2. 海南省农业科学院农业环境与土壤研究所, 海口 571100
2. Institute of Agricultural Environment and Soil, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571100, China
油茶主要是指山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物中油脂含量较高且具有栽培经济价值的一类植物的总称,是我国重要的木本食用油料树种。油茶在海南俗称“山柚”。海南岛为中国油茶资源分布的最南缘,各地均有野生种和栽培种,具有种植和利用油茶的悠久历史[1]。海南岛气候独特,海峡隔离,油茶又是异花授粉植物,在环境和遗传控制的双重作用下,海南岛油茶资源表型变异极为丰富且独特[2-4]。据海南省林业局统计,2015年底,全省油茶种植面积达到4 100 hm2,主要分布在琼海、屯昌、澄迈、五指山、琼中、定安、海口等市县,2015年茶籽产量486.3 t,山柚油产量超过80 t,约占全国产量的0.1%。至2018年底,海南省已认定油茶优良品种20个,但尚未建立规范的良种采穗圃。海南岛具有丰富而独特的油茶资源、良好的水热条件和产业发展势头,近年来海南岛油茶资源的研究与开发利用受到普遍关注,急需对海南岛油茶资源开展科学系统评价。
植物种质资源鉴定与评价是资源有效保护与创新利用的前提。分子标记技术不受季节和环境的限制,稳定性高,并且分子标记数量极多,遍及整个基因组,多态性高,是植物资源鉴定与评价的重要手段。其中,RAPD、ISSR和AFLP标记技术已成功应用于油茶资源的遗传多样性评价[5-7]、品种鉴定与分类[8-10]、以及抗病性、果油率和产油量与分子标记的相关性[11],为油茶育种亲本的选配和品种鉴定提供科学理论依据。相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)技术是利用特定引物对ORFs区域(open reading frames)进行扩增,具有易于操作、花费少、多态性强及标记分布均匀等特点[12],已广泛应用于植物遗传多样性研究[13-14]。前人[15-17]应用SRAP标记技术分别对四川省名邛台地油茶资源、全国19个居群的小果油茶资源和广东省广宁红花油茶种质资源进行了遗传多样性评价。
本课题组前期研究表明,海南油茶资源具有丰富的表型多样性,这是否是其丰富遗传多样性的体现?群体间的遗传结构和亲缘关系是怎样的模式?在悠久的引种与栽培过程中基因流是否通畅?本研究利用SRAP分子标记技术,对海南岛主要油茶分布区的代表性种质资源进行遗传多样性分析,探讨其遗传分化和亲缘关系,为海南油茶分子标记辅助育种,充分挖掘海南油茶优良种质资源和研究其引种栽培历史提供科学依据。
1 材料和方法 1.1 材料试验材料来自海南省海口、定安、文昌、琼海、澄迈、屯昌、琼中、五指山和临高等9个市县27个乡镇(国营农场)的31个油茶居群,基本涵盖了海南省的主要油茶分布区。居群信息见表 1。
总DNA的提取 采用彭邵锋[8]的改良CTAB法。
SRAP-PCR扩增 反应在IcyclerTM Thermal Cycler型PCR仪上进行。SRAP-PCR反应条件和反应程序按郑道君等[13]的方法,引物由上海英骏生物技术有限公司合成,每个引物对供试材料重复扩增2次。取10 μL扩增产物,采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测SRAP-PCR的产物,GoodView核酸染色, 在Gel Doc XR型凝胶成像分析系统下照相并记录。以3S 100 bp DNA ladder作为对照分子量标准。
1.3 数据的统计分析根据marker确定PCR条带分子量,选择清晰的扩增谱带用0-1二元矩阵表示,然后统计分析多态性条带百分率(PPB)=多态位点数/位点总数。将0-1矩阵在NTSYSpc (2.1版)软件中处理, 应用SIMQUAL法计算Jaccard遗传相似性系数(genetic similarity, GS),GSij=2Nij/(Ni+Nj),式中, Nij指两个个体共有的带数,Ni+Nj指两个个体所有带数之和。采用SAHN程序和UPGMA (unweighted pair group mean average)方法进行聚类分析,通过Tree plot模块构建聚类图。应用POPGENE 1.31软件在假定种群处于Hardy-Weinberg平衡状态下进行遗传参数分析, 分别计算观测等位基因数(observed number of alleles, Na)、有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)、Nei’s基因多样性指数(Nei’s gene diversity, H)、Shannon’s信息指数(Shannon’s information index, I),并对不同居群间的遗传分化系数(Gst)和基因流进行分析。为了明确这些多样性指数在各居群间的变异程度,对所有居群的各参数进行变异系数(CV, %)分析。
