2019, Vol. 27
2. 福建农林大学园艺植物生物工程研究所, 福州 350002
2. Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
猕猴桃(Actinidia deliciosa)是猕猴桃科(Actini- diaceae)猕猴桃属落叶藤本果树，果实中富含维生素C、亚麻酸、氨基酸和微量元素等，被认为是20世纪野生果树驯化最成功的果种之一[1]。然而，猕猴桃果实耐贮性差，采后易软化腐烂，严重影响猕猴桃可食性和商品价值，如何延长猕猴桃贮藏保鲜期成为猕猴桃产业发展亟待解决的难题[2]。
过氧化物酶(peroxidase, POD)是由单一肽链与卟啉组成的一种血红素蛋白，能够以铁卟啉为辅基，以H2O2为电子受体催化底物氧化，在植物体内发挥抗氧化作用。POD是多基因家族编码的同工酶，功能广泛且丰富多样，在植物生长、发育和衰老过程中，POD活性水平均有强烈变化[3-4]。此外，POD还参与植物激素调控、活性氧代谢、抗病虫、耐干旱胁迫等生理过程，是植物响应逆境胁迫的关键酶之一。过表达过氧化物酶基因明显提高番茄对苯酚胁迫的耐受性[5]；POD基因能够响应缺硼胁迫改变柑桔砧木中木质素含量[6]；POD活性会影响温州蜜柑贮藏过程中果皮和果肉中的枯水发生，进而影响果实采后衰老[7]。
已有研究表明，POD在猕猴桃采后贮藏和保鲜过程中发挥重要作用。Zolfaghari等[8]认为，低温下猕猴桃POD活性均提高，长时间冷藏于(1±1)℃, 相对湿度(80±5)%有利于维持猕猴桃最佳品质。猕猴桃花后不同时间采收的果实中POD活性也存在显著差异[9]。在猕猴桃采后贮藏效果影响因素研究中，一氧化氮、1-甲基环丙烯、氮气、硫化氢和槲皮素等均能上调猕猴桃果肉中POD活性，维持风味品质和较高的抗病能力，减少果实冷藏冷害，延缓果实衰老，但也可能引起部分品种果心木质化[10-17]; 而草酸能够显著抑制猕猴桃果肉中POD等木质素合成相关酶的活性，减轻因木质化引起的果实品质劣变[18]。此外，微波、高压和热处理也会影响猕猴桃果汁和果酱中POD活性，从而改变其贮藏效果[19-20]。
低温贮藏是延长猕猴桃果实货架期的有效途径，而脱落酸(abscisic acid, ABA)在猕猴桃后熟衰老过程中能够促进水解酶活性增强，参与猕猴桃果实成熟过程的软化启动[21]。目前，猕猴桃POD相关研究主要集中在POD活性改变对果实贮藏、衰老和品质等生理方面影响，其分子机理尚不明确。低温和ABA作为目前已知的猕猴桃软化两个重要相关因素，其在软化过程中与POD的相互作用关系及其调控机制也未见报道。而在前期研究中，通过高通量转录组测序发现，POD27和POD64在猕猴桃不同贮藏处理组中存在明显的转录水平差异。鉴于此，试验以‘米良1号’猕猴桃为材料，对猕猴桃基因组中预测的这2个POD基因家族成员进行验证和生物信息学分析，同时研究了猕猴桃贮藏软化、低温和ABA处理下POD活性和POD表达模式的相关性，以期为猕猴桃POD基因的调控功能研究提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料试验所用‘米良1号’猕猴桃(Actinidia deliciosa ‘Miliang-1’)采自福建省农业科学院果树研究所建宁猕猴桃基地。2017年9月份，采集大小相近，成熟度一致，无病虫害和机械损伤的果实，参考陈义挺等[22]的方法进行处理，将猕猴桃随机分为6组(编号1~6)，每组10个果实，组1为25℃不贮藏(对照)，组2为25℃中贮藏1周，组3~5分别为4℃下贮藏1、2和3周，组6为50 mg L-1的ABA浸泡2 min后于25℃中贮藏1周。每处理重复3次，经液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱中用于POD活性测定和RNA提取。
1.2 POD活性测定根据POD催化H2O2氧化特定底物，在470 nm有特征光吸收的原理，采用植物过氧化物酶试剂盒(购自苏州科铭生物技术有限公司)测定猕猴桃的POD活性。
1.3 RNA提取和cDNA逆转录采用植物多糖多酚试剂盒RNAprep pure Plant Kit提取猕猴桃总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度计进行质量和浓度检测合格后进行等量混合，利用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录cDNA用于PCR扩增，同时采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removel; TransGen Biotech, Beijing)逆转录cDNA用于qRT-PCR试验。
