木豆[Cajanus cajan (Linn.) Millsp.]为豆科(Legu- minosae)木豆属多年生灌木，是重要的木本粮食作物，也是一种重要的药用植物^[1]。木豆叶富含多种生物活性功能成分，如具有抗骨质疏松作用的芪类和黄酮类成分^[2-4]。木豆叶的营养价值也极高, 木豆叶中含有多种微量元素、蛋白质、糖、维生素、淀粉、纤维、氨基酸等成分^[5-6]。木豆叶因其富含氨基酸和蛋白质，现主要用于牲畜饲料的开发^[7]以及木豆叶保健茶的制作^[8]。氨基酸是茶叶鲜爽味的主要物质，是决定茶叶品质的重要生物活性成分。不同的氨基酸成分和组成比例，是构建不同茶叶滋味与品质的关键因素，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸等的含量与茶叶的品质呈显著正相关^[9]。而氨基酸的组成和含量又与茶叶的品种、采收季节、叶龄、栽培条件等因素相关^[10]。

目前关于木豆叶氨基酸含量的研究报道较少, 而对其他作物叶片氨基酸含量的研究较多。研究表明，叶片的发育对其氨基酸含量有影响。符云鹏等对烤烟叶片发育过程中氨基酸含量变化的研究发现，叶龄与烤烟叶片氨基酸含量呈显著负相关，随着叶龄的增长，烤烟叶片氨基酸含量降低显著^[11]。赵志宏等的研究表明，沙芥叶片中氨基酸含量随着叶龄的增长呈先上升后下降的变化趋势，以8片叶龄时的氨基酸含量最高^[12]。因此，研究叶龄对木豆叶氨基酸含量的影响，为指导木豆叶的合理采收具有重要意义。生产上一般以采收3片叶以内的叶片用于茶叶的制作^[13]，高于3片叶的叶片因粗纤维含量相对较高，在茶叶的揉捻工艺中不易于茶叶的成型。因此，在本研究中以1~3叶龄的木豆叶作为研究对象。

种质资源是品种选育的物质基础，木豆种质资源与品质性状间的相关性也是当前研究的热点方向之一。陈燕华等^[14]的研究表明，木豆种子中可溶性糖含量与淀粉含量呈正相关，叶片中蛋白质含量与水分含量、可溶性糖含量与单宁含量呈显著正相关。罗高玲等^[15]对6份早、中熟组木豆杂交种进行了品质性状分析，表明早熟组杂交种的粗蛋白、无氮浸出物等品质性状指标高于对照品种。总黄酮是木豆叶中的重要活性成分，是评价木豆叶质量的重要指标之一。郑菲艳等^[16]对131个木豆品种叶片总黄酮含量的研究表明，木豆叶总黄酮含量在品种间存在极显著差异。蛋白质作为木豆叶中的重要营养成分，也是木豆品种选育的重要指标之一。刘秀贤等^[17]对云南22个木豆品种叶中蛋白质含量的研究表明，蛋白质含量在品种间有显著差异。氨基酸是构成蛋白质的重要组成部分，目前对木豆品种与氨基酸含量的相关性研究还未见报道。本文对19个种质资源和1~3叶龄的木豆叶中的氨基酸含量进行分析，了解种质资源与叶龄对木豆叶氨基酸组成和含量的影响并进行聚类分析，为挖掘优异木豆种质资源，开发保健茶和提高茶的品质提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 材料

2015年8月于福建省农业科学院作物研究所福州埔垱试验基地，采集19个种质资源1~3叶龄的木豆叶片。当木豆苗长至3片叶时，以顶端展开的叶片为1叶龄叶片，依次往下数第二片为2叶龄, 第三片为3叶龄，分别进行采集。木豆叶片经60℃干燥至恒重，粉碎，过120目筛，保存备用。

1.2 实验仪器和试剂

menbarPureA300全自动氨基酸分析仪，men- barPure脱酸设备，BSA124S电子分析天平。硫酸铜、硫酸钾、硫酸、氢氧化钠、硼酸、辛醇、盐酸等均为分析纯(AR级)，100 nmol mL^–1的混合氨基酸标准液、样品稀释液、流动相、茚三酮染色剂、缓冲液均由德国menbarPure公司生产。