2 结果和分析 2.1 SRAP-PCR扩增多态性选取油茶来源地域及形态不同的5份种质材料,对经退火温度初选的100对SRAP引物进行筛选,共选出9对有效引物,然后分别对31个居群材料进行SRAP-PCR扩增,共扩增出122条清晰的谱带,每对引物平均扩增13.56条,其中多态性条带120条,扩增的多态性条带百分率(PPB)高达98.30% (表 2),多数条带为200~2 500 bp。每对引物对不同材料扩增的SRAP-PCR产物有一定差异, 反映出不同地域与不同居群的种质材料之间存在遗传多样性以及不同程度的亲缘关系。
根据SRAP-PCR谱带统计结果,利用PopGene软件分析31个居群的遗传多样性(表 3)。在物种水平上,PPB为98.30%,Na为1.975 4,Ne为1.352 8,H为0.222 8,I为0.353 8,可见海南岛油茶资源具有较高的遗传多样性水平。但是,在居群水平上的遗传变异却比较低,PPB为13.93%~59.84%,平均40.96%;Na为1.139 3~1.598 4,平均1.409;Ne为1.083 4~1.357 9,平均1.237;I为0.14 8~0.307 7, 平均0.208 3;H为0.107 7~0.193 5,平均0.138 5。31个居群间的遗传多样性差异较明显,H、I和PPB的变异系数(CV)分别为23.82%、23.67%和24.26%, 其中sjgx居群的遗传多样性水平最低,zxlw居群的遗传多样性水平最高。
对31个居群进行基因分化分析,计算不同居群间的遗传分化系数(Gst),结果表明,居群总的遗传多样性(Ht)为0.223 6±0.028 2,居群内的基因多样性(Hs)为0.138 5±0.010 3,基因流(Nm)仅为0.813 9 < 1,表明海南岛油茶遗传多样性水平较低,Gst为0.380 5, 可见居群间具有较大的遗传分化,同时也表明有38.05%的遗传变异存在居群间,而61.95%的遗传变异存在于居群内,其遗传变异以居群内变异为主。
2.4 聚类分析根据SRAP扩增条带分析结果,采用UPGMA法对31个不同居群进行聚类分析(图 1)。不同居群间的遗传距离为0.022 6~0.276 4,平均遗传距离为0.107 7。其中lkfh与lkly遗传关系最近,遗传距离仅0.022 6,均来自定安岭口镇;sjgx与tnlf虽然地理距离不远,但遗传距离却最远,为0.276 4。在遗传距离为0.11处,可将31个居群明显聚为6类, 其中类群A由来自琼海的所有居群sbwl、yjmp、hszj、lj、zyxc和海口的部分居群jzcc、ssjx、yxrz、sjqm组成;B类群包括澄迈的所有居群sfbl、wral、zxlw、jllm,临高的所有居群htww、hsct、nbgj和定安的所有居群lkfh和lkly;C类群由琼中的所有居群wlby、czxz、nknl,屯昌的hlsy,以及五指山的cthw和csfs组成;D类群仅由文昌的2个居群jslj和tnlf组成;E类包括五指山的smxc和海口的jzbs; F类是海口的sjgx和hq。除了来自海口的居群和五指山居群不能各自聚为一类外,其他市县来源的居群均按行政区域聚为一类,表现出明显的区域性。
遗传多样性是物种长期生存和保持进化的基础,同时也植物良种培育的遗传物质基础。PPB、H、I作为评价种群内和种群间遗传多样性的指标, 其数值越大,表明种群的遗传多样性越高[18]。SRAP、RAPD和ISSR一样,均为显性标记,研究结果具有可比性。Nybom[19]统计认为植物的平均H为0.22 (基于RAPD和ISSR的平均值),其中37种多年生植物的H为0.25。比较而言,海南油茶资源物种水平上的H值(0.222 8)仅与上述物种的平均值相近,而居群水平的平均He仅为0.138 5 (0.048 6~0.207)。此外,黄勇等[16]利用SRAP分子标记对贵州、湖南、江西等8个小果油茶分布区19个居群进行遗传多样性分析,认为小果油茶具有丰富的遗传多样性, 19个居群的H、I、PPB分别为0.321 3~0.388 7、0.473 2~ 0.567 6和84.96%~95.58%;物种水平的H、I、PPB分别为0.422 3、0.612 6和100%。谢荟等[17]利用SRAP分子标记建立了广东省广宁红花油茶(C. semiserrata)种质资源4个种群的遗传多样性评价体系, 结果表明,种群的H、I、PPB分别为0.217 9~0.356 3、0.321 7~0.524 8和58.25%~92.72%,平均值分别为0.307 8、0.456 3和83.62%。张婷等[20]采用SRAP标记对湖北省油茶5个居群的遗传多样性进行了研究,结果表明,居群的平均Ne、H、I分别为1.516 1、0.274 8和0.389 9。因此,本研究中海南岛油茶资源表现出较低的遗传多样性水平,物种水平的H和I仅分别为0.222 8和0.353 8;居群的遗传变异较物种水平更低,H和I仅为0.048 6~0.207和0.073~ 0.288 3,这与海南油茶在表型方面丰富的多样性水平不一致。杨立荣等[21]对海南岛21个老油茶林果实和种子的10个数量性状指标进行了分析,结果表明海南油茶种实表型多样性十分丰富, 10个种实数量性状的变异系数(CV)为7.87%~52.93%,平均变异系数为29.36%,变异程度均高于小果油茶(C. meiocarpa)、浙江红花油茶(C. chekiangoleosa)、滇西腾冲红花油茶(C. reticulata)、广东省的广宁红花油茶和越南油茶(C. vietnamensis);平均Shannon-Wiener多样性指数为2.749 9,接近或大于小果油茶(主要分布于7个省份)。可见,海南油茶低水平的遗传变异不能解析丰富的表型变异。