1.4 基因克隆从已公布的猕猴桃基因组数据库(Kiwifruit Genome Database, http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)中搜索并下载猕猴桃POD27和POD64基因可能序列(Gene ID：Achn356831和Achn132211), 设计引物(表 1)进行ORF全长扩增。PCR扩增体系为：2×TransTaq®HiFi PCR SuperMix 12.5 μL，cDNA模板50 ng，上下游引物各0.1 μmol L-1，补足高压ddH2O至终体积25 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，TM退火30 s，72℃延伸1 min，35次循环后再72℃延伸8 min。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，切割预期目的条带采用EasyPure®Quick Gel Extraction Kit回收，根据试剂盒说明书采用pEASY®-T5 Zero Cloning Kit连接目的片段和载体，转化到Trans1-T1感受态细胞中涂板，37℃暗下培养12 h后挑取单克隆子进行PCR检测，选取阳性克隆子送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
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表 1 基因克隆、qRT-PCR引物序列 Table 1 Primers used in cloning and qRT-PCR of genes |
采用在线软件进行POD生物信息学分析, 基本理化性质(ExPASy，http://web.expasy.org/ protparam/), 信号肽(SignalP 4.1 Server，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，亚细胞定位(PSORT Prediction, https://psort.hgc.jp/form.html), 跨膜结构(TMpred, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html), 磷酸化位点(NetPhos 3.1 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/), 保守结构域(NCBI conserved domain searc, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，结合位点(PROSITE, http://www.expasy.ch/prosite)，卷曲螺旋结构(COILS, http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html), 蛋白质二级结构(PSIPRED, http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/), 蛋白质三维结构(SWISS-MODEL, https://swissmodel.expasy.org/)。
1.6 qRT-PCR分析以猕猴桃ACTB为内参基因进行qRT-PCR试验。将各cDNA样品等体积混样，随后按10-1、30-1、90-1和270-1进行梯度稀释用于绘制标准曲线，根据扩增效率筛选适宜的退火温度检测不同样品中基因的相对表达量。采用Eppendorf Realplex4荧光定量PCR仪设置qRT-PCR扩增程序：94℃预变性30 s; 94℃变性10 s，TM退火15 s，72℃延伸10 s，循环40次；94℃ 15 s，60℃ 15 s，再以0.11 ℃ s-1的速度升温至94℃保持15 s，绘制融解曲线。qRT-PCR反应体系为2×TransStart® Top Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL，上下游引物(表 1)各0.2 μmol L-1，模板0.5 μmol L-1。采用Excel 2003和SPSS 19.0进行数据统计、差异显著性分析和相关性分析。
2 结果和分析 2.1 POD活性与对照相比，25℃和ABA处理的猕猴桃贮藏1周后POD活性显著提高(P < 0.01)，此时猕猴桃硬度急剧下降，可溶性固形物含量上升，果实软化[21]，可见POD参与了猕猴桃软化过程，并且POD活性可能受ABA影响(图 1)。而低温贮藏过程中，4℃贮藏1周后POD活性明显提高，随后急剧下降，3周后重新上升恢复到对照水平(P > 0.01)，说明猕猴桃POD活性能够响应低温诱导，在猕猴桃抗冷早期发挥重要作用。可见，POD可能在猕猴桃贮藏软化、ABA诱导和低温响应过程中发挥调控作用。
