橄榄[Canarium album (Lour.) Raeusch.]又称青果，为橄榄科(Burseraceae)橄榄属常绿乔木果树, 是我国热带亚热带地区特色名贵经济作物，在福建、广东、广西、云南、海南和台湾等南部地区均有种植。橄榄果实营养价值高，富含多酚、多糖、氨基酸、膳食纤维和矿质元素等多种药理活性物质，是广受欢迎的药食同源作物。然而，橄榄抗寒能力差，气温低于-2℃时叶片开始受冻，低于-2.7℃时末一级枝条受冻，而低于-3℃时末二级枝条受冻，因此通常认为-3℃是橄榄所能承受的极限临界低温^[1-2]。在我国南部橄榄种植区，尤其在福建省闽侯、闽清、尤溪、连江和上杭等地区均发生过橄榄大规模冻害，导致产量和种植面积锐减，成为制约橄榄产业稳定发展的重要限制因素^[3]。

CBF信号转导途径是植物感知和响应外界低温环境的关键信号通路, 当植物遭遇低温胁迫时, ICE1转录因子能够结合在CBF3启动子特定区域, 诱导CBF3大量表达，进而激活下游的抗寒关键基因COR上调表达以提高植物抗寒能力，在植物冷驯化和低温胁迫响应过程中发挥重要作用^[4-6]。此外，ICE1也是HOS1 (high expression of osmotically responsive gene 1)^[7]、SIZ1 (SAP and Miz 1)^[8]、OST1 (open stomata 1)^[9-10]、MAPK (mitogen-activated protein kinase)^[11-12]和精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase)^[13]等参与调节植物抗寒能力的桥梁，是植物抗寒调控网络的关键转录因子之一。目前，ICE1转录因子在白菜(Brassica campestris)^[14]、秋子梨(Pyrus ussuri- ensis)^[15]、番茄(Lycopersicon esculentum)^[16]和葡萄(Vitis amurensis)^[17]等作物抗寒过程中的调控功能和作用机理已有大量研究，而在橄榄上未见报道。本文以‘福榄1号’橄榄为材料，对其ICE1转录因子进行基因克隆和生物信息学分析，同时分析了CaICE1在组织器官和低温胁迫下的表达模式，为橄榄抗寒分子育种提供科学依据。

以福建省农业科学院果树研究所选育的橄榄鲜食品种‘福榄1号’[Canarium album (Lour.) Raeusch. ‘Fulan-1’]为材料。于2017年3月播种，同年7月选取长势健壮一致且无病虫害的幼苗分别置于-3℃、4℃和25℃下处理24 h，采集幼苗第3和4叶，置于液氮中速冻，保存于-80℃超低温冰箱中备用，每个处理重复3次。于2016年11月采集15年生‘福榄1号’橄榄成熟果肉和种子，于2017年5月上旬采集同一植株健康无损伤的根、茎、叶和花，液氮速冻后超低温保存备用。

采用植物多糖多酚试剂盒E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit (OMEGA bio-tek)分别提取橄榄根、茎、叶、花、果实和种子的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质量和浓度。将不同组织器官的总RNA等量混合，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录cDNA用于PCR扩增。以橄榄转录组数据为参考，通过序列预测和NCBI BLAST序列比对，选取CaICE1转录因子可能的cDNA序列，采用DNAMAN设计引物, 上游引物CaICE1-F：5′-CTCTCTCTTTTCCCAACAA- ACT-3′，下游引物CaICE1-R：5′-TCTACATCATGC- CATGGAAG-3′。PCR扩增体系包含2×TransTaq High Fidelity PCR SuperMix 12.5 μL，cDNA模板50 ng μL^–1，上下游引物各0.4 μmol L^–1，补足无菌ddH₂O至终体积25 μL。PCR反应程序为：预变性95℃ 4 min，变性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 75 s，共35个循环，延伸72℃ 10 min。扩增结束后，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行目的条带检测，采用EasyPure^® Quick Gel Extraction Kit进行胶回收，并将目的条带连接pEASY^® -T5 Zero Cloning Kit转化到Trans1-T1感受态细胞中，置于37℃恒温培养箱中培养12 h后挑取单克隆子进行PCR检测，选取阳性克隆子送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

