2018, Vol. 26
蔗糖合成酶(sucrose synthase, SuSy)是植物体内蔗糖代谢的重要调控酶，不仅参与调控蔗糖代谢，而且能够影响细胞分化和细胞壁的形成，为细胞壁的合成提供底物[1-3]。纤维素合成的直接底物是尿苷二磷酸-D-葡萄糖(UDPG)，在多个酶和基因的调控下，SuSy催化蔗糖和UDP生成UDPG，所以SuSy影响纤维素合成[4-5]。有研究表明，SuSy参与植物韧皮部的代谢、木纤维细胞分化等[6-10]。SuSy基因对增加棉花(Gossypium spp.)、烟草(Nicotiana tabacum)和杨树(Populus sp.)中纤维素含量、纤维长度、提高纤维强度至关重要，抑制SuSy基因的表达, 会降低棉花纤维质量[11-13]。
SuSy基因广泛存在于高等植物中，Cardini等首次从小麦(Triticum aestivum)中克隆了SuSy基因[14], 此后从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花、马铃薯(Solanum tuberosum)、胡萝卜(Daucus carota)、玉米(Zea mays)、柑橘(Citrus reticulata)、水稻(Oryza sativa)、枣(Ziziphus jujuba)、甘蔗(Saccharum offici- narum)等植物中获得SuSy基因[15-21]。但关于巨桉SuSy基因方面的研究鲜见报道[22]。
桉树(Eucalyptus sp.)作为三大速生材树种之一，是重要的制浆造纸原料，具有成为新型生物质能源树种的潜力[23-24]。巨桉(E. grandis)原产于澳大利亚东部沿海地区，作为我国优质的速生用材林树种，现已大面积种植[25]。目前，巨桉基因组测序已经完成[26]，为桉树分子生物学研究奠定了坚实的基础。本研究根据巨桉基因组测序结果，利用生物信息学方法系统研究了SuSy基因家族成员的序列信息，主要包括EgrSuSy基因家族成员的染色体分布、亚细胞定位、信号肽预测、基因和蛋白质结构、表达模式和进化分析等，为深入研究巨桉纤维素代谢通路的分子机制和EgrSuSy在巨桉木材形成中的作用提供提供科学依据。
1 材料和方法 1.1 SuSy家族基因序列的提取巨桉、毛果杨、拟南芥、玉米和水稻SuSy基因家族成员基因序列信息于2017年11月下载于Phytozome (http://www.phytozome.net)、美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
1.2 EgrSuSy家族基本特征和亚细胞定位分析利用ExPASy中的ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析EgrSuSy的相对分子质量、理论等电点、不稳定系数、亲水性指数和脂溶性指数; 采用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测EgrSuSy家族蛋白的信号肽；采用WoLF PSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html)预测EgrSuSy家族蛋白的亚细胞定位。
1.3 EgrSuSy家族基因结构和蛋白质结构分析利用GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因的CDS序列和全基因组序列；利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白序列二级结构; 利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive#sequence)分析蛋白序列3D结构。
1.4 EgrSuSy的进化学分析利用ClustalW软件比对分析EgrSuSy家族蛋白氨基酸序列同毛果杨、拟南芥、玉米以及水稻的SuSy家族蛋白氨基酸序列，参数为默认值；用MEGA 6.0中的邻接(Neighbor-Joining)算法绘制系统进化树，用重复1 000次的bootstrap进行检验。
1.5 EgrSuSy的表达分析EgrSuSy在未成熟木质部、成熟叶片、韧皮部、茎尖、木质部和幼叶的转录组数据下载于Phytozome (http://www.phytozome.net)。用EgrSuSy基因的FPKM值表示基因的表达丰度，以Log2的对数绘制基因表达热图。
2 结果和分析 2.1 EgrSuSy基因家族鉴定与理化特征分析从Phytozome与NCBI数据库中筛选出18条EgrSuSy基因序列，分别命名为EgrSuSy1~EgrSuSy18, 分布在7条染色体上，其中6个SuSy基因位于3号染色体上(表 1)。EgrSuSy基因编码405~2 351个氨基酸，编码氨基酸序列最长的是EgrSuSy15，相对分子量最大，为274.762 kD；EgrSuSy3的相对分子量最小，为46.931 kD。18个EgrSuSy蛋白的理论等电点为5.27~9.12，EgrSuSy10、EgrSuSy15为碱性蛋白，其余均为酸性蛋白。EgrSuSy11的不稳定系数最小，为27.39。根据亲水性系数可知, EgrSuSy基因家族编码的蛋白均为亲水蛋白, EgrSuSy的脂溶指数为81.88~96.38，EgrSuSy蛋白定位在细胞质膜上，且EgrSuSy1~EgrSuSy18均不存在信号肽。
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表 1 EgrSuSy基因家族成员的基本信息 Table 1 Informations of EgrSuSy gene family |
EgrSuSy家族成员的基因结构中均含有内含子、外显子(图 1)，但各成员仍有明显的差异，表现在外显子、内含子的数量和位置不同。EgrSuSy15的外显子数量最多(25个)，EgrSuSy3的最少(8个)。
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图 1 EgrSuSy的基因结构 Fig. 1 Structures of EgrSuSy genes |