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图 1 猕猴桃POD活性变化。1: 25℃贮藏0周; 2: 25℃贮藏1周; 3~5: 4℃贮藏1、2和3周; 6: 50 mg L-1ABA浸泡2 min后25℃贮藏1周。柱上不同字母表示差异极显著(P < 0.01)。 Fig. 1 Change in POD activity of kiwifruit. 1: Storage in 25℃ for 0 week; 2: Storage in 25℃ for 1 week; 3-5: Storage in 4℃ for 1, 2 and 3 weeks, respectively; 6: Storage in 25℃ for 1 week after treated with 50 mg L-1 ABA for 2 min. Different capital letters upon column indicated significant difference at 0.01 level. |
根据猕猴桃基因组数据库对POD27和POD64序列进行验证，分别获得长度为984和957 bp的ORF序列，预测分别编码327和318个氨基酸，起始密码子均为ATG，终止密码子分别为TAA和TAG (图 2, 3)。POD27和POD64与‘红阳’猕猴桃(A. chinensis ‘Hongyang’)基因组相应CDS序列(GenBank登录号: Achn356831和Achn132211)的相似性分别达到99.39%和99.16%，而POD27和POD64间的核苷酸和预测蛋白序列的相似性分别为49.45%和40.00%。通过NCBI比对，猕猴桃POD27与烟草(Nicotiana attenuata)和杨树(Populus trichocarpa)的POD27相似性分别为74%和73%，POD64与葡萄(Vitis vinifera)和向日葵(Helianthus annuus)的POD64相似性分别为82%和79%，表明所获得的序列为猕猴桃相应基因，分别命名为AdPOD27和AdPOD64，GenBank登录号分别为MF774100和MF774101。
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图 2 AdPOD27序列和推测的氨基酸序列。下划线和阴影分别表示保守结构域和血红素结合位点，下同。 Fig. 2 cDNA sequence of AdPOD27 and putative amino acid sequence. Underline and shaded area indicated conserved domain and heme binding site respectively. The same is following figure. |
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图 3 AdPOD64序列和推测的氨基酸序列 Fig. 3 cDNA sequence of AdPOD64 and putative amino acid sequence |
生物信息学分析表明，AdPOD27和AdPOD64的基本理化性质存在一定差异(表 2)，二者均为亲水性碱性蛋白，但AdPOD27属于稳定蛋白，而AdPOD64属于不稳定蛋白；AdPOD27中亮氨酸(Leu)含量最多，达到9.8%，其次是赖氨酸(Lys)和丙氨酸(Ala)，分别为8.3%和8.0%，而AdPOD64中丝氨酸(Ser)含量最多，达到11.3%，其次是Leu和Ala，均为10.1%。亚细胞定位表明，AdPOD27和AdPOD64可能分别定位于线粒体和细胞外，二者分别于氨基酸序列5'端第1~26位和第1~24位氨基酸含有信号肽。保守结构域和结合位点预测表明, AdPOD27和AdPOD64蛋白均属于植物亚铁红素依赖Ⅲ型过氧化物酶超家族成员，主要参与细胞间隙和液泡的过氧化氢分解、生长素代谢、木质素合成和胁迫响应等(图 2, 3)。TMpred分析表明，AdPOD27含有4个由内向外和由外向内的跨膜螺旋结构以及28个磷酸化位点，AdPOD64含有4个由内向外和2个由外向内的跨膜螺旋结构，磷酸化位点个数为38。二级结构预测表明，AdPOD27中α-螺旋和β-折叠分别占45.9%和4.6%，而AdPOD64中二者含量分别为47.8%和2.5%。SWISS-MODEL预测表明, AdPOD27和AdPOD64与棕榈(Trachycarpus fortunei, PDB: 4usc.1.A)的相似度分别达到45.12%和46.44%，以此为模型预测2个猕猴桃POD的三维结构(图 4)。
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表 2 AdPOD27和AdPOD64的基本理化性质 Table 2 Physicochemical properties of AdPOD27 and AdPOD64 |
