爵床科(Acanthaceae)为泛热带分布的大科，在我国主要分布于长江以南的各省份，以云南分布最多^[1-2]。本科植物种类繁多，《中国植物志》记载我国有68属300多种，形态多样，有乔木、灌木、草本和藤本等；分布范围广，森林、荒漠、郊野、甚至红树林均有分布，故一直被认为属于研究难度大的科^[1-3]。爵床科多种植物可供药用，其中不少为知名中药材，如板蓝(Baphicacanthus cusia)、穿心莲(Andrographis paniculata)、尖药花(Aechmanthera tomentosa)、枪刀药(Hypoestes purpurea)、九头狮子草(Peristrophe japonica)等；当中的穿心莲更是祛热解毒、消炎止痛之良药，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物^[4]。目前，以穿心莲为主要原料，已有多个广泛应用于临床的中成药，如穿心莲内酯片、炎琥宁、穿琥宁等^[5]。可见，爵床科植物具有明显药用价值，明星药材“穿心莲”更是被制作成多种中成药用于治疗多种疾病，且效果显著。据此，天然药物化学家们对爵床科植物的研究产生了巨大兴趣，并致力于该科植物的化学成分与生物活性研究。

山壳骨属(Pseuderanthemum)约有60~100种植物，分布于泛热带，亚洲约20种，其中我国暂有8种^[3]。目前，国内对山壳骨属植物的化学成分与生物活性研究尚属空白，因此对该属植物进行系统的化学成分及生物活性研究，发掘拥有潜在药理活性的品种，具有重要科学意义。山壳骨(P. latifolium)隶属山壳骨属植物，产于广东(徐闻)、海南(保亭、儋州)、广西(龙州)、云南(西双版纳)^[3]。本研究对山壳骨的化学成分与生物活性进行研究，运用LS- MS联用技术快速分离鉴定山壳骨的主要化学成分，并对获得的化学成分进行生物活性评价, 旨在发掘山壳骨的药用价值，弥补山壳骨研究的空白, 同时为综合开发与利用山壳骨提供科学依据。

1 材料和方法 1.1 仪器、试剂和耗材

质谱：Waters 3100 SQDMS (低分辨ESI)；核磁共振谱：Bruker Avance Ⅲ 500型核磁共振仪，以氘代试剂残留溶剂峰为内标；液相色谱与质谱联用仪：Waters 2695 LC偶联Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS；分析色谱柱型号：Waters Sunfire^® RP C-18，3.5 μm, 4.6 mm×100 mm；CO₂细胞培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；垂直超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；MK3型酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；超低温冰箱(日本三洋SANYO公司)；FM-500型倒置荧光生物显微镜(上海普丹光学仪器有限公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所)；Greiss NO试剂盒(碧云天生物技术研究所)；MTT噻唑兰(美国Sigma公司)；叔丁基过氧化氢(t-BHP)(成都格雷西亚化学技术有限公司)；200~300、300~400目柱层析硅胶均为青岛海洋化工厂生产；TLC预制薄层板: HSGF₂₅₄为德国Merck公司生产；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden); MCI树脂：CHP20P (75~150 μm), Mitsubishi Chemical Corporation生产；96孔细胞培养板(美国CORNING公司)；胎牛血清(FBS) (澳大利亚Gibco公司)；青-链霉素(P/S)(Thermo公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；RPMI-1640培养基(德国Biological Industries公司)；DMSO溶液(美国Sigma公司); HPLC分析用乙腈(Merck公司); 实验用水由美国Millipore公司纯水、超纯水系统提供；其他有机溶剂均为国产分析纯产品；TLC显色剂为5%香兰素乙醇液。

1.2 材料

山壳骨(Pseuderanthemum latifolium)全株15 kg, 2018年4月，采集于广东省揭阳市，标本号为20180401。

1.3 细胞株

神经细胞株：人神经母细胞瘤SH-SY5Y；购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

细菌细胞株：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC26003、大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MASA JCSC4474；购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

1.4 LC-MS分析条件

分析仪器：Waters 2695-2998-2424-3100SQDMS; 色谱柱：Waters Sunfire^® RP C₁₈, 3.5 μm, 4.6 mm× 100 mm；HPLC梯度：色谱乙腈-0.005%三氟乙酸/去离子水-0.005%三氟乙酸梯度洗脱，起始浓度5%色谱乙腈-0.005%三氟乙酸，结束浓度95%色谱乙腈- 0.005%三氟乙酸；运行时间25 min；流速：1 mL min^–1。

