土壤的盐渍化已经成为全球性的生态问题，影响农作物生长发育和产量的重要制约因素，因此, 研究盐生植物的耐盐机制对防治土壤盐渍化具有重要意义。中国沿海面积广阔，部分地区由于自然和人为因素造成了土壤盐渍化，其中，福建省地处沿海的土壤也受到不同程度的破坏。而园林植物生长缓慢，种类较少，资源贫乏^[1]，土壤修复慢，因此需要一些耐盐速生植物来维持生态环境的可持续发展。近来，福建地区已成功引进种植冰菜，并受到消费者的青睐。

冰菜(Mesembryanthemum crystallinum)，即冰叶日中花，为番杏科(Aizoaceae)日中花属植物，原产非洲南部和东部。冰菜在20.0%~40.0%海水浓度及低于400 mmolL^-1 NaCl下均具有极强的耐盐性^[2-3]。冰菜含丰富的营养物质，每100.0 g冰菜含有31.0 μg叶酸、77.0 μg视黄醇、926.0 μg β-胡萝卜素、0.7 g蛋白质^[4]。所以，冰菜作为一种具有较高生态功能和保健功能的蔬菜，值得深入研究和广泛推广种植。当前，国内外对冰菜的相关研究主要集中在栽培技术、抗盐生理生态上^[5-7]，而对其细胞和分子水平的研究还亟待发展完善。

基于测序技术的进步，近年来植物响应非生物胁迫，尤其是盐胁迫的转录组研究成果层出不穷^[8-11]。目前，转录组分析是揭示植物耐盐分子机制的主流方法，可以全面、系统地反映植物的耐盐分子机制^[12]。分析盐生植物在盐胁迫下的转录组是研究植物耐盐分子机制和鉴定耐盐相关基因的重要策略之一^[13-14]。冰菜的分子遗传学和功能基因组学研究不深，冰菜在盐胁迫下的分子调控机制仍不清楚，关联转录组学是一种鉴定调控目标性状候选基因的新方法。本研究采用Illumina Hiseq 2500高通量测序技术，从分子层面研究和解析盐胁迫处理后冰菜叶片基因的表达变化，以寻找冰菜叶片中耐盐关键基因，为冰菜耐盐基因组学和分子生物学研究提供参考。

冰菜(Mesembryanthemum crystallinum)种子来自于福建省农业科学院亚热带农业研究所。种子经3% H₂O₂消毒3 min，流水冲洗数次，将种子放置在干净的基质中，置于培养箱中培养至三叶一心，选择生长一致的幼苗种植于花盆中，每盆3株，胁迫组(S)和对照组(Control)各3盆。每2 d浇1/2Hoagland营养液1次，置于人工气候室中，进行为期2周的预培养。此后，为避免盐冲击，每2 d递增浇含50 mmol L^-1 NaCl的1/2Hoagland营养液，直到400 mmolL^-1，对照仅浇1/2Hoagland营养液，以后仍然每2 d浇1/2Hoagland营养液1次，再培养植物35 d^[15]，冰菜可采食时，剪下植株相同部位的叶片(尽量去除中上部较新鲜嫩绿的叶片)，每处理3个重复，每个处理的所有叶片混合后置于冷冻管中，液氮速冻，存于-80℃超低温冰箱备用。

用PureLink Plant RNAReagent Kit试剂盒提取冰菜叶片的总RNA，用分光光度计测定A₂₆₀和A₂₈₀值，计算样品浓度，然后用15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测质量合格后送北京百迈客生物技术有限公司进行转录组测序，并得到转录组数据。运用生物信息学技术和方法，对测序数据进行前期处理、序列比对、基因及基因组的注释、基因表达分析等。

对照和胁迫处理冰菜叶片经高通量测序和质量控制，共获得13.01 Gb有效数据(Clean data)，其中对照为6.62 Gb，胁迫处理的为6.39 Gb，其Q30碱基均大于90.80%，表明测序结果可靠，可用于后续的分析。从表 1可见，总共产生69 734条单基因序列(Unigene)和131 228条转录本序列(Transcipt), N50分别为2 323和2 058 bp，组装完整性较高; 其中长度为200~300 bp的Unigene数量最多，有22 060条，占31.63%，且随着长度的增加，Unigene数量减少。