采用生物信息学软件(表 1)对CaICE1转录因子的基本理化性质、结构、亲缘关系、密码子偏好性和调控miRNA等进行预测和分析。

表 1(Table 1)

表 1 CaICE1转录因子生物信息学分析 Table 1 Bioinformatic analysis of CaICE1 transcription factor 软件 Software 基本理化性质Basical physicochemical property ExPAsy Protparam：http://web.expasy.org/protparam/ 信号肽Signal peptide SignalP-4.1：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 蛋白质二级结构Secondary protein structure PredictProtein：https://www.predictprotein.org 磷酸化位点Phosphorylation site NetPhos 2.0：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ 亚细胞定位Subcellular localization PSORT Prediction：http://psort1.hgc.jp/form.html 保守结构域Conserved domain NCBI Conserved Domin Search：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi 蛋白质三维结构Three dimensional protein structure SWISS-MODEL：https://www.swissmodel.expasy.org 调控miRNA Regulatory miRNA psRNATarget：http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/ 密码子偏好性Codon bias EMBOSS：http://emboss.sourceforge.net/ 系统发育树Phylogenetic tree MEGA5.2.2

表 1 CaICE1转录因子生物信息学分析 Table 1 Bioinformatic analysis of CaICE1 transcription factor

分别提取不同温度处理后的橄榄的总RNA，检测合格后经TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removel; TransGen Biotech, Beijing)逆转录cDNA后用于qRT-PCR试验。以橄榄ACTB7和TUB5为内参基因^[18]，采用TransStart^® Top Green qPCR Super- Mix试剂盒对CaICE1的表达模式进行检测。将橄榄不同处理的cDNA样品进行等量混合，随后进行×10、×40、×160和×640梯度稀释用于绘制标准曲线，根据扩增效率筛选合适的退火温度。采用Eppendorf Realplex⁴荧光定量PCR仪检测样品中CaICE1的相对表达量。qRT-PCR扩增程序为：94℃预变性30 s；94℃变性10 s，退火15 s，72℃延伸10 s，循环40次；94℃保持15 s，60℃保持15 s, 再以0.11 ℃ s^–1速度升温至94℃保持15 s，绘制融解曲线。qRT-PCR反应体系为：2×TransStart^® Top Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL，上下游引物各0.2 μmol L^–1，模板0.5 μmol L^–1, 引物序列为CaICE1-qF: 5′-GGATGGAAGACAAA- GACGATG-3′和CaICE1-qR: 5′-TGTTGCTGCTGT- TGATGATG-3′。采用Excel 2003和SPSS 19.0进行数据统计和差异显著性分析。

根据橄榄转录组数据库筛选橄榄ICE1 cDNA序列并设计引物，使用RT-PCR法克隆CaICE1序列并进行测序验证。获得的cDNA序列为1 743 bp，其中开放阅读框(open reading frame，ORF)长度为1 650 bp，编码549个氨基酸，起始密码子和终止密码子分别为ATG和TAG (图 1, 2)。通过NCBI比对，CaICE1与枳(Citrus trifoliata)的ICE1氨基酸序列相似度达71%，表明所获得的序列为橄榄CaICE1基因，GenBank登录号为MG459422。

图 1(Fig. 1)

图 1 橄榄CaICE1的扩增。M: 5 000 bp Plus DNA Marker。 Fig. 1 Amplification of CaICE1. M: 5 000 bp Plus DNA Marker.

图 2(Fig. 2)

图 2 CaICE1的cDNA序列和推测的氨基酸序列。阴影和下划线分别表示HLH结构域和ACT_UUR-ACR-like。 Fig. 2 Sequences of CaICE1 and encoding amino acids. The shade and underline indicate HLH domain and ACT_UUR-ACR-like, respectively.