对EgrSuSy基因家族18条蛋白的二级结构的预测结果表明，EgrSuSy蛋白由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲、β-转角组成。EgrSuSy蛋白的α-螺旋比例最高，其次为无规则卷曲(表 2)。
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表 2 EgrSuSy的二级结构分析 Table 2 Second structures of EgrSuSy proteins |
由图 2可知，EgrSuSy蛋白的3D结构由多个螺旋、延伸链和转角组成。SWISS-MODEL结果表明，EgrSuSy蛋白的3D结构与拟南芥的相似性较高，达85.69%，且EgrSuSy2、EgrSuSy4、EgrSuSy5、EgrSuSy6、EgrSuSy8、EgrSuSy9、EgrSuSy12、EgrSuSy16、EgrSuSy17和EgrSuSy18的3D结构相似，EgrSuSy1和EgrSuSy11相似，均为四聚体结构。
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图 2 EgrSuSy蛋白的3D结构 Fig. 2 3D structures off EgrSuSy proteins |
构建基于SuSy蛋白的系统进化树(图 3)，结果表明，EgrSuSy同毛果杨的进化关系最近。同时, EgrSuSy5、EgrSuSy6、EgrSuSy13、EgrSuSy9、EgrSuSy4、EgrSuSy14、EgrSuSy2、EgrSuSy1和EgrSuSy11的进化关系极为相近，EgrSuSy15和EgrSuSy10相近，EgrSuSy8和EgrSuSy12相近, EgrSuSy1、EgrSuSy2、EgrSuSy5、EgrSuSy6、EgrSuSy9和EgrSuSy14相近。
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图 3 基于SuSy蛋白构建的系统进化树。Egr:巨桉; Potri:毛果杨; AT:拟南芥; Zm:玉米; LOC:水稻。 Fig. 3 Phylogenetic tree based on proteins of SuSy. Egr: Eucalyptus grandis; Potri: Populus trichocarpa; AT: Arabidopsis thaliana; Zm: Zea mays; LOC: Oryza sativa. |
从基因表达谱热图(图 4)可以看出，EgrSuSy基因在巨桉的未成熟木质部、成熟叶片、韧皮部、茎尖、木质部和幼叶中的表达不同。EgrSuSy2、EgrSuSy3、EgrSuSy4、EgrSuSy7、EgrSuSy8和EgrSuSy10在这些组织中的表达量相对较高, EgrSuSy2、EgrSuSy3、EgrSuSy4和EgrSuSy8在未成熟木质部、韧皮部、木质部的表达量相对较高, 可能与巨桉的纤维素代谢有关。EgrSuSy5、EgrSuSy6、EgrSuSy12、EgrSuSy13、EgrSuSy15和EgrSuSy16在这些组织中的表达均较低。EgrSuSy基因成员在不同组织中的表达差异，说明它们在巨桉不同组织、发育时期的功能存在差异。
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图 4 EgrSuSy基因在巨桉不同组织中的表达 Fig. 4 Expression of EgrSuSy in different tissues of Eucalyptus grandis |
SuSy是植物蔗糖代谢中的关键调节酶，在细胞生长分化的相关调控和结构组成中具有重要的功能[27]，在淀粉和纤维素的合成等过程中发挥重要作用[23, 28]。SuSy的活性与纤维素合成有关，主要是参与调节细胞壁的构建以及细胞发育[9, 13]。
本研究分析了EgrSuSy家族成员的生物学基本信息，为深入研究EgrSuSy基因功能、揭示SuSy在巨桉中的生物学功能和了解桉树纤维素代谢奠定基础。拟南芥SuSy1是由2个对称的四聚体组成[29-30]，本研究表明，EgrSuSy家族成员多为四聚体结构。在大麦、黄瓜中，SuSy定位在细胞质和质膜中，SuSy以可溶性形式存在于细胞质中，亦可结合在质膜上，因存在形式不同而行使不同的功能; 当其结合在质膜上时，为纤维素、胼胝质合成提供前体物质[31]。本研究表明，EgrSuSy定位在细胞质膜上，其具体功能还有待进一步研究。
本研究分析了巨桉与毛果杨、玉米、水稻和拟南芥SuSy基因家族间的进化关系，结果表明，巨桉和毛果杨的SuSy基因同源性较高，表明毛果杨和巨桉的SuSy家族在生物学功能、生长调控机制上存在相似性。结构分析与进化分析表明, EgrSuSy15、EgrSuSy10结构相似、进化关系相近，EgrSuSy8、EgrSuSy12亦结构相似、进化关系相近，故可推测其功能相似。
植物在不同的生长发育阶段和不同器官中，蔗糖合成酶基因表达具有时间和空间的差异。海岛棉(Gossypium barbadense)的SuSy基因在花和果柄中的表达较高，而在根和果实中的表达普遍偏低，海岛棉SuSy3A基因在纤维次生壁加厚初期起作用，而SuSy1A、SuSy1D基因作用于纤维次生壁加厚后期和末期[32]。本研究中，EgrSuSy基因家族在不同组织中的差异表达，说明它们在巨桉不同组织、发育时期的功能存在差异。EgrSuSy2、EgrSuSy3、EgrSuSy4、EgrSuSy8在未成熟的木质部、韧皮部、木质部的表达量较高，推测这些成员的功能与巨桉纤维素代谢相关。EgrSuSy2、EgrSuSy3、EgrSuSy4、EgrSuSy7、EgrSuSy8和EgrSuSy10在6个组织中的表达量相对较高，说明这些基因有可能参与了巨桉各组织的生长和代谢过程。
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