表 1(Table 1)

表 1 组装结果统计 Table 1 Statistics of assembled results 长度 Length (bp) 转录本序列数量 Transcript number 单基因序列数量 Unigene Number 200~300 25 759 22 060 300~500 25 093 19 497 500~1 000 24 777 13 427 1 000~2 000 28 855 8 721 ≥2000 26 744 6 029 总数Total 131 228 69 734 总长度Total length 158 144 854 52 698 219 N50 2 058 1 323 平均Mean 1 205.12 755.70

表 1 组装结果统计 Table 1 Statistics of assembled results

为获得Unigene的功能注释信息，通过NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、NOG、GO和Pfam等8个数据库进行注释分析(表 2)，在69 734条Unigene中，共获得26 360条(37.80%)注释，以上8个数据库分别获得26 079 (37.39%)、16 708 (23.95%)、9 624 (13.80%)、8 029 (11.51%)、14 431 (20.69%)、24 156 (34.64%)、15 700 (22.51%)和17 910条(25.68%)注释。

表 2(Table 2)

表 2 单基因序列的功能注释 Table 2 Function annotated of Unigenes 数据库 Database 注释单基因数 Unigene annotated 300~1 000 bp > 1 000 % NR 26 079 9 035 12 490 37.39 SwissProt 16 708 5 430 8 874 23.95 KEGG 9 624 3 102 4 837 13.80 COG 8 029 2 135 4 891 11.51 KOG 14 431 4 507 7 675 20.69 NOG 24 156 8 001 12 220 34.64 GO 15 700 5 321 7 494 22.51 Pfam 17 910 5 203 10 756 25.68 总数Total 26 360 9 168 12 523 37.80

表 2 单基因序列的功能注释 Table 2 Function annotated of Unigenes

通过对照和胁迫处理冰菜叶片差异基因的表达分析，共获得123个差异表达基因(differential expression genes, DEGs)，包括73个上调基因，50个下调基因；将DEGs单基因序列分别在8个数据库中进行注释，共获得96条基因功能注释，COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和NR分别注释19、43、23、37、76、67、86和92条，以NR数据库注释比率最高，达95.83%。

差异表达基因的GO功能注释  GO功能注释的43条DEGs共分为3大类，分别为生物过程、细胞组分和分子功能，又划分为27个功能小类(表 3)，生物过程的DEGs以代谢过程、细胞过程和单一生物过程3个功能小类的数量最多；细胞组分的DEGs以细胞、细胞成分、细胞器和膜结构4个功能小类的数量最多；分子功能的DEGs以催化活性和结合活性2个功能小类的数量最多。

表 3(Table 3)

表 3 差异表达基因GO功能注释 Table 3 GO annotation of differential expression genes (DEGs) GO功能GO function 数量Number 生物过程 Biological process 代谢过程Metabolic process 23 细胞过程Cellular process 18 单一生物过程Single-organism process 16 刺激应答Response to stimulus 10 生物调节Biological regulation 9 定位Localization 3 细胞成分或生物合成Cellular component organization or biogenesis 2 发育过程Developmental process 2 多细胞生物过程Multicellular organismal process 2 信号传导Signaling 1 繁殖过程Reproductive process 1 多生物过程Multi-organism process 2 免疫系统过程Immune system process 1 细胞组分 Cellular component 细胞Cell 12 细胞成分Cell element 12 细胞器Organelle 8 膜结构Membrane structure 8 细胞器成分Organelle element 2 膜结构部分Membrane structure element 2 复杂大分子Complex macromolecular 1 胞外区Extracellular region 2 膜封闭腔Membrane-enclosed lumen 1 分子功能 Molecular function 催化活性Catalytic activity 29 结合活性Binding 21 转运活性Transporter activity 2 核酸结合转录因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity 2 电子载体活性Electron carrier activity 3

表 3 差异表达基因GO功能注释 Table 3 GO annotation of differential expression genes (DEGs)

