檀香紫檀(Pterocarpus santalinus)是蝶形花科(Papilionaceae)紫檀属乔木，是《濒危野生动植物物种国际贸易公约》和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》中的濒危级植物种，自然分布在热带原始森林，主产印度卡纳塔克邦、安得拉邦及缅甸联邦^[1]。这些国家和地区，不仅对檀香紫檀木材严格限制出口，对其种子的管制也十分严厉。在中国红木国家标准中，檀香紫檀心材是唯一被称为“紫檀木”的木材，位居第一，十分珍贵^[2]。中国没有檀香紫檀自然分布，目前仅在海南岛有少量引种栽培, 表现优良，值得在热带南亚热带地区推广^[3-4]，但较长时间的0℃低温即可对其产生显著伤害^[5]。

硅(Si)是地壳中仅次于氧(O)的第2大化学元素, 在自然界的存在形式主要是氧化物和硅酸盐, 以SiO₂及类似化合物最稳定，溶解度很低。虽然土壤中SiO₂含量达50%~70%，但植物可利用的Si主要是H₄SiO₄，在土壤中的含量很低^[6-7]。通常认为Si是植物的有益元素，目前只在硅藻门(Bacillario- phyta)、禾本科(Gramineae)、木贼科(Equisetaceae)等少数植物中认定Si是必需的矿质元素^[8]。导致这种情形的主要原因在于无法创造无Si环境，即使纯度极高的水也含一定量Si。越来越多的研究表明，植物对Si的吸收和运转是一个主动过程，植物体内存在Si大量涌入的转运蛋白^[9-11]；植物对Si的吸收运转同时存在主动和被动过程，相对重要性取决于植物种类和供Si浓度^[12-13]；Si参与植物的许多生理活动和代谢作用，对植物生理生态具重要功能^[14]。施Si可改善一些植物的叶片着生方式和冠层结构，增强茎秆机械强度、降低倒伏率^[15-16]，缓解金属及类金属离子毒害^[17-18], 缓解盐胁迫^[19-21]，增强抗旱性^[22]、抗病性^[23-24]和抗虫性^[25-26]。施Si也促进一些植物生殖器官的形成和发育，从而提高经济产量和质量^[27-28]。

有关改善Si营养在提高植物抗寒性中的作用研究很少，如短期低温胁迫下Si与抗寒性不同的两个小麦(Triticum aestivum)品种若干生理参数的响应特性^[29-30]，以及Si对低温胁迫下黄瓜(Cucumis sativus)生长抑制的缓解作用^[31]。低温胁迫是限制我国引种栽培红木树种的关键生态因子^[32]。为探究施Si对檀香紫檀抗寒性的影响，基于前期的相关研究，本文设计4种施Si量，研究了Si对(-3±0.5)℃胁迫24 h (模拟南亚热带地区较重的寒冻灾害)后檀香紫檀苗木生长恢复、叶片光合速率及碳同化相关酶活性等生理参数的影响，为幼林阶段的抗寒营养管理提供科学依据。

试验用檀香紫檀苗木为实生苗，种子采自海南热带植物园，穴播，出苗率为6.5% (30 d，依翅果个数计)，培育至10月龄(自播种后30 d始)时移入塑料盆中栽植。栽培基质为耕作土+150 g kg^–1草炭+ 50 g kg^–1河沙，含有机质17.2 g kg^–1，速效氮、速效磷、速效钾分别为55.6、32.5和115.8 mg kg^–1, pH 6.5。6月上旬完成盆栽，每盆装7.5 kg (干质量为5.85 kg)基质。栽植后，每盆分别追施尿素、过磷酸钙和硫酸钾0.3、0.2和0.25 g kg^–1。温室中盆栽60 d后施Si处理。

以K₂SiO₃·nH₂O为Si源，设计4种施Si量：0、0.75、1.50、2.25 mmol kg^–1，由K₂SiO₃·nH₂O引入的钾(K)量从硫酸钾中扣除。施Si后培养180 d进一步选择苗木，在低温室中(光强150 μmol m^–2s^–1, 照光时间10 h d^–1)进行24 h (–3±0.5)℃低温胁迫。每处理20株，3次重复。达到(–3±0.5)℃前的降温过程是10℃ 24 h、5℃ 48 h、1℃ 12 h，低温胁迫结束后运回温室前的升温过程是1℃ 12 h、5℃ 48 h、10℃ 24 h。以不施Si不经低温胁迫为对照。

