建和江西)广泛种植的豆科牧草紫花大翼豆(Macroptilium atropurpureum)[30]为对照，通过测定旋扭山绿豆在低温胁迫下叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性和渗透调节物质的变化，探讨旋扭山绿豆抗寒的生理机制，试图寻找旋扭山绿豆耐寒性快速鉴定的生理指标，并为今后深入开展其耐低温的育种工作和进一步向北推广应用提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料和处理旋扭山绿豆种子来自广东省华南牧草工程技术研究中心，紫花大翼豆种子来自海南省热带作物研究所。经萌发培养幼苗至15~20 cm，选取生长健壮、长势一致的实生苗，移栽到塑料培养盆中(直径8 cm，高10 cm)，每盆1株。基质采用营养土/沙土(体积比1:1)的混合物。定植1周后，置于光照培养箱内(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)培养, 光照周期12 h (7:00-19:00)，黑暗周期12 h (19:00-7:00)，光照强度275 μmol m-2s-1，培养温度25℃, 相对湿度65%。预培养72 h后取出部分植物置于另一培养箱进行低温(4℃)处理，培养条件相同。每处理12盆重复，共计48盆。
1.2 方法叶绿素荧光参数的测定 在培养前及处理后每隔2 d测定叶片的叶绿素荧光参数(脉冲调制荧光仪PAM-2100, Walz, Effeltrich, Germany)。选取各处理植株上层同一叶位的叶片进行测定，每处理4株。测定前叶片经过30 min的充分暗适应，测定初始荧光Fo和最大荧光Fm，光化光强度为400~ 450 µmol m-2s-1。最大光化学效率Fv/Fm、实际光能转化效率(Yield)和光合电子传递效率(ETR)根据Gray和Schreiber的公式进行计算[31-32]。第12天(当2种植物在低温下Yield和ETR下降至同一水平时)后停止测定，共测得0、2、4、6、8、10、12 d的叶绿素荧光参数。
抗氧酶活性的测定 在低温处理第8天(当Yield和ETR下降幅度开始缩小时)采集植株顶端第3叶位的叶片，称取0.1 g叶片，加入1.0 mL酶提取缓冲液，研磨成浆。在4℃下24 148.8×g离心20 min, 取50 mL酶液，用50 mmol L-1 PBS (pH 7.8)定容至1 mL后置于冰上，用于测定抗氧化酶活性。采用氮基四唑(NBT)法测定SOD活性[33]，过氧化氢法测定CAT活性[34]，愈创木酚法测定POD活性[35]。每处理4个重复。
渗透调节物质含量的测定 低温处理第8天采集植株顶端第3叶位的叶片，称取叶片0.2 g，采用磺基水扬酸法[35]测定游离脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸法[36]测定可溶性糖含量。每处理4个重复。
生物量的测定 低温处理结束(12 d)后，对未采集叶片的4株(4个重复)进行收获。收获根系时小心敲碎土壤，以减少对根系的破坏。将地上部分和地下部分分别装入不同的信封中，置于75℃烘箱烘干，分别称地上部分与地下部分的干质量。地上部分与地下部分的干质量之和即为总生物量。
抵抗力指数(resistance index, RS) 采用RS(tx)=1-2|Dx|/(Cx+|Dx|)计算，其中，Cx表示受到低温胁迫x天后对照组的值，Dx表示处理组与对照组的差值[37]。
1.3 数据的统计分析实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析。对叶绿素荧光参数(Fv/Fm、Yield和ETR)、抗氧化酶(SOD、CAT和POD)和渗透调节物质(游离脯氨酸和可溶性糖)进行方差分析，采用Duncan法进行多重比较(P < 0.05)；对抵抗力指数进行t检验(P < 0.05)；对低温下的叶绿素荧光参数等8个生理指标分别与总生物量进行一元线性回归分析，探讨他们之间的相关关系。采用Origin 8.5软件进行绘图。
2 结果和分析 2.1 植物生物量的变化低温(4℃)持续胁迫12 d后与室温(25℃)处理相比，旋扭山绿豆和紫花大翼豆的地上部分生物量、地下部分生物量和总生物量均显著下降(图 1)，旋扭山绿豆分别降低了25%、23%和23%，而紫花大翼豆则降低了33%、39%和38%，表明2种牧草植物的耐低温能力都有限，但显然旋扭山绿豆受低温的影响较小，生物量下降较小是其耐低温的综合体现。
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图 1 旋扭山绿豆在低温(4℃)下生物量的变化。n=4;柱上不同字母表示差异显著(P < 0.05)。图 3, 4同。 Fig. 1 Change in biomass of Desmodium intortum under low temperature (4℃). n=4; Different letter upon column indicate significant difference at 0.05 level. The same is Figures 3, 4. |
