角毛藻属(Chaetoceros Ehrenberg)物种广泛分布于全球各类水体^[1-2]，某些物种还是重要的藻华生物^[3-4]。该属是硅藻门中物种多样性最为丰富的大属之一，目前已报道534个分类单位^[5]，但至少有一半被怀疑是同种异名^{[2, 6-7]}。

异角毛藻(C. diversus Cleve)和平滑角毛藻(C. laevis Leuduger-Fortmorel)是常见的近岸暖水种，两者的典型特征是：(1)链状群体短而直，窗孔窄甚至不可见；(2)存在粗大角毛；(3)角毛上具有螺旋排列的小刺及孔纹; 区别特征主要在于粗大角毛的延伸方向不同，异角毛藻的粗大角毛自壳面边缘生出后与链轴成45°角延伸，后平行于链轴，而平滑角毛藻的粗大角毛与链轴呈垂直方向延伸，后平行于链轴。其次, 两者的地理分布也有所不同，异角毛藻被认为是热带近岸种，而平滑角毛藻是热带大洋种^[8-10]。然而也有学者认为上述形态学差异细微, 地理分布差异也不明显，推测它们是同种异名^[11-12]。截止目前，关于异角毛藻和平滑角毛藻的分类学争论，还停留在单纯的形态学水平，未见分子生物学技术的引入，因此仍未能建立可信的结论。目前, 基于特异基因序列分析的分子分类学技术已被应用于藻类学研究，尤其是核糖体大亚基编码基因D1~D3区，在硅藻的分类学和系统学研究中得到较为广泛地应用和认可，极大促进了重要硅藻类群的分类学和系统学进展^[13-15]。

本文基于建立的单克隆培养藻株，结合生活史中形态特征的连续观察，以及基于目标基因的分子系统学方法，开展分类学和系统学工作，以期能够明确异角毛藻和平滑角毛藻的物种信息，澄清现存的分类学疑问。

1 材料和方法 1.1 样品采集

2017年5月利用浮游植物网(孔径10 μm)在广东省南澳岛附近海域进行水平拖网采集活体浮游植物样品。采集的水样尽快带回实验室进行目标藻株的分离、纯化。水体盐度为32‰，水温25℃。

1.2 单克隆培养株系的建立

根据目前认知的异角毛藻和平滑角毛藻的形态特征，在明美MI-12生物倒置显微镜下，利用毛细管分离法挑取单个藻细胞或单条链状群体，转移至48孔培养板中，以L培养液扩繁。确认其存活并开始繁殖之后，转移至100 mL三角瓶中培养。藻株培养条件为20℃、光/暗=12 h/12 h、光强50~ 80 μmol m^-2s^-1。本文共建立了7个单克隆培养株系: MC2613、MC2615、MC2661、MC2667、MC2668、MC2669和MC2677。

1.3 休眠孢子的诱导

吸取5 mL对数生长期的藻液，转移到100 mL三角瓶中，以L无氮培养液诱导休眠孢子。培养条件同上。每个藻株至少诱导3次以上，定期观察休眠孢子的产生。

1.4 形态学特征观察

光学显微镜(light microscope, LM)观察   取100 μL对数期藻株，在Olympus BX53显微镜下进行观察和拍照。

扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察   取1 mL对数期藻液，加入等体积浓硫酸，静置10 min以去除有机质，双蒸水多次水洗至中性^[16]。吸取适量样品，过滤至5 μm Milipore滤膜上，自然晾干后用碳导电胶贴于铜台上，喷金并置于扫描电镜(Zeiss Utras55, Germany)下观察和拍照。

透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察   样品的处理方法同上。吸取10 μL酸化样品，滴加在喷镀碳膜的微孔铜网上，自然晾干后，置于透射电镜(Philips Tecnai 10, Holland)下观察和拍照。

为避免室内培养环境对形态特征的影响，形态学观察在株系建立后的1个月内完成。

1.5 基于LSU nrDNA的分子系统学分析

离心法收集对数生长期藻细胞，提取总DNA, 扩增核糖体大亚基编码基因(large subunit ribosomal encoding gene, LSU)的D1~D3区序列^[14]。PCR产物送往深圳华大基因公司(BGI)进行纯化和测序。