低温胁迫前，测定各处理苗木的株高、地径、叶片数量和形态参数，对叶片表面超微形态结构进行观察。低温胁迫结束后，在温室中继续培育90 d (苗木整体上明显恢复)，再次测量各处理苗木的株高、地径、叶片数量和形态参数，测定各处理苗木叶片的叶绿素荧光参数和气体交换参数及4种碳同化关键酶的活性(3次重复)。

叶表面超微结构观察  用锋利刀片切取叶片主脉基部2 mm×2 mm的部分，用2.5%戊二醛于4℃冰箱中固定3 h，用0.1 mol L^–1磷酸缓冲液(pH 6.8)冲洗3次(每次10 min)，分别用50%、70%、80%、90%乙醇脱水(每次15 min)，用无水乙醇脱水3次(每次15 min)，纯叔丁醇浸渗15 min，真空冷冻干燥，SU8010型冷场发射扫描电镜，最大加速电压15.00 kV，样品倾斜0°，样品与探针间呈35°^[33]。

叶片光合色素含量测定  每处理选择3片叶, 蒸馏水清洗表面。避开中央叶脉，在叶片中部用直径9 mm打孔器取6个叶圆片，称重后置15 mL试管中，用10 mL 80%丙酮和无水乙醇混合液(1:1)在25℃室温下避光浸提24 h，至叶圆片完全变白后分别测量663、645、440 nm处的光密度值，计算叶绿素a、b和类胡萝卜素含量^[34-35]。

叶片叶绿素荧光参数测定  采用OS1P型调制荧光仪。非化学淬灭(NPQ)模式，测定时间每次1 min，每处理测试5株，每株测试4片叶。设备自动计算表观电子传递速率[ETR=Y(II)×PAR× 0.84×0.5]，非光化学荧光淬灭系数(NPQ=Fm/Fmʹ− 1), Y(II)=(Fmʹ−Fʹ/Fmʹ)，PSII调节性能量耗散比例[Y(NPQ)=Fʹ/Fmʹ−Fʹ/Fm]，及PSII非调节性能量耗散比例[Y(NO)=Fʹ/Fm]，式中，Y(II)为PSII实际光化学效率，PAR为光合有效幅射，Fm为最大荧光，Fmʹ为光下最大荧光，Fʹ为实际荧光。

叶片气体交换参数测定  采用LI-6400型便携式光合作用测定仪。于上午9:30–11:30，下午2:00–4:00测量，每处理测5株，每株测4片叶, 测定叶片净光合速率(Pn, μmol m^–2s^–1)、气孔导度(Gs, mol m^–2s^–1)、胞间CO₂浓度(Ci, μmol mol^–1)、蒸腾速率(Tr, mmol m^–2s^–1)。气孔限制值(Ls, %)=1-Ci/Ca× 100，水分利用效率(WUE, μmol mmol^–1)=Pn/Tr, 式中，Ca为大气CO₂浓度。

Rubisco (RuBP羧化酶)活性测定  参照Liley等^[36]的方法。研磨液为33 mmol L^–1 Tris-HCl (pH 7.5)缓冲液，内含0.67 mmol L^–1 Na₂-EDTA, 33 mmol L^–1 MgCl₂和10 mmol L^–1 NaHCO₃。反应体系含100 mmol L^–1 Tris-HCl (pH 8.0)，2 mmol L^–1 Na₂-EDTA，20 mmol L^–1 MgCl₂，10 mmol L^–1 DTT，10 mmol L^–1 ATP，0.4 mmol L^–1 NADH，140 mmol L^–1 NaHCO₃，1 U 3-磷酸甘油激酶，2.5 U 3-磷酸甘油醛脱氢酶，0.06 mmol L^–1 RuBP和25 μL酶液。在340 nm处检测3 min内吸光值的变化。

果糖-1, 6-二磷酸酶(FBP)活性测定  用酶联免疫试剂盒法测定。研磨液为50 mmol L^–1 Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液，内含100 mmol L^–1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠。12 000×g离心提取液5 min，上清液在340 nm处检测1 min内吸光值的变化。