生物信息学分析结果表明，CaICE1有549个氨基酸，分子式为C₂₅₈₈H₄₁₁₅N₇₅₅O₈₅₀S₂₇，原子总数和分子量分别为8.335和60.272 kD，pI等电点为5.29，不稳定系数、脂肪系数和亲水性系数分别为48.62、73.15和-0.581，说明CaICE1为不稳定亲水酸性蛋白质，其中亮氨酸(Leu)和丝氨酸(Ser)含量最多，均占总数的10.4%。进一步分析表明，CaICE1可能定位于细胞核，不含信号肽，含有56个磷酸化位点(酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸磷酸化位点分别为3、14和39个)，此外含有2个由内向外和1个由外向内的跨膜螺旋，推测为跨膜蛋白。保守结构域预测表明，CaICE1包含有ICE1蛋白家族保守的螺旋-环-螺旋结构域(helix loop helix domain, HLH)和ACT保守域，能够特异结合具有调控酶活性的氨基酸或小配体(图 2)。此外，CaICE1存在α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种二级结构，比重分别占12.39%、6.01%和81.60%。SWISS-MODEL预测表明CaICE1三维结构与PDB5gnj.1.B相似度达到48.44% (图 3)。采用MEGA 5.2.2基于邻近归并法对物种间的ICE1进行聚类分析，除番木瓜(Carica papaya)和核桃(Juglans regia)外，总体上物种间的ICE1可分为4个大类(图 4), 其中橄榄的CaICE1与枳(Citrus trifo- liata)的ICE1亲缘关系最近，这说明物种间的ICE1存在多样性。

图 3(Fig. 3)

图 3 CaICE1的三维结构 Fig. 3 Three-dimensional structure of CaICE1

图 4(Fig. 4)

图 4 ICE1的系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree of ICE1

采用psRNATarget预测可能靶定CaICE1的miRNA，结果表明CaICE1可能与20个miRNA存在靶向关系，其中miR2938、miR6464、miR5537和miR437b的数学期望值为3.0，UPE均低于20, 是最可能调控CaICE1的miRNA (表 2)。从作用方式上看，这些miRNA对CaICE1的调控方式可能主要包括裂解和翻译抑制2类(均为10个)。

表 2(Table 2)