在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)检索和下载形态相似种、遗传相似种的LSU序列。运用BioEdit软件进行序列的比对和矩阵^[17]，有774个碱基用于最终的分析。基于MrModeltest 2.3^[18]的计算，选择最适模型。利用RAxML-HPC2^[19]和MrBayes 3.2^[20]构建最大似然树(maximum likelihood, ML)和贝叶斯推理树(bayesian inference, BI)。ML分析的自检值(bootstrap test)为1 000, 以霍氏半管藻(Hemiaulus hauckii Grunow, EF423428)为外类群。

2 结果 2.1 基于形态特征的物种鉴定

利用LM和EM对7个分离藻株进行了形态学观察，并根据粗大角毛的延伸方向，可划分为两个类群。

类群Ⅰ：包括株系MC2613、MC2667和MC2669。细胞链短且直，窗孔窄甚至无。藻株分离初期，观察到链中角毛粗大，自壳面边缘生出后与链轴成45°角延伸，后平行于链轴。随着培养时间的延伸，有些粗大角毛与链轴几乎垂直延伸，然后平行于链轴。鉴于藻株建立初期的特征符合异角毛藻的原始描述^[21]，可鉴定为异角毛藻。

类群Ⅱ：包括MC2615、MC2661、MC2668和MC2677。细胞链短且直，窗孔窄甚至无。藻株分离初期，链中角毛粗大，先与链轴呈垂直方向延伸, 后逐渐平行于链轴。培养一段时间后，有些粗大角毛自壳面边缘生出后与链轴成45°角延伸，后平行于链轴。鉴于藻株建立初期的特征符合平滑角毛藻的原始描述^[22]，可鉴定为平滑角毛藻。

2.2 基于LSU nrDNA部分序列的分子系统学分析

基于LSU nrDNA D1~D3序列信息，分别构建了ML和BI系统进化树，两者具有相似的拓扑结构。最终用于分析的774个碱基中，异角毛藻株系(MC2613、MC2667和MC2669)与3个平滑角毛藻株系(MC2615、MC2668和MC2677)具有完全相同的碱基序列，另有1个平滑角毛藻株系(MC2661)存在2个差异碱基，均为C-T。系统树(图 1)显示异角毛藻与平滑角毛藻株系聚在同一分支上，具有相同的系统学位置，置信值较高(BPP=1.00, ML= 100)，表明本文建立的7个株系应该属于同一物种。

2.3 结合形态特征和分子系统的物种确认

结合形态特征和分子系统学结论，我们认为本文建立的7个单克隆培养株系具有高度同源的LSU nrDNA D1~D3序列，应该属于同一物种。

2.4 分类处理

异角毛藻(图 2: A~D, 3: A~I)

Chaetoceros diversus Cleve, 1873 Bihang till K Svenska Vet-Akad Handlingar., 1(11): 9, pl. 2, fig. 12 Cleve Synonym: Chaetoceros laevis Leuduger- Fortmorel 1892;郭玉洁和钱树本2003。

细胞链直, 常形成2~6个细胞的短链群体(图 2: A, B)，也有单细胞生活的情况(图 2: C)，细胞宽环面观呈矩形(图 2: B~D)。每个细胞含1个色素体(图 2: D)。壳套高度大于贯壳轴的二分之一(图 2: A, D), 分布有小孔(图 3: C)，基部有1圈凹槽(图 3: B, C)。相邻细胞之间的窗孔窄，甚至不可见(图 2: D), 常覆盖一层硅质膜(图 3: B)，中央平或有略微缢缩(图 3: A, B)。壳面观呈宽椭圆形或近圆形(图 3: E, F)，中央区域凸起。壳面散布有数量众多的小孔, 边缘有圆弧形肋纹(图 3: E)。壳面长轴两端有明显隆起，上生角毛。链端壳面近中央位置有一个唇形突，外管较短(图 3: D, E)，链中壳面则无唇形突(图 3: F)。壳面长轴8.95~11.11 μm，平均为(10.14±0.55) μm, 贯壳轴高6.03~10.74 μm，平均为(8.70±0.81) μm (n > 50)。