由图 2可以看出，低温(4℃)持续胁迫12 d后, 旋扭山绿豆和紫花大翼豆的最大光化学效率(Fv/Fm)随胁迫时间的延长而下降，且均达差异显著性水平(P < 0.05)，说明低温处理后二者的光系统Ⅱ (PSⅡ)功能受损。旋扭山绿豆的Yield和ETR在低温处理前8 d下降的幅度均显著低于紫花大翼豆，旋扭山绿豆的Yield在低温处理的第2、4、6、8天分别下降了12%、9%、25%和51% [平均下降(24.25±9.56)%], 而紫花大翼豆分别下降了38%、56%、57%和69% [平均下降(55.00±6.39)%]。旋扭山绿豆的ETR在低温处理的第2、4、6、8天分别下降18%、15%、25%和49% [平均降幅(26.75±7.71)%]，而紫花大翼豆分别下降39%、54%、56%和66% [平均降幅(53.75± 5.57)%]。在低温处理10~12 d二者的下降幅度趋于相同，说明紫花大翼豆对低温胁迫更为敏感。
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图 2 旋扭山绿豆在低温(4℃)下叶绿素荧光参数的变化。n=4。 Fig. 2 Changes in chlorophyll fluorescence parameters of Desmodium intortum under low temperature (4℃). n=4. |
从图 3可见，旋扭山绿豆的SOD活性显著高于紫花大翼豆，但低温处理后两者的SOD活性增加幅度相差不大，分别增加了8.88%和8.05%。而低温胁迫下，2种牧草的CAT活性均显著降低，分别降低了49.71%和73.42%，紫花大翼豆的下降幅度更大。低温处理下旋扭山绿豆的POD活性变化不明显，但紫花大翼豆的显著下降，下降了47.11%。
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图 3 旋扭山绿豆在低温(4℃)下的抗氧化酶活性。n=4。 Fig. 3 Changes in antioxidase activities of Desmodium intortum under low temperature (4℃). n=4. |
游离脯氨酸和可溶性糖是植物细胞内重要的渗透调节物质。从图 4可见，低温显著提高了2种牧草叶片中游离脯氨酸和可溶性糖含量，但旋扭山绿豆的增加幅度更大，分别提高了5.24和1.41倍, 而紫花大翼豆分别提高了3.20和0.77倍。
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图 4 旋扭山绿豆在低温(4℃)下渗透调节物质含量的变化。n=4。 Fig. 4 Change in content of osmotic regulators in Desmodium intortum under low temperature (4℃). n=4. |
一元线性回归分析表明，除Fv/Fm外，其他生理指标(Yield、ETR、SOD、CAT、POD、游离脯氨酸和可溶性糖)均与总生物量呈极显著正相关(R2 > 0.73, P < 0.01或P < 0.001)，且Yield、ETR、SOD和游离脯氨酸与总生物量的相关性最强(R > 0.91, P < 0.01) (表 1)。
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表 1 低温下2种牧草生理指标与总生物量的线性回归分析 Table 1 Linear regression analysis between total biomass and physiological indexes of two forages under low temperature (4℃) |
低温处理后，旋扭山绿豆的Fv/Fm、SOD和POD的抵抗力指数均与紫花大翼豆的差异不显著，但总生物量、Yield、ETR、CAT、Pro和可溶性糖含量的抵抗力指数均极显著高于紫花大翼豆(表 2)。
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表 2 旋扭山绿豆和紫花大翼豆对低温胁迫的抵抗力指数 Table 2 Resistance indexes in Desmodium intortum and Macroptilium atropurpureum under low temperature stress |
经查阅文献，旋扭山绿豆[17]的粗蛋白(20.47%)、粗脂肪(5.89%)、无氮浸出物(43.98%)和粗灰分(9.33%)都高于紫花大翼豆(分别为17.7%、4.9%、32.3%和7.8%)[38]，而粗纤维含量(20.33%)则大幅度低于紫花大翼豆(37.3%)，且旋钮山绿豆的所有营养指标都更接近于优良饲草标准指数[39]。