表 2 预测获得的靶向CaICE1的miRNA Table 2 Predicted miRNAs targeting CaICE1 miRNA 数学期望 Mathematical expect UPE 序列比对 Alignment 抑制方式 Inhibition type ath-miR2938 3.0 18.77 miRNA 21 GACCUUGGGAGAGUUUUCUAG 1 裂解Cleavage : : : : :... : : : : :. : : : : Target 1306 AAGGAACUUCUUCAAAGGAUC 1326 ptc-miR6464 3.0 16.10 miRNA 21 UAUUAUAGGUUGUUCGUUAGU 1 裂解Cleavage . : : : : : : :. : : : : :. : : : Target 1595 UAGAUAUCCAGCAAGCUGUCA 1615 rgl-miR5573 3.0 8.04 miRNA 21 AGGUAGAGUCCAGCUGAUGAG 1 翻译Translation : :. : : : : : : : : : : : : : :. Target 462 CCCGUCUCAGGUACACUACUU 482 ssp-miR437b 3.0 15.29 miRNA 21 UACAGUUUGAACAGAUUGAAA 1 裂解Cleavage : : : : : : : : : : : : :. : : : Target 915 UGGUCAAAGUUGUCAAAUUUU 935 aly-miR825-3p 3.5 13.59 miRNA 21 CAAGUACGUGGAAGAGCUCUU 1 裂解Cleavage : : : : : :. : : : : : : : : : : Target 34 CUUCUCUCACUUUCUCGAGAA 54 aqc-miR477d 3.5 17.17 miRNA 20 AUCUUCGGAAACUUCUUCUC 1 裂解Cleavage : : :. : : : : : : : : : : : : Target 859 AAGAGAGCUUUGAAGAAGAA 878 ath-miR5658 3.5 10.38 miRNA 21 AAAGUAGUAGUAGUAGUAGUA 1 裂解Cleavage : : : : : : : :. : : : : : : : Target 177 CAACAACAUCGUCAUCAUCAA 197 cre-miR9897-3p 3.5 19.39 miRNA 21 CGGCUAUUCUUCCUCGGCAUU 1 翻译Translation : : : : :. : : : : : : : : : : Target 1502 CAAGAGAAGGAAGAGCCGUAA 1522 ghr-miR7489 3.5 7.09 miRNA 24 UGCAAGAGGACAUAACCGUUGUUA 1 翻译Translation : : : : : : : :. : : : : : : : : : Target 433 CCAUCCUCCUCUGUUUUCAACAAU 456 gra-miR8743c 3.5 17.79 miRNA 24 UACUGGUAAAACAUUGAAAAGUAU 1 翻译Translation . : :. : : : : : : : :. : : : : :. :. Target 731 GUAAUAAUUUUGUAGGUUUUCGUG 754 gra-miR8743d 3.5 17.79 miRNA 24 UACUGGUAAAACAUUGAAAAGUAU 1 翻译Translation . : :. : : : : : : : :. : : : : :. :. Target 731 GUAAUAAUUUUGUAGGUUUUCGUG 754 gra-miR8743e 3.5 17.79 miRNA 24 UACUGGUAAAACAUUGAAAAGUAU 1 翻译Translation . : :. : : : : : : : :. : : : : :. :. Target 731 GUAAUAAUUUUGUAGGUUUUCGUG 754 gra-miR8762a 3.5 15.14 miRNA 24 CAGUCGUUUCAAUUGUUUACAAUU 1 翻译Translation : :. : : : : : : :. : : : : : : :. : Target 914 GUGGUCAAAGUUGUCAAAUUUUGA 937 hvu-miR1436 3.5 12.95 miRNA 21 UGAGGGAGGCAGGGUAUUACA 1 裂解Cleavage : :.. : :. : : :. : : : : : : : : Target 501 UCUUUCUUCGUUCCUUAAUGU 521 osa-miR1436 3.5 12.95 miRNA 21 UGAGGGAGGCAGGGUAUUACA 1 裂解Cleavage : :.. : :. : : :. : : : : : : : : Target 501 UCUUUCUUCGUUCCUUAAUGU 521 pab-miR3702 3.5 15.12 miRNA 21 CGCUUAUUCGUGGUUCUCUAA 1 裂解Cleavage . : : : : : : : : : : : : : : : : Target 331 UUGCAUAACCACCAAGAUAUU 351 stu-miR8047 3.5 15.65 miRNA 21 CCAGAUUAAAGCUUUUUUACC 1 裂解Cleavage : :. :. : : : :. :.. : : : : : : Target 551 GCUUUGAUUUUGGUGAAAUGG 571 ahy-miR394 4.0 12.40 miRNA 20 CCUCCACCUGUCUUACGGUU 1 翻译Translation : :. : : : :. : : : : : : : : : Target 1105 GGGGGUAGUUCGAAUGCCAA 1124 aly-miR394a-5p 4.0 12.40 miRNA 20 CCUCCACCUGUCUUACGGUU 1 翻译Translation : :. : : : :. : : : : : : : : : Target 1105 GGGGGUAGUUCGAAUGCCAA 1124 aly-miR394b-5p 4.0 12.40 miRNA 20 CCUCCACCUGUCUUACGGUU 1 翻译Translation : :. : : : :. : : : : : : : : : Target 1105 GGGGGUAGUUCGAAUGCCAA 1124