1.3 方法

采用酸水解(常规水解法)。按GB/T 18246-2000方法，精密称取木豆叶粉末0.2 g置于顶空瓶中, 加入1:1盐酸10 mL，将顶空瓶置于110℃烘箱中恒温水解24 h。水解完成后，待顶空瓶自然冷却，定容至50 mL，吸取样品1 mL置于浓缩管中，将浓缩管置于试管浓缩仪中于60℃下脱酸至浓缩管中无液体。脱酸完成后，取出浓缩管冷却至室温，加入1 mL pH 2.2柠檬酸钠缓冲液稀释，摇晃，混合均匀，用注射器吸取混合液，经0.22 μm过滤器过滤后置于分析瓶中，上机分析。

工作条件：色谱柱为阳离子交换树脂钠盐分离柱，色谱柱工作温度40℃，Eluent Press为7~10 MPa, Reagent Press值为0.7~3 MPa。

检测器：可见光光度检测，570 nm/440 nm。

1.4 数据分析

每个样品重复测定3次，采用氨基酸分析仪自带软件处理数据。氨基酸含量以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0软件对数据进行多重比较检验。

2 结果和分析 2.1 木豆叶的氨基酸含量 2.1.1 必需氨基酸含量的变化

随着木豆叶龄的增加，叶片中必须氨基酸含量呈逐渐上升趋势(表 1)，表明木豆叶氨基酸含量是随着叶片的发育成熟而逐渐累积的。从木豆叶中检测到7种必需氨基酸，除蛋氨酸含量随着叶龄增长变化不明显，以及赖氨酸含量总体呈下降趋势外，其余氨基酸含量总体呈上升趋势。3个叶龄叶片中均以苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸的含量较高，表明这3种氨基酸是构成木豆叶必需氨基酸的主要成分。

不同木豆种质资源叶片中苏氨酸含量在3个叶龄间的差异大都显著，分别为0.21%~0.87%、0.41%~ 0.78%、0.66%~0.87%。在木豆叶片的发育过程中，除M02-2-4和M02-2-6外，其余17个种质资源的苏氨酸含量均随叶龄的增加呈上升趋势，其中M02-18的苏氨酸含量在3个叶龄期均较高，分别为0.61%、0.78%和0.87%；M01-4在3个叶龄的苏氨酸含量变化幅度最大，从1叶龄到3叶龄的增幅达276.19%。

除M02-2-1的缬氨酸含量随叶龄的增长呈下降趋势外，其余18个木豆种质资源的缬氨酸含量均呈缓慢上升趋势，但各种质资源不同叶龄叶片的缬氨酸含量均较低，变化幅度不太明显。19个木豆种质资源3个叶龄叶片蛋氨酸含量为0.01%~0.03%, 没有显著的变化。

异亮氨酸和苏氨酸一样，也是木豆叶中含量较高的一种必需氨基酸。M02-2、M02-4、M02-18的异亮氨酸含量随叶龄的增长呈下降趋势，M02-7呈先上升后下降趋势，其余大多数资源呈上升趋势。其中以M02-2的异亮氨酸含量在3个叶龄期均较高，分别为0.91%、0.86%和0.82%；M01-2的异亮氨酸含量在3个叶龄期增长幅度最大，1叶龄到3叶龄的增幅达212.00%。

不同木豆种质资源叶片的亮氨酸含量较低，大部分资源不同叶龄间的差异不显著。M02-7、M02-12、M02-17的亮氨酸含量随叶片发育逐渐减少, M02-2-1和M02-21的变化规律不明显，其他资源的亮氨酸含量随叶龄的增加而逐渐上升。木豆叶片的苯丙氨酸含量水平与亮氨酸相近，M01-2、M01-4、M02-7、M02-13、M02-17-4、M02-20和M02-21的苯丙氨酸含量随叶龄的增加而减少，其他种质资源的苯丙氨酸含量则升高。因此，大部分木豆种质资源叶的苯丙氨酸含量随叶龄的增加呈上升趋势。

木豆叶片的赖氨酸含量水平也较高，与苏氨酸、异亮氨酸相近，且随叶龄的增加而下降。除M02-2-6、M02-6、M02-13和M02-18的赖氨酸含量随叶片的成熟呈上升趋势外，其余资源均呈下降趋势，其中以M02-17-4的赖氨酸含量下降幅度最大，从1叶龄到3叶龄的降幅达45.88%。