角毛分为3种类型：链端角毛、普通链中角毛和粗大链中角毛。链端角毛细微，延伸方向多变, 有时与链轴成45°角延伸(图 2: A，图 3: A)，有时略垂直于链轴(图 2: B, C)。链中角毛的延伸方向亦有变化，有时与链轴成45°角延伸(图 2: D, 图 3: A)，后平行于链轴(图 2: A)，也有垂直于链轴延伸(图 2: B)。链端角毛与普通链中角毛结构相似，分布有交替纵向排列的孔纹和小刺，孔纹呈长条形(图 3: H)，长0.07~0.13 μm，平均为(0.09±0.01) μm，密度为9.82~12.23 μm^-1，平均为(10.89±0.61) μm^-1。粗大的链中角毛硅质化重，在弯曲部分最粗，末端尖细如镰刀状。角毛上均分布有交替纵向排列的孔纹和小刺，每两行小刺之间有一条凹沟，凹沟上有成排的小孔和零散分布的大孔(图 3: I)，大孔纹呈椭圆形，两大孔之间的距离为1.15~5.22 μm，平均为(2.92± 1.24) μm，小孔卵圆形，密度为9.88~11.47 μm^-1, 平均为(10.49±0.47) μm^-1 (图 3: I)。环带上分布有肋纹(图 3: G)。

未见休眠孢子。

分布：本文标本采集广东省南澳岛(5月)，山东、海南岛也曾有分布^[23]。本种还曾记录于大西洋^[11]、南墨西哥湾^[12]、北美西部沿岸^[8]、日本海^[24]、韩国^[25]、印度洋^[26]。

3 讨论 3.1 异角毛藻和平滑角毛藻的分类学争议

以往关于异角毛藻和平滑角毛藻的分类学争议，集中体现在对于粗大角毛延伸方向的分类学赋值。有学者认为粗大角毛延伸方向是稳定特征，具有分类学意义，故认为异角毛藻和平滑角毛藻是独立的物种^{[8-10, 24]}。也有学者认为粗大角毛延伸方向受环境、生活史等因素影响，是不稳定特征，因此认为平滑角毛藻应该是异角毛藻的同种异名^[11]。Moreno等^[12]曾详细地研究了异角毛藻和平滑角毛藻的形态学特征，认为粗大角毛的延伸方向存在变化的情况，认为平滑角毛藻应该是异角毛藻的同种异名。但是该研究仅局限于形态学方法，并不能建立可信的结论，因此未被广泛接受。

本文基于培养株系生活史的连续观察，也发现平滑角毛藻株系(MC2615和MC2668)的粗大角毛延伸方向存在变化，甚至在同一个株系中，有些粗大角毛壳面边缘生出后与链轴成45°角延伸，后平行于链轴(图 2: A, 图 3: A)，也有部分粗大角毛自壳面边缘生出后垂直于链轴，后平行于链轴(图 2: B, C)。较细链中角毛和端角毛的延伸方向也存在变化的情况。这些表明角毛延伸方向是不稳定的，因此角毛延伸方向不宜作为分类学特征。与此同时，基于核糖体大亚基基因D1~D3区的序列分析表明, 异角毛藻和平滑角毛藻株系具有完全一致的碱基信息，仅有1个平滑角毛藻株系(MC2661)存在2个差异碱基。分子系统树也显示它们具有相同的系统学位置，也支持它们是同一物种。

金德祥等^[9]曾认为异角毛藻和平滑角毛藻粗大角毛的末端形态也有不同，前者粗大角毛的末端呈镰刀型，弯曲处最宽，而后者粗大角毛尖细呈圆形，未见明显最宽处，这一特征在作者手绘图中有清晰展示(loc. cit.图 112)。然而在其他学者的研究中, 这一特征未再有报道，普遍认为两者粗大角毛末端形态是一致的，弯曲处最为宽大，呈镰刀型，本文亦支持这一观点。