1.5 LC-MS导向分离

山壳骨(15 kg)，粉碎后用95%工业酒精室温浸泡3次，每次5 d，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味。将得到的总浸膏用水悬浮，然后用乙酸乙酯萃取，减压浓缩萃取液，得到水部分(205 g)和乙酸乙酯部分(85 g)。

运用LS-MS联用技术，对获得的水部分(205 g)和乙酸乙酯部分(85 g)进行分析。水部分化合物的保留时间集中在0~2 min，提示为大极性类化合物(图 1: A)。质谱分析结果显示，保留时间t_R=1.91 min的化合物分子量为180，推导为葡萄糖；而保留时间t_R≈ 1.29 min的化合物分子量在质谱上响应不明显，结合其大极性特点，推导为无机盐类成分。据此，本研究将不对山壳骨提取物水部分进行深入研究。

乙酸乙酯部分主要化合物的保留时间集中在26.14 min (图 1: B)。随后对保留时间t_R=26.14 min的色谱峰进行质谱分析，该色谱峰存在着2个分子量(426、412)，揭示其包含2个化合物。据此，本研究选择对山壳骨提取物乙酸乙酯部分进行深入研究，分离鉴定t_R=26.14 min的主要化合物。选用MCI柱层析处理乙酸乙酯部分，以乙醇-水(50%、70%、95%乙醇)为流动相梯度洗脱，富集t_R=26.14 min的化合物，根据其弱极性特征，该类化合物将富集在95%乙醇的洗脱组分中(组分A)。

随后，采用硅胶柱层析(200~300目)对组分A进行处理，正己烷:乙酸乙酯[10:1~1:1, (V/V, 下同)]梯度洗脱，薄层色谱(TLC)检测合并，获得子组分A1~A3。子组分A2经凝胶柱层析处理，氯仿:甲醇(1:1)洗脱，得到组分B2A~B2C；接下来对得到的子组分B2B再进行硅胶(300~400目)柱层析处理，正己烷:乙酸乙酯(10:1~1:1)洗脱，最后获得化合物1 (18 g)和2 (15 g)(图 2)。

1.6 结构鉴定

化合物 1  白色粉末; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ_H 2.36 (1H, m, H-19), 4.56 (1H, s, Ha-29), 4.68 (1H, s, Hb-29), 1.67 (3H, s, H-30); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): δ_C 38.6 (C-1), 27.3 (C-2), 78.9 (C-3), 40.0 (C-4), 55.2 (C-5), 18.0 (C-6), 34.2 (C-7), 40.8 (C-8), 50.4 (C-9), 37.1 (C-10), 20.88 (C-11), 25.0 (C-12), 38.0 (C-13), 42.8 (C-14), 27.9 (C-15), 35.5 (C-16), 42.9 (C-17), 48.2 (C-18), 47.9 (C-19), 151.0 (C-20), 29.7 (C-21), 38.8 (C-22), 27.3 (C-23), 15.4 (C-24), 15.9 (C-25), 16.1 (C-26), 14.5 (C-27), 18.2 (C-28), 109.3 (C-29), 19.2 (C-30)。以上数据与文献[6]报道的一致，故鉴定为羽扇豆醇。

化合物 2  白色粉末; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ_H 0.68 (3H, s, H-18), 1.01 (3H, s, H-19), 0.93 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-21), 0.80 (3H, d, J = 6.7 Hz, H- 27), 0.82 (3H, t, J = 7.2 Hz, H-29), 0.84 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-26), 5.35 (1H, m, H-6), 5.14 (1H, dd, J = 15.1, 8.7 Hz, H-22), 5.02 (1H, dd, J = 15.1, 8.7 Hz, H- 23), 3.53 (1H, m, H-3); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): δ_C 37.4 (C-1), 29.2 (C-2), 71.8 (C-3), 42.4 (C-4), 140.7 (C-5), 121.7 (C-6), 31.7 (C-7), 32.0 (C-8), 50.2 (C-9), 36.6 (C-10), 21.2 (C-11), 39.9 (C-12), 42.4 (C-13), 56.9 (C-14), 24.4 (C-15), 29.2 (C-16), 56.7 (C-17), 11.8 (C-18), 18.7 (C-19), 39.9 (C-20), 19.0 (C-21), 138.3 (C-22), 129.2 (C-23), 51.4 (C-24), 32.0 (C-25), 21.0 (C-26), 21.2 (C-27), 21.3 (C-28), 12.4 (C-29)。以上数据与文献[6]报道的一致，故鉴定为豆甾醇。