3 讨论和结论 3.1 低温胁迫对叶绿素荧光参数的影响低温使植物利用光能的能力降低，而这种变化可通过测定叶绿素荧光简便快速地反映出来。Fv/Fm是植物在暗适应状态下的PSⅡ最大光化学量子产量，反映了PSⅡ反应中心内禀光能转换效率，即PSⅡ最大的光能转换效率[40]。Yield表示植物光合作用的实际光化学量子效率，能够反映植物的PSⅡ反应中心在部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率[41]。ETR反映了植物叶片的表观光合电子传递速率，与植物的净光合速率呈正相关[42]。本研究表明，低温胁迫下，旋扭山绿豆的Fv/Fm、Yield、ETR均随低温胁迫时间的延长而显著下降，表明低温胁迫导致PSⅡ反应中心受损，旋扭山绿豆利用光能的能力降低，叶片PSⅡ的受伤害程度随处理时间的延长而加剧，进一步影响了光能转化为电势能, 使叶绿体光合链上电子传递速率受到抑制，ETR和Yield变小，这与廖德宝等[43]对广西帽儿山的常绿和落叶阔叶林的研究结果一致。吴雪霞等[42]对茄子(Solanum melongena)幼苗的研究也表明，低温胁迫导致Fv/Fm下降，且下降趋势随着胁迫时间的延长而加剧；孙蓓育等[44]对南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata)和蟛蜞菊(W. chinensis)的研究也表明低温胁迫导致Fv/Fm、Yield、ETR显著下降。本研究中，低温处理使旋扭山绿豆的Yield和ETR下降幅度显著低于紫花大翼豆，显示旋扭山绿豆受低温影响较小。
3.2 低温胁迫对叶片抗氧化酶活性的影响在正常环境下，植物的活性氧代谢及其清除系统维持着一定的平衡状态[45]。而低温逆境导致植物体内活性氧代谢平衡被破坏而产生大量自由基，叶绿体和线粒体产生的主要活性氧有超氧阴离子(
低温逆境一方面会降低植物对水分的吸收, 造成植物细胞水分亏缺，另一方面会主动积累亲水性渗透物质，从而维持细胞渗透平衡以适应胁迫生境[10]。Pro和可溶性糖被认为是植物体内主要的渗透调节保护物质。已有的研究表明低温胁迫可诱发植物体内脯氨酸和可溶性糖大幅度升高来提高自身对逆境的适应性[11-13]，Pro与可溶性糖的积累与植物的抗寒性呈显著正相关[13, 49-51]。张尚雄等[52]对3种披碱草属牧草抗寒性的研究也表明，Pro和可溶性糖含量随低温胁迫程度的加剧而逐渐增加。本研究中，旋扭山绿豆的Pro和可溶性糖含量在低温处理后显著增加，说明他们在应对低温胁迫造成的伤害时，起到了平衡细胞代谢、提高植物保水能力的重要作用，从而增强了自身的抗寒性。而且, 低温下旋扭山绿豆叶片中的Pro和可溶性糖含量分别提高5.24和1.41倍，分别约为紫花大翼豆增幅的1.64和1.83倍。因此从渗透调节物质来看, 旋扭山绿豆的抗寒性更强。
3.4 回归分析与抵抗力指数分析回归分析显示，低温下2种牧草的叶绿素荧光参数(Yield和ETR)、抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)和渗透调节物质(Pro和可溶性糖含量)与总生物量呈极显著正相关，表明他们可用于指示植物的耐寒性。抵抗力指数的变化范围是-1~+1，值越大表明抵抗力越强，能够抵抗外界胁迫的能力越强, +1表示胁迫对植物完全没有影响(抵抗力最大)[37]。在低温处理下，旋扭山绿豆的Fv/Fm、SOD及POD的抵抗力指数与紫花大翼豆没有显著差异，说明Fv/Fm、SOD和POD不能较好地区分旋扭山绿豆和紫花大翼豆对低温胁迫的抵抗力。但旋扭山绿豆的Yield、ETR、CAT、Pro和可溶性糖的抵抗力指数显著高于紫花大翼豆，说明旋扭山绿豆主要是通过调节Yield、ETR、CAT活性和渗透调节物质含量来适应低温胁迫，这与回归分析的结果基本一致。然而生态稳定性是由抵抗力和恢复力2个部分组成的[53]，本文仅研究了旋扭山绿豆的抵抗力指数，未验证其恢复力指数，这是本文的不足之处，尚需进一步研究。
不同种的生物学特性(生长、某些抗氧化酶及渗透调节物质等)差异很重要，正是因为这些差异决定了它们应对低温胁迫的能力。同时本研究是在低温控制条件下的短期试验，生长条件与野外环境存在一定的差距，因此需要进一步的野外试验验证才能保证在实际应用中的科学性。
3.5 两种牧草的营养成分比较牧草营养成分的种类和数量直接关系到牲畜的产量与质量，是评价牧草品质优劣的重要依据, 尤其是有效营养成分(粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和无氮浸出物)[54]。牧草中的粗蛋白是草食牲畜体蛋白的主要来源，而粗脂肪和无氮浸出物是家畜能量的主要来源，同样牧草中适量的粗纤维含量有利于家畜对食物的消化[54]，另一方面粗灰分含量及其元素组成也很重要[55]。一般认为，粗蛋白、粗脂肪、无氮浸出物和灰分的含量越高，则营养价值越高; 而粗纤维含量越低的牧草，其饲用价值越高[55]。旋扭山绿豆的粗蛋白、粗脂肪、无氮浸出物和灰分的含量都较紫花大翼豆高，且粗纤维只有紫花大翼豆的55%，有研究表明旋扭山绿豆的必需氨基酸齐全，胡萝卜素和抗坏血酸含量较高和动物所需要的主要微量元素，尤其是铁、锰、锌含量较高[18]，因此综合来说，旋扭山绿豆的营养价值高于紫花大翼豆。
综上所述，引进品种旋扭山绿豆是一种抗寒性与营养价值均优于紫花大翼豆的优良牧草品种。因而在南方各省推广旋扭山绿豆具有良好的应用前景。同时，叶绿素荧光参数(Yield和ETR)、CAT与渗透调节物质(Pro和可溶性糖)可以快速、准确地反映植物冷害，建议将其作为旋扭山绿豆耐寒性鉴定的重要生理指标。
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