果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶(Ald)活性测定  参照Mustroph等^[37]的方法测定。研磨液为50 mmol L^–1 Tris-HCl (pH 6.8)缓冲液(内含5 mmol L^–1 MgCl₂、5mmol L^–1 β-巯基乙醇、15%甘油、1 mmol L^–1 EDTA、1 mmol L^–1 EGTA，0.1 mmol L^–1 PMSF)。粗提液12 000×g离心20 min，取上清液在4℃下透析24 h获得酶液。透析液组成：10 mmol L^–1 Tris-HCl (pH 6.8)，1 mmol L^–1 EDTA。反应体系含0.4 mL 100 mmol L^–1 Tris-HCl (pH 7.2，内含2 mmol L^–1 EDTA)、0.1 mL 1.4 mmol L^–1 NADH、0.1 mL 10 U磷酸丙糖异构酶、0.1 mL 10 U NAD-葡萄糖3-磷酸脱氢酶、100 μL酶液，加入200 μL 5 mol L^–1 D-果糖1, 6-二磷酸启动反应，在340 nm处检测吸光值。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性测定  参照Blanke等^[38]的方法测定。叶样0.50 g，加入3 mL预冷的提取介质研磨，滤液在4℃下15 000×g离心20 min，上清液为酶粗提液。试管中依次加入反应缓冲液1.0 mL，40 mmol L^–1 PEP，1 mg mL^–1 NADH (pH 8.9)，10 μg mL^–1苹果酸脱氢酶(MDH)和酶提取液各0.1 mL，超纯水1.5 mL，保温10 min，在340 nm处测定吸光值(OD₀)，加入100 mmol L^–1 NaCO₃ 0.1 mL启动反应，每隔20 s测定1次吸光值(OD₁)，测定3 min内吸光值的变化。

用Microsoft Office Excel 2013软件进行用平均数、标准差的计算及作图，用邓肯氏(Duncan’s)新复极差法对不同处理平均数间的差异显著性进行多重比较分析(P < 0.05)。

随施Si量增大，苗木株高降低，地径增大，叶片数增多，但处理间差异不显著，均与对照无显著差异。(–3±0.5)℃低温胁迫后，未施Si苗木的生长显著受到抑制，虽经历90 d的恢复，株高、地径、叶片数量均显著小于对照。但施Si量不同，受低温胁迫苗木的生长恢复情况存在差异：施0、0.75 mmol kg^–1 Si，株高、地径、叶片数量均显著小于对照，且处理间差异显著；施1.5、2.25 mmol kg^–1 Si的株高、地径、叶片数量均显著大于前2种处理且与对照均无显著差异。这表明栽培基质中施1.5 mmol kg^–1 Si即可显著促进檀香紫檀苗木有效抵御低温胁迫产生的生长抑制(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 Si对低温胁迫后檀香紫檀苗木生长的影响 柱上不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下图同。 Fig. 1 Effect of Si on the growth of red sandalwood seedlings after cold stress Different letters upon column indicate significant differences at 0.05 level. The same is following Figures.

未施Si苗木，经(-3±0.5)℃低温胁迫后，虽历经90 d的生长恢复，叶片大小、形态和质量参数的值仍小于对照。随施Si量增大，叶长减小，叶宽增大, 叶片长/宽减小，单叶面积、重量和比叶重增大；施1.5、2.25 mmol kg^–1 Si的差异不明显(图 2)。扫描电镜观察表明，随施Si量增大，苗木叶片表面由蜡质晶体构成的网状结构明显变得比较致密、厚实(图 3)。

图 2(Fig. 2)

图 2 Si对低温胁迫后檀香紫檀苗木叶片的影响 Fig. 2 Effect of Si on leaves of red sandalwood seedlings after cold stress

图 3(Fig. 3)

图 3 施Si对檀香紫檀苗木叶片表面超微结构的影响。A~H:下表皮, 800×; I~P:下表皮, 7 000× Fig. 3 Effect of Si on ultrastructure of leaf surface of red sandalwood seedlings. A-H: 800×; I-P: 7 000×

不施Si苗木经(–3±0.5)℃低温胁迫后90 d, 叶片的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素a+b、类萝卜素含量、叶绿素+类萝卜素和叶绿素a/b均显著小于对照；施Si处理，叶片的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素a+b、类萝卜素含量、叶绿素+类萝卜素和叶绿素a/b均大于不施Si但经低温胁迫的苗木，施1.5 mmol kg^–1 Si处理的叶片的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素a+b、类萝卜素含量、叶绿素+类萝卜素均显著大于对照，叶绿素a/b则与对照相当，进一步表明施Si促进檀香紫檀苗木生长发育，提高抗寒性(图 4)。

图 4(Fig. 4)

图 4 施Si对低温胁迫后檀香紫檀叶片光合色素的影响 Fig. 4 Effect of Si on photosynthetic pigments in leaves of red sandalwood seedlings after cold stress