差异表达基因的COG功能注释   COG数据库注释的19条DEGs进行直系同源分类，并获得11个功能分类(表 4)，主要集中在E (氨基酸的转运和代谢)、G (碳水化合物转运与代谢)、Q (次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢)和R (一般性功能预测)。植物生长发育过程有大量基因表达，在盐胁迫下，部分涉及到了氨基酸、碳水化合物的转运和代谢，以及次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢等过程，说明这些生物学过程对于冰菜生命活动特别是耐盐性的重要性。

表 4(Table 4)

表 4 差异表达基因COG功能注释 Table 4 DEGs COG annotation 编号No. 功能注释Function annotation 单基因序列数量Number of Unigene C 能源的产生和转化Energy production and conversion 1 E 氨基酸转运与代谢Amino acid transport and metabolism 3 G 碳水化合物转运与代谢Carbohydrate transport and metabolism 3 I 脂质转运与代谢Lipid transport and metabolism 1 J 翻译、核糖体结构和生物合成Translation, ribosomal structure and biogenesis 1 M 细胞壁/细胞膜的生物发生Cell wall/membrane/envelope biogenesis 1 O 次生代谢产物的合成、转运和代谢Posttranslational modification, protein turnover, chaperones 1 P 无机离子转运与代谢Inorganic ion transport and metabolism 1 Q 次生代谢产物的合成、转运和代谢Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism 3 R 一般功能预测General function prediction 3 V 防御机制Defense mechanism 1

表 4 差异表达基因COG功能注释 Table 4 DEGs COG annotation

差异表达基因的KEGG功能注释  有23个DEGs得到注释(表 5)，分别富集在10条代谢通路，包括植物激素信号转导(4个)、类胡萝卜素生物合成(2个)、半乳糖代谢(1个)、酪氨酸代谢(1个)、玉米素生物合成(1个)、异喹啉生物碱生物合成(1个)、氧化磷酸化(1个)、α-亚麻酸代谢(1个)、淀粉和蔗糖代谢(1个)和角质、次分泌和蜡生物合成(1个)。这说明盐胁迫下冰菜叶片的各种代谢途径都发生了变化。

表 5(Table 5)

表 5 差异表达基因的KEGG功能注释 Table 5 Differential expression genes KEGG function annotation 编号No. 注释Annotation 单基因序列数量Number of Unigene 基因总数Total of Unigene ko00906 类胡萝卜素生物合成Carotenoid biosynthesis 2 36 ko04075 植物激素信号转导Plant hormone signal transduction 4 265 ko00052 半乳糖代谢Galactose metabolism 1 81 ko00350 酪氨酸代谢Tyrosine metabolism 1 62 ko00908 玉米素生物合成Zeatin biosynthesis 1 26 ko00950 异喹啉生物碱生物合成Isoquinoline alkaloid biosynthesis 1 33 ko00190 氧化磷酸化Oxidative phosphorylation 1 230 ko00592 α-亚麻酸代谢alpha-Linolenic acid metabolism 1 73 ko00500 淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism 1 235 ko00073 角质、次分泌和蜡生物合成Cutin, suberine and wax biosynthesis 1 34

表 5 差异表达基因的KEGG功能注释 Table 5 Differential expression genes KEGG function annotation

通过对盐胁迫下冰菜叶片转录组测序结果进行功能注释、功能分类及代谢途径分析表明(表 6)，生长素响应蛋白、细胞分裂素合酶、棉子糖合成酶和H⁺-ATPase基因的表达分别上调了351.4%、500.0%、877.9%和459.6%倍，吲哚-3-乙酰酸酰胺合成酶、脱落酸8′-羟基化酶、茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白和脱水蛋白基因的表达则分别下调了100.0%、80.7%、85.4%和100.0%。可见，这些差异表达基因参与了植物激素、糖等的代谢途径，影响着冰菜的生长发育。

表 6(Table 6)