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图 4 AdPOD27 (A)和AdPOD64 (B)的三维结构预测 Fig. 4 Predicted three-dimensional structures of AdPOD27 (A) and AdPOD64 (B) |
从图 5可见，25℃贮藏1周后猕猴桃AdPOD27的表达量是对照的1.5倍，而AdPOD64的表达量未出现显著变化，说明AdPOD27可能参与猕猴桃果实软化过程，而AdPOD64的调控作用较不明显。ABA处理后，AdPOD27和AdPOD64的表达量急剧上升，分别为对照的419和23倍，说明二者均能够响应ABA诱导，尤其是AdPOD27。猕猴桃果实在4℃处理1周后，AdPOD27的表达量明显上调，为对照的98倍，随后下降，在低温贮藏后期的调控也不明显，而AdPOD64的表达量几乎不发生改变。此外，在所有处理中，AdPOD27的表达量均高于AdPOD64，可见，AdPOD27可能在猕猴桃果实软化、低温响应和ABA诱导等过程中比AdPOD64发挥更全面的调控功能。
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图 5 AdPOD27和AdPOD64的表达模式 Fig. 5 Expression pattern of AdPOD27 and AdPOD64 |
采用SPSS19.0进行Pearson相关性分析, 结果表明，猕猴桃经不同处理，AdPOD27的表达量与POD活性呈显著正相关(r=0.533, P=0.023 < 0.05), 而AdPOD27与AdPOD64的表达量呈极显著正相关(r=0.947，P=0 < 0.01)。此外，AdPOD64的表达量与POD活性也存在正相关关系，但不显著(r=0.430, P=0.075 > 0.05)。可见，在猕猴桃果实软化、低温响应和ABA诱导过程中, AdPOD27和AdPOD64可能相互影响，而AdPOD27可能通过上调和下调表达影响POD活性，从而起到更重要的调控作用。
3 讨论大量研究表明，POD在ABA介导的非生物胁迫响应过程中具有重要调控功能。外源喷施ABA能够提高水稻(Oryza sativa)幼苗的POD活性，增强其清除自由基的能力从而获得更高的抗寒能力[23]; 叶片或者根系外施ABA能够增强POD等抗氧化酶活性，维持植物膜系统和光合器官的稳定性，降低超氧阴离子和过氧化氢含量，延缓膜脂丙二醛含量增加，显著提高猕猴桃、姜(Zingiber officinale)、小麦(Triticum aestivum)和豌豆(Pisum sativum)等植物抗干旱能力[24-27]；ABA处理还导致小麦胚胎超氧自由基、过氧化氢和氧化应激指标提高，从而诱导部分POD同工酶活性增强[28]。此外，对番茄(Lycopersicon esculentum)、甘蔗(Saccharum spp.)和柽柳(Tamarix hispida)等的研究也表明，ABA能够诱导POD上调表达[29-31]。本试验中，ABA处理的AdPOD27和AdPOD64表达量大幅度提高，说明这2个成员参与了ABA介导的非生物胁迫响应过程，然而与25℃处理相比，POD活性整体水平并没有显著变化，表明仍有其他POD同工酶参与了该过程，结果也预示着POD同工酶不同成员可能存在特异的调控功能。
低温贮藏是猕猴桃延缓果实软化，延长货架期的有效手段，然而果实低温贮藏过程中冷害常常导致果面皱缩，果肉水渍化[32]。而果实采后抗冷性与抗氧化性酶活性呈显著正相关性，通过低温锻炼或逐步降温保存可以显著增强POD等抗氧化酶活性，清除丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子等从而明显提高果实的耐冷性[33-34]。然而，POD家族转录调节模式和功能丰富多样甚至在部分物种间完全相反，胡椒(Capsicum annuum)的CanPOD并不参与冷胁迫过程，低温敏感性的威廉蕉(Musa sp.)低温处理后POD活性甚至下调[35]。本试验中，低温处理早期AdPOD27表达量和POD活性整体水平大幅度上调，而AdPOD64表达量并未发生显著变化，进一步验证并非所有POD家族成员都能响应低温诱导。此外，处理中后期AdPOD27表达量和POD活性均下降，与王允等[26]的研究结果相似。因此，POD同工酶参与了猕猴桃低温贮藏早期的抗冷作用，然而这种响应机制只在部分家族成员中发挥调控。
本研究中，25℃室温贮藏软化过程中，POD活性也显著提高，但只有AdPOD27略微上调表达。可见，这一过程可能存在这2个成员以外的其他POD同工酶编码基因发生了转录水平改变。此外，试验中所有处理的AdPOD27表达量均高于AdPOD64, 说明AdPOD27可能在猕猴桃果实软化、低温响应和ABA诱导等过程中发挥比AdPOD64更为重要的调控功能。
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