由图 5可见，不施Si苗木经(-3±0.5)℃低温胁迫后90 d，叶片的叶绿素最大荧光产量(Fm)、表观光合电子传递速率(ETR)、实际光量子效率[Y(Ⅱ)]和PSⅡ调节性能量耗散比例[Y(NPQ)]较对照显著减小, 光损伤的重要指标——PSⅡ非调节性能量耗散比例[Y(NO)]和非光化学荧光淬灭系数(NPQ)较对照显著增大。低温胁迫后90 d，随施Si量增大，叶片的Fm、ETR、Y(Ⅱ)和Y(NPQ)逐渐增大，而Y(NO)和NPQ逐渐减小，均达显著差异。总体上，施1.5 mmol kg^–1 Si的叶片叶绿素荧光参数基本上均与未受低温胁迫苗木的水平相当。这表明，提高栽培基质可溶性Si含量，可改善檀香紫檀受低温胁迫苗木的光合电子传递速率、光量子效率、光保护能力和热耗散能力。

图 5(Fig. 5)

图 5 施Si对低温胁迫后檀香紫檀苗木叶片叶绿素荧光参数的影响。Fm:最大荧光; ETR:表观电子传递速率; NPQ:非光化学荧光淬灭系数; Y(II): PSII实际光化学效率; Y(NPQ): PSII调节性能量耗散比例; Y(NO): PSII非调节性能量耗散比例 Fig. 5 Effect of Si on chlorophyll fluorescence parameters of red sandalwood seedlings suffered cold stress. Fm: Maximum fluorescence; ETR: Apparent electron transfer rate; NPQ: Non-photochemical quenching coefficient; Y(II): Actual photochemical efficiency of PSII; Y(NPQ): PSII regulatory energy dissipation ratio; Y(NO): PSII non-regulated energy dissipation ratio

由图 6可见，与对照相比，未施Si苗木经(-3± 0.5)℃低温胁迫后90 d，叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、水分利用效率(WUE)和气孔限制值(Ls)显著降低，胞间CO₂浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)显著增大。而施Si显著改善受低温胁迫苗木的叶片气体交换参数，施1.50 mmol kg^–1 Si，叶片的Pn、Gs、WUE、Ls、Ci和Tr均与未受低温胁迫苗木的水平相当甚至更大。这说明施Si促进受低温胁迫檀香紫檀苗木叶片的气孔调节能力、光合速率和水分利用效率, 增强其适应性(图 6)。

图 6(Fig. 6)

图 6 Si对低温胁迫后檀香紫檀苗木叶片气体交换参数的影响。Pn:净光合速率; Gs:气孔导度; Ci:胞间二氧化碳浓度; Tr:蒸腾速率; WUE:水分利用效率; Ls:气孔限制值 Fig. 6 Effect of Si on gas exchange parameters of leaves of red sandalwood seedlings suffered cold stress. Pn: Net photosynthesis rate; Gs: Stomatal conductance; Ci: Intercellular CO2 concentration; Tr: Transpiration rate; WUE: Water use efficiency; Ls: Stomatal limitation value

未施Si苗木经(–3±0.5)℃低温胁迫后90 d，叶片的核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶(Ald)、果糖-1, 6-二磷酸酶(FBP)及PEP羧化酶(PEPC)活性仍显著低于对照，分别低39.4%、17.8%、31.2%和40.5%；相反，施Si苗木叶片这些酶的活性均显著提高，施0.75 mmol kg^–1 Si苗木叶片的4种酶活性分别提高31.1%、18.3%、19.7%和33.9%，施1.50 mmol kg^–1 Si的4种酶活性分别提高74.2%、32.2%、45.0%和81.2%，施2.25 mmol kg^–1 Si的4种酶活性分别提高128.0%、45.6%、56.5%和118.2%，且施1.50 mmol kg^–1 Si的4种酶活性均与对照无明显差异(图 7)。

图 7(Fig. 7)

图 7 Si对低温胁迫后檀香紫檀苗木叶片碳同化4种关键酶活性的影响。Rubisco:核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶; FBP:果糖-1, 6-二磷酸酶; Ald:果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶; PEPC:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 Fig. 7 Effect of Si on activities of 4 key enzymes related photosynthesis in leaves of red sandalwood seedlings under cold stress. Rubisco: Ribulose bispho- sphate carboxylase oxygenase; FBP: Fructose 1, 6-bisphosphatase; Ald: Fructose 1, 6-bisphosphate aldolase; PEPC: Phosphoenolpyruvate carboxylase

生长发育状况是植物对胁迫响应的综合表现, 特别是新梢生长对胁迫程度和持续时间往往非常敏感^[39]。本文的研究结果表明，栽培基质中可溶性Si含量水平与低温胁迫后檀香紫檀苗木生长恢复状况密切相关，施Si的苗木生长健壮、发育良好, 显著提高对低温胁迫的抗性，且低温胁迫后恢复速度快、缓苗期短，在试验中没有受冻枯梢甚至死亡的苗木，也很少落叶，施Si量达1.5 mmol kg^–1即可获得与未受低温胁迫苗木相当或更好的生长发育状况。这对檀香紫檀幼龄苗木抗寒性提高及冬季露地栽培中的营养管理具实践意义。