表 6 盐胁迫下冰菜叶片差异基因的表达丰度 Table 6 Expression abundance of differential genes in Mesembryanthemum crystallinum leaves under salt stress ID 基因Gene 对照Control 胁迫Stress % c7333.graph_c0 生长素响应蛋白基因Auxin responsive protein gene 4.16 18.78 351.4 c9555.graph_c0 细胞分裂素合酶基因Cytokinin synthase gene 0.49 2.94 500.0 c26505.graph_c2 棉子糖合成酶基因Raffinose synthase gene 0.77 7.53 877.9 c22932.graph_c0 H+-ATPase基因H+-ATPase gene 0.47 2.63 459.6 c17335.graph_c0 吲哚-3-乙酰酸酰胺合成酶基因Indole-3-acetamide synthase gene 3.00 0.00 -100.0 c27100.graph_c2 脱落酸8′-羟基化酶基因Abscisic acid 8′-hydroxylase gene 8.02 1.55 -80.7 c24509.graph_c0 茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白基因Jasmonate ZIM structural domain protein gene 20.83 3.04 -85.4 c17958.graph_c0 脱水蛋白基因Dehydrin gene 2.67 0.00 -100.0

表 6 盐胁迫下冰菜叶片差异基因的表达丰度 Table 6 Expression abundance of differential genes in Mesembryanthemum crystallinum leaves under salt stress

虽然目前已经利用生理生化手段揭示和阐明了冰菜许多的耐盐机制，但从分子水平上冰菜仍有很多抗性策略和机制有待深入研究和分析。转录组主要指所有编码蛋白质的mRNA总和^[16]，能够从整体水平探索基因的结构和功能。冰菜为非模式生物，需要通过与同源物种的测序信息进行比对分析，从而研究各种特定的生物学过程和分子机理。在本研究中，利用Illumina HiSeq TM2500高通量测序技术构建了冰菜在400 mmolL^-1盐胁迫下的叶片转录组数据库，借助其他物种数据库已有信息，对表达差异的基因进行比对分析，表明盐胁迫后冰菜的植物激素代谢、糖代谢和其它相关功能蛋白基因的表达发生了改变。

植物激素几乎参与了所有的生命活动，其对盐胁迫的响应也不例外。植物中的激素没有明显的专一性，一种激素可以有多种生理效应，而多种激素又具有调节同一生理过程的作用^[17]。盐胁迫下，冰菜叶片中脱落酸8′-羟基化酶、吲哚-3-乙酰酸酰胺合成酶和茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白基因均下调表达，而生长素响应蛋白、细胞分裂素合酶基因上调表达，均有利于合成脱落酸(ABA)、生长素(AUXIN)、茉莉酸(JA)和细胞分裂素(CTK)，促进细胞分裂，加速细胞伸长生长，提高冰菜的盐胁迫耐受性。

盐胁迫下，植物通过细胞积累大量可溶性物质来提高渗透势，增强对渗透胁迫的抗性^[18]，在表达差异基因中，冰菜叶片中的棉子糖合成酶基因上调表达，有利于合成可溶性糖棉子糖，以提高细胞内的渗透势，从而提高冰菜的盐胁迫耐受性。

质膜H⁺-ATPase是细胞质膜上的一种重要功能蛋白，在植物的生命活动过程中起着重要作用。在转录水平上，质膜H⁺-ATPase参与了植物生长发育过程中的多种胁迫反应^[19]。盐胁迫对植物造成离子毒害、渗透胁迫和营养不平衡，使植物的生长发育受到抑制，这可能与盐胁迫下植物细胞的跨质膜物质转运发生改变有关。有研究表明，物质通过植物细胞的跨膜转运依赖于质膜H⁺-ATPase转运质子产生的驱动力^[20-21]。在盐胁迫下，冰菜叶片中的H⁺-ATPase基因上调表达，可以增强H⁺泵的质子动力势，驱动Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，提高Na⁺外排的能力，减少K⁺离子外流，维持了K⁺/Na⁺平衡，从而提高冰菜的盐胁迫耐受性。脱水蛋白是在干旱胁迫下产生的最具有代表性的逆境响应蛋白，脱水蛋白基因下调表达，反映了盐胁迫下冰菜叶片自身降低脱水的生理现象。

植物耐盐性是由一系列基因相互协调而共同发挥作用来表现的^[22]。冰菜经过400 mmolL^-1盐胁迫后，在一系列基因共同作用下进行自我调节，从而正常生长发育。从分子水平上，可更详细地研究其对应的耐盐基因，为后期筛选冰菜耐盐关键基因和功能验证提供重要的分子基础，同时为改善土壤盐渍化具有重要意义。