1.7 生物活性筛选

体外神经保护活性筛选  将SH-SY5Y细胞以6×10⁹ L^–1的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的培养皿中，加入含有10% FBS和1% P/S的DMEM培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。每天全量换液1次，隔天传代，并在显微镜下观察。将SH- SY5Y细胞以6×10⁵ L^–1的密度接种于多聚赖氨酸包被的96孔板中，每孔100 μL。将细胞分为0 (正常组)、50、100和200 μmol L^–1的t-BHP组，每组6个复孔。待细胞融合度达到80%~90%时，吸净培养基，加入含有相应浓度t-BHP的培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中分别培养3、6、12和24 h，观察SH- SY5Y细胞衰老情况。将SH-SY5Y细胞以6×10⁹ L^–1的密度接种于多聚赖氨酸包被的96孔板中，每孔100 μL。将细胞分为正常组、模型组、给药组(含有25、50、100和200 μg mL^–1大叶紫金牛酚的模型组)，每组6个复孔。置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h, 观察化合物1、2对SH-SY5Y细胞衰老的保护情况。MTT法检测各组SH-SY5Y细胞的存活率。

体外抗MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)活性筛选  本实验使用96孔板梯度稀释技术，测定化合物的最低抑菌浓度。首先将7.5 mL的指示剂溶液(100 μg mL^–1的刃天青水溶液)与5 mL的待测菌溶液(1.25×10⁶ cfu mL^–1)混匀，并向第1至第8列的所有测试孔中各加入100 μL混合菌液。然后将20 μL待测样品的DMSO溶液和80 μL混合菌液加入到第1列的各个板孔中，均匀混合后取出100 μL的溶液转移到第2列相应的板孔中，并用同样的方法倍增稀释到第8列。最后，将加好样品的孔板放入到恒温培养箱，37℃培养10~12 h。菌液变红色为无抑菌活性，蓝色为有抑菌活性，菌液维持蓝色的最低稀释浓度被认为是待测化合物的最低抑菌浓度, 每个样品做2组并重复测定3次。阳性对照为万古霉素(vancomycin)。

2 结果和讨论 2.1 体外神经保护活性评价

现代研究表明神经细胞保护是防治神经退行性疾病，如老年性痴呆、重症抑郁症、帕金森症和中风等疾病的重要机制^[7-10]。评价并筛选出具有显著神经保护活性的化合物，对开发治疗神经退行性疾病药物至关重要。因此，本研究通过探讨化合物1、2是否可以延缓SH-SY5Y细胞衰老，评价化合物1、2是否具有神经保护作用。试验结果表明, 化合物1、2与模型组相比，不能延缓SH-SY5Y细胞衰老，因此在SH-SY5Y模型下，化合物1、2不具有神经保护作用。

2.2 体外抗MRSA活性评价

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcu saureus，MRSA)被称为“超级细菌”, 已成为全球院内感染的首要致病菌，与HBV、HIV并列成为世界范围的三大难题^[11-15]。MRSA具有多重耐药性，对β-内酰胺等几乎所有临床常用抗生素表现出耐药性；万古霉素曾一度被认为是治疗MRSA感染的首选抗生素，但该抗生素毒副作用大，长期大剂量使用对肾脏损害严重，容易造成耳聋^[16-19]。因此，寻找新的能抑制MRSA的抗生素迫在眉捷。

本研究评价了化合物1、2对革兰氏阴性菌(大肠杆菌E. coli ATCC8739)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌S. aureus CMCC26003)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA JCSC4474)的抑制活性。从表 1可知，化合物1、2均对MRSA JCSC4474表现出中等抑制活性，MIC值为50 μg mL^–1。

本研究首次对爵床科山壳骨植物进行化学成分和生物活性研究，运用LC-MS联用技术快速分离山壳骨中主要化学成分，并使用核磁共振波谱技术进行结构解析，鉴定为羽扇豆醇(1)和豆甾醇(2)。同时本研究评价了化合物的体外神经保护以及抗MRSA活性，试验结果揭示这些化合物具有中等抗MRSA活性但不具有神经保护作用，为综合开发与利用山壳骨提供科学依据。