除了上述形态学差异之外，不同的地理分布区域也曾被用来支持他们是独立物种。以往认知中, 认为异角毛藻属于热带近海种，多分布于东海的福建沿海及南海的广东北部湾，此外，欧洲北海和地中海及黑海、印度尼西亚的爪哇、浙江舟山群岛、台湾海峡、日本沿海也有报道。而平滑角毛藻被认为是热带大洋种，曾报道于南海的海南岛和东海的外海区，以及韩国南部，日本海，爪哇海和美国加利福尼亚海域^[8-10]。其次，在东海(厦门一带)仅见到异角毛藻，而南海南的海南岛一带常见到平滑角毛藻，却少见异角毛藻^[8-10]。然而通过查阅文献, 印度、加拿大、北美等远洋海域也曾报道过异角毛藻^[26]。异角毛藻和平滑角毛藻分布广泛，在分布区域上也有交叉，本研究也在南澳岛同时采集到异角毛藻和平滑角毛藻。另外，粗大角毛的延伸方向易受水温等环境因素的影响, 或多或少也误导了以往研究的鉴定结果。

3.2 角毛特征的分类学探讨

角毛是角毛藻属的标志特征，被赋予重要的分类学价值^{[2, 6, 27]}。然而作为具有三维复合形态的重要结构，角毛各个特征的分类学价值各不相同。以往研究中，对于角毛各个特征分类学价值的认定差异，也导致了诸多分类学争议。在光镜时代，由于能够观察到的特征有限，角毛延伸方向与链轴的关系、角毛基部与壳面的关系等，都被作为重要特征。如粗大角毛的延伸方向被认为是异角毛藻和平滑角毛藻的区分依据^{[8-10, 25]}，相邻角毛基部是否存在并行融合被认为是并基角毛藻(C. decipiens Cleve)和洛氏角毛藻(C. lorenzianus Grunow)的重要区别依据^{[2, 28]}。然而近年研究表明某些角毛特征的多变和不稳定，如扁面角毛藻(C. compressus Lauder)的角毛延伸方向，有时呈Brunel Ⅱ型，有时呈Brunel Ⅲ型^{[13, 29]}，并基角毛藻的相邻角毛基部，有时融合并行一段距离，有时则无此特征^[30]，本研究也观察到异角毛藻粗大角毛延伸方向的变化。这些均证实了角毛延伸方向、基部融合等特征的不稳定性，不宜继续赋予分类学意义。

另一方面，随着电镜技术的广泛应用，能够观察到角毛上的超微结构，如刺和孔的形状、排列方式，以及角毛横截面等，近年研究认为，角毛的这些超微特征是稳定的，可赋予重要的分类学价值^{[13, 25, 30]}。本文两个类群的超微结构极为相似，如链端角毛和链中角毛上均分布有交替纵向排列的孔纹和小刺，且孔纹呈长条形。两个类群的粗大角毛形态相似，在弯曲部分最粗，末端尖细如镰刀状。粗大角毛上分布有交替纵向排列的孔纹和小刺，每两行小刺之间有一条凹沟，凹沟上有成排的小孔和零散分布的大孔，大孔纹呈椭圆形，小孔卵圆形。相似的超微特征亦支持两个类群是同一物种。

3.3 异角毛藻的系统学划分

因为物种多样性丰富，角毛藻属被划分为3亚属(subgenus)、21个组(section)^[31-32]。Hernández- Becerril^{[2, 28]}基于形态学特征将异角毛藻列入异角组Diversa，然而在基于LSU nrDNA D1~D3序列构建的分子系统树中，异角毛藻与窄隙角毛藻(C. affinis Lauder)聚在一起，具有较高的置信值(BPP=1.00, ML=99)，而窄隙角毛藻属于窄隙组Stenocincta。Hernández-Becerril^{[2, 28]}归纳了窄隙组Stenocincta的形态学特征：(1)细胞链直；(2)单色素体；(3)端角毛宽U型，增粗或细小；(4)休眠孢子具刺。异角毛藻也具有这些特征，区别在于窄隙角毛藻的粗大角毛是链端角毛，而异角毛藻则为链中角毛；窄隙角毛藻的窗孔呈窄椭圆至披针形，而异角毛藻的窗孔窄，甚至不可见。分子系统学结论与形态学划分观点不一致，目前尚无定论，需要后续更多数据的补充。