2.1.2 非必需氨基酸含量的变化

木豆不同叶龄叶片的10种非必需氨基酸中, 除甘氨酸、丙氨酸含量随叶龄增长总体呈下降趋势外，其余氨基酸含量总体呈上升趋势(表 2)。3个叶龄叶片中均以丝氨酸、酪氨酸、组氨酸含量较高, 说明这3种氨基酸是构成木豆叶非必需氨基酸的主要成分。

大部分木豆种质资源叶片的丝氨酸、酪氨酸和组氨酸含量在不同叶龄间差异显著，这3种氨基酸含量在大多数木豆种质资源中均随叶龄的增长而上升，而M02-6的丝氨酸含量则下降，M02-8、M02-12、M02-17-4、M02-18和M02-21的酪氨酸含量也下降。M02-4的丝氨酸含量在3个叶龄期均较高，分别为0.83%、0.89%和0.92%；M02-6的酪氨酸含量在3个叶龄期较高，分别为0.64%、0.79%和0.81%；而组氨酸含量以M01-4较高，3个叶龄期分别为0.66%、0.75%和0.81%。可见，这3个木豆种质资源具备进一步培育筛选高氨基酸品种的潜质。

至于天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、精氨酸和脯氨酸这7种非必需氨基酸，虽然他们的含量较低，但却在木豆叶的营养成分中起着不可或缺的作用，是构成木豆叶蛋白的重要物质基础。除M02-17-4和M02-18的谷氨酸含量，M01-2、M01-4、M02-13、M02-18和M02-20的甘氨酸含量，M02-8、M02-12、M02-17-4、M02-18和M02-21的胱氨酸含量，M02-2、M02-2-1、M02-6、M02-8和M02-13的精氨酸含量随叶片的成熟呈下降趋势外，其余资源均随叶龄的增加而逐渐上升。丙氨酸是所有种质资源木豆叶中随叶龄增加而含量下降的非必需氨基酸，但下降幅度很小，从1叶龄到3叶龄仅相差0.02%~0.08%。

甘氨酸是一种具有独特甜味的氨基酸，能缓和酸、碱味，掩盖苦涩味，可增加茶叶的甜味口感。19个木豆种质资源中有11个的甘氨酸含量从2叶龄到3叶龄的增长明显，增幅达50.00%~245.45%，其中9个种质资源的3叶龄叶片甘氨酸含量在0.30%以上。因此，3叶龄的叶片有助于木豆叶茶口感的改善，提高适口性。

2.2 叶片总氨基酸含量的变化

由图 1可知，1~3叶龄木豆叶片的总氨基酸含量为5.18%~6.40%。种质资源不同，总氨基酸含量也不同，其中M05-2总氨基酸含量在各叶龄期都较高。M02-13在1叶龄和2叶龄期含量最低, M02-17-4在3叶龄期含量最低。

木豆叶片中总氨基酸含量的差异，对木豆茶叶的品质有着重要的影响。19个木豆种质资源叶片中的总氨基酸含量随叶龄的增加均表现为上升趋势, 以M05-2的上升趋势最为明显。

2.3 聚类分析

本研究选用17种氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、总氨基酸含量共20个指标进行聚类分析(图 2)。结果表明，在欧式遗传距离为5.0时，19个供试木豆种质资源可划分为4大类(表 3)。

低氨基酸型(Ⅰ)：有M02-8、M02-10、M02-2-4、M02-2、M02-17-4和M02-13共6个种质资源，氨基酸含量较低，必需氨基酸含量为(2.38±0.12)%, 非必需氨基酸含量为(2.99±0.13)%，总氨基酸含量为(5.37±0.13)%，叶片中各种氨基酸和总氨基酸含量均较低，总体营养价值偏低。

中氨基酸型(Ⅱ)：有M01-2、M01-4、M02-12、M02-21、M02-2-1和M02-17共6个种质资源，表现为组氨酸含量高，达(0.51±0.12)%，必需氨基酸含量为(2.14±0.07)%，非必需氨基酸含量为(3.31± 0.10)%，总氨基酸含量为(5.44±0.07)%，叶片中富含组氨酸，总氨基酸含量中等，总体营养价值中等。

中高氨基酸型(Ⅲ)：有M02-18、M02-20、M02- 2-6、M02-6和M02-7共5个种质资源，表现为苏氨酸含量高, 达(0.72±0.06)%，必需氨基酸含量为(2.29±0.11)%，非必需氨基酸含量为(3.48±0.12)%, 总氨基酸含量为(5.77±0.06)%，叶片中富含苏氨酸，非必需氨基酸和总氨基酸含量均较高，总体营养价值较高。