低温胁迫对植物光合作用的影响首先是由于低温直接影响叶绿素合成、光合器官的结构和活性，同时也影响植物的其他生理过程, 从而间接抑制光合作用，引起水分胁迫、气孔对CO₂扩散阻力增大、光合产物运输受阻等。低温胁迫下，植物的叶绿体色素降解、光合速率明显下降、蒸腾作用加强、气孔导度减小、胞间CO₂浓度升高、气孔限制值减小、光合水分利用效率降低^[40]。本研究结果与此一致, 但即使是低温胁迫后很长时间，低温胁迫对檀香紫檀苗木叶片光合作用的影响仍很显著。这可能是由于低温胁迫对叶片叶绿体结构破坏，造成叶片光合器官损伤、光合色素降解或合成能力不足所致, 但栽培基质中施Si处理的檀香紫檀苗木所受抑制显然轻得多或基本不受影响，暗示良好的Si营养有利于保护低温胁迫下光合器官结构与功能的完整性、稳定性。

有研究表明，低温胁迫使植物叶绿素含量明显降低，幼嫩叶片易发生失绿或黄化，且Chl a的敏感性远超过Chl b；Chl a/b越小，类囊体垛叠程度越小，光抑制程度越强^[41-42]。本文的结果表明，低温胁迫后檀香紫檀叶片的Chl a、Chl b含量及Chl a/b均发生显著改变，纵使恢复90 d后仍显著低于未受胁迫苗木。Chl a主要存在于PSⅠ、PSⅡ核心复合物及天线色素中，Chl b是两个光系统的天线组成成分，低温胁迫后檀香紫檀叶片Chl a、Chl b含量降低，表明其两个光系统的核心复合物和外周天线均受到损伤，导致光能的吸收和传递等受到影响，引起光合速率下降，但施Si处理明显减缓檀香紫檀叶片叶绿体色素和Chl a/b的下降，促进ETR、Y(Ⅱ)和Y(NPQ)、减缓Y(NO)和NPQ，表明一定水平的Si营养有利于保护低温胁迫下光合色素代谢的稳定性，减小低温对叶片两个光合系统复合物和外周天线以及类囊体垛叠程度的损伤程度^[9]。

光合作用是植物产量形成的基础。檀香紫檀属C₃植物，碳同化关键酶有Rubisco、PEP羧化酶^[43]、FBP和Ald。有研究表明，Rubisco含量和活性对光合作用中叶肉导度限制起主导作用，在低温胁迫下其活性降低程度与光合效率降低呈正相关。FBP催化水解果糖-1, 6-二磷酸，其活性强弱直接影响碳水化合物累积和光合效率^[44]。Ald可催化卡尔文循环中三碳化合物转化为六碳化合物，是碳同化过程中重要的限速酶^[45]。在本研究中，檀香紫檀苗木经受零下低温胁迫24 h后在温室恢复90 d，未施Si苗木4种碳同化关键酶活性仍显著低于未胁迫苗木, 而施Si苗木的4种碳同化关键酶活性均显著高于未施Si苗木，这与叶片叶绿素荧光参数和气体交换参数的变化趋势一致，表明施Si能增强檀香紫檀叶片对CO₂的固定能力、同化效率和光合电子传递速率, 有利于同化力(NADPH和ATP)积累和糖酵解代谢，增强光能利用率，缓解产物反馈抑制，加速卡尔文循环运转。

综上所述，适量施Si显著促进檀香紫檀苗木健壮发育和低温胁迫后的生长恢复，是提高苗木抗寒性、应对低温胁迫的有效营养管理措施，其作用机理之一可能是Si介导低温胁迫下苗木光合膜结构的完整性及其生理功能的稳定性。华南地区和云南南部地处南亚热带或热带北缘，冬季易受低温寒潮侵袭，在珍贵红木树种檀香紫檀引种栽培中加强林地营养管理很必要。为此，可积极施用Si肥，包括枸溶性Si肥和硅酸盐微生物菌剂，施用大量元素化肥与施用Si肥相结合，或栽植时适量配施腐熟的稻壳、稻壳粉、稻草粉、甘蔗渣或稻壳灰，既有效提高林地可溶性Si水平，又显著改善土壤有机质含量和理化性质。