表 2 预测获得的靶向CaICE1的miRNA Table 2 Predicted miRNAs targeting CaICE1

密码子偏好性分析表明，CaICE1有效密码子数(ENc)和密码子适应指数(CAI)分别为51.54和0.203, 表明其密码子偏好性较弱。密码子第三位GC含量和总GC含量分别为0.440和0.445，说明其偏好使用含有A和T并以A或T结尾的密码子。同义密码子相对使用度分析表明，CaICE1偏好性较强的密码子(RSCU≥2.0)仅有4个，分别为AGA、AGG、TTG和CCA，可能作为其最优密码子群，也进一步验证CaICE1密码子偏好性较弱(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 CaICE1同义密码子相对使用度 Table 3 Relative synonymous codon usage of CaICE1 氨基酸 Amino acid 密码子 Codon CaICE1 Ala GCT 1.04 GCC 1.39 GCA 1.39 GCG 0.17 Arg CGT 0.44 CGC 0.22 CGA 0.44 CGG 0.67 AGA 2.00 AGG 2.22 Asn AAT 1.21 AAC 0.79 Asp GAT 1.47 GAC 0.53 Cys TGT 0.75 TGC 1.25 Gln CAA 1.44 CAG 0.56 Glu GAA 1.13 GAG 0.88 Gly GGT 1.55 GGC 1.27 GGA 0.45 GGG 0.73 His CAT 0.83 CAC 1.17 Ile ATT 1.50 ATC 1.50 ATA 0.00 Leu TTA 0.42 TTG 2.63 CTT 1.58 CTC 0.63 CTA 0.11 CTG 0.63 Lys AAA 0.81 AAG 1.19 Phe TTT 1.36 TTC 0.64 Pro CCT 0.93 CCC 0.40 CCA 2.13 CCG 0.53 Ser TCT 1.26 TCC 0.84 TCA 0.53 TCG 0.63 AGT 1.47 AGC 1.26 Thr ACT 1.78 ACC 0.59 ACA 1.04 ACG 0.59 Tyr TAT 0.40 TAC 1.60 Val GTT 1.48 GTC 0.74 GTA 1.04 GTG 0.74

表 3 CaICE1同义密码子相对使用度 Table 3 Relative synonymous codon usage of CaICE1

CaICE1在橄榄各组织器官中均有表达，以花中的表达量最高，其次是种子和叶，而在根、茎和果实中的表达量相对较低(图 5)。此外，差异显著性分析表明，CaICE1的表达存在组织器官特异性表达，暗示其可能在不同组织器官抗寒过程中发挥调控作用。

图 5(Fig. 5)

图 5 CaICE1在组织中的表达。柱上不同大写和小写字母分别表示差异极显著(P < 0.01)和显著(P < 0.05)。下同。 Fig. 5 Relative expression of CaICE1 in tissues. Different capital and small letters upon column indicate significant differences at 0.01 and 0.05 levels, respectively. The same is following Figure.

qRT-PCR结果表明，与25℃对照相比，4℃处理的CaICE1表达出现稍微下调，说明4℃低温处理时CaICE1并未被激活，这可能与植株并未受到显著寒害有关。而-3℃处理24 h后，CaICE1的表达水平急剧上升，为对照的3.8倍，说明-3℃低温冻害后橄榄CaICE1基因被诱导显著表达，从而迅速激活其介导的抗寒系统以维持机体正常生长代谢。

植物ICE1是一类含有bHLH保守结构域的MYC组成型表达基因，通常在细胞中处于无活性状态，低温活化后能够与CBF启动子特定区域结合并以‘主效开关’的身份激活CBF信号途径^[19]。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，约40%的抗寒关键基因和46%的冷响应基因均受ICE1调控，说明ICE1在植物抗寒过程中发挥至关重要的作用^{[8, 20]}。本研究结果表明，CaICE1含有植物典型的HLH保守结构域，且与其他物种的ICE1均保持较近的亲缘关系，说明其为橄榄的抗寒调控转录因子。生物信息学分析表明，CaICE1可能受一系列miRNA转录后水平或翻译水平抑制调控，其中已有报道miR825^[21]、miR477^[22]、miR5658^[23]、miR1436^[24]和miR394^[25]等均为植物逆境胁迫响应miRNA