高氨基酸型(Ⅳ)：有M02-4和M05-2两个种质资源，表现为丝氨酸、甘氨酸和精氨酸含量高，分别为(0.87±0.02)%、(0.26±0.08)%和(0.56±0.03)%, 必需氨基酸含量为(2.33±0.06)%，非必需氨基酸含量为(3.96±0.21)%，总氨基酸含量为(6.30±0.15)%, 叶片中富含各种氨基酸，非必需氨基酸和总氨基酸含量最高，必需氨基酸含量也较高, 总体营养价值高。

3 讨论和结论 3.1 木豆叶的营养价值评价

不同种质资源和不同叶龄木豆叶中均含有17种氨基酸，7种必需氨基酸占总氨基酸含量的40.80%，达到了FAO/WHO提出的理想蛋白质标准(必须氨基酸含量/氨基酸总含量为40%)，表明木豆叶片可作为优质的营养食品原料。苏氨酸、异亮氨酸和赖氨酸是木豆叶片中必需氨基酸的主要成分, 且对人体具有重要的生理作用，是木豆叶发挥营养作用的重要成分，苏氨酸和异亮氨酸含量均以3叶龄叶片最高。木豆叶中主要的3种非必需氨基酸成分丝氨酸、酪氨酸和组氨酸含量均以3叶龄叶片最高，其他氨基酸组分也是在3叶龄期最高。随叶龄的增长，粗纤维的增加使茶叶的制作在揉捻工艺中不易于茶叶的成型。因此，考虑到人工采摘的因素，提高效率，应选择1~3叶龄的木豆叶作为茶叶的加工原料，既可以充分保留木豆叶中的大部分氨基酸组分，也利于茶叶的制作成型。

3.2 种质资源对木豆叶茶的影响

氨基酸含量对茶叶香气的鲜爽度和茶汤滋味的鲜醇度有重要的影响，叶片中的高氨基酸含量可使木豆叶茶表现出较好的鲜爽风味。M05-2资源1~3叶龄叶片的总氨基酸含量最高，且甘氨酸含量也最高，尤其是2叶龄和3叶龄叶片。甘氨酸是具有独特甜味，能缓和酸、碱味，掩盖苦味的氨基酸。因此，该资源作为木豆叶茶材料，不仅营养丰富而且甜味增强，口感良好，是制作木豆叶茶的良好品种。

3.3 氨基酸对木豆叶茶泡制的影响

木豆叶中大多数氨基酸成分易溶于水，在茶叶的泡制过程中可以快速溶解到水中。但谷氨酸和苏氨酸不易溶于冷水，易溶于热水。在茶叶的泡制过程中宜选用温度较高的开水冲泡，以促进谷氨酸和含量较高的苏氨酸溶出。亮氨酸、酪氨酸和胱氨酸在水中的溶解度较低，在热水中也不易溶解，但在酸水中极易溶解。因此，在木豆叶茶中适当添加枸杞，通过枸杞中的枸橼酸来增加水溶液的酸性，以促进这类氨基酸的溶出，增加茶汤的风味。

3.4 聚类分析

本研究以17种氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸含量共20个指标进行聚类分析，结果表明，19个木豆种质资源可划分为4大类型:低氨基酸型(Ⅰ)、中氨基酸型(Ⅱ)、中高氨基酸型(Ⅲ)和高氨基酸型(Ⅳ)。其中高氨基酸型(Ⅳ)木豆资源M02-4和M05-2的叶片富含各种氨基酸，总氨基酸含量最高，营养价值最高，可作为高氨基酸含量的种质资源选育木豆新品种。

综上所述，木豆叶片中氨基酸种类丰富，必需氨基酸含量高，营养价值高，作为木豆叶茶开发具有良好的应用前景。在制作木豆叶茶时，应采摘1~3叶龄的木豆叶，有利于茶叶的制作成型和保证茶叶的品质。考虑到木豆叶茶中氨基酸组成的特性，可以在木豆叶茶中适当添加枸杞，选用开水冲泡，以提高茶汤的营养，增加茶汤的风味。不同种质资源木豆叶片的氨基酸含量有一定差异，选择优良种质资源进行育种和开发是未来的研究重点方向。在本研究中，M02-4和M05-2是潜在的具有高氨基酸含量的种质资源，可作为目标性状资源进一步观察, 为高氨基酸含量木豆品种选育提供优良材料。