油茶组是山茶属中多倍体出现频率较高的类群,有2x、3x、4x、5x、6x、7x和8x,且核型分析存在多样性,其中奇数多倍体为栽培品种,包括油茶(C. oleifera)、小果油茶、越南油茶和攸县油茶(C. yubsienensis)均是多倍体[22-24],这些物种除小果油茶外其余物种均存在种内多倍性现象,如越南油茶核型2n=120=86m+26sm+8st+2sat[25], 或2n=105= 61m+37sm+7st+2sat,或2n=120=86m+26sm+8st+ 2sat[26];普通油茶核型为2n=30=24m+4sm+2st+ 2sat, 或2n=90=60m+29sm+1st+3sat,或2n=90= 60m+22sm+8s[27]。倍性变异会影响个体、花朵和果实大小等农艺性状[28]。海南油茶的核型多样性是否丰富?是否在海南岛油茶资源丰富的表型多样性过程中扮演重要角色?从本文中海南岛油茶资源较低水平的遗传多样性结果推测,核型的变异或许不能使海南岛油茶资源间的遗传背景或遗传多样性变得丰富。目前,本课题组正在进行海南油茶资源的核型多样性分析,并研究其与形态多样性和遗传多样性的相关性,对上述推测进行验证。
油茶在海南岛有悠久的栽培历史,现存的油茶居群均是人工栽种的半野生居群,海南岛油茶资源表现出物种水平高于居群水平的遗传多样性,表明半野生海南油茶居群种源来源比较复杂,而同一居群种源来源相对稳定。同时居群水平存在一定的遗传变异,究其原因是这些居群均是以实生苗建成, 油茶是较为严格的虫媒异花授粉植物,F1代实生苗分离的结果。
3.2 海南岛油茶群体遗传结构与亲缘关系油茶是较为严格的虫媒异花授粉植物。Nybom[19]对31种杂交植物进行统计,平均Gst为0.22;张德全等[29]的统计表明,虫媒植物的平均Gst为0.264。本研究中Gst为0.380 5,高于上述平均值,也比我国小果油茶遗传分化值要高(Gst=0.134 3)[16],可见海南岛油茶居群间具有较大的遗传分化。此外,在整体水平上居群间的基因流为0.813 9,说明海南岛油茶资源不同居群间存在较小的基因交流。遗传分化系数显示,海南油茶总的遗传变异中有38.05%的变异存在于居群间,有61.95%的遗传变异存在于居群内;在小果油茶总的遗传变异中,居群内占86.58%,而居群间仅占13.42%[16];Kaundun[30]利用RAPD-PCR标记对韩国、日本和台湾27个优良茶树品种的多样性进行了研究,显示71%的变异位于组内,29%位于组间。本研究结论与其一致,其遗传变异均以居群内变异为主。海南油茶资源31个居群间的遗传距离为0.022 6~0.276 4,平均为0.107 7, 显示较近的亲缘关系,仅略高于广布于我国南方的小果油茶(19个居群的遗传距离为0.021 6~0.164 5,平均为0.098 8)[16]。聚类分析表明,在遗传距离为0.11处,可将31个海南油茶居群聚为6类,聚类结果与行政区域有一定的相关性,但与各居群的地理距离不相关,除了来自海口的居群和五指山居群不能各自聚为一类外,其他市县来源的居群均按行政区域聚为一类,表现出明显的行政区域性。这与刘扬[31]应用ISSR标记对来自海南、广西、江西的55份油茶资源进行多态性和聚类分析的结果基本一致,也同小果油茶的聚类结果相一致[16]。可见, 海南岛油茶亲缘关系较近,且表现出较强的行政区域性。我们推测,海南油茶资源居群的聚类关系可能与海南油茶悠久的引种栽培历史, 以及计划经济体制下各行政区域的油茶推广方式密切相关。
油茶为异花授粉植物,自交或近交不亲和,结实率极低[32]。我们的调查表明,现有海南岛油茶林分个体的开花率高,可达100%,花量也极大,但结果个体仅为20%左右,甚至更低,以致产量极低,这种现象在近5~10年栽植的油茶林分中也表现得更为突出[33],极大地影响了农民种植油茶的信心和积极性。本研究表明海南岛油茶资源亲缘关系近, 依据油茶自交不结实或结实率低的特性,因此,我们认为海南岛油茶资源亲缘关系近可能造成自交或近交不亲和,是致使海南油茶林分花量大而结实低的主要内在原因之一。本课题组下一步将从小气候对花粉活性和传粉者行为的影响、土壤养分供给对结实的影响,以及林分个体间的遗传亲缘关系等方面进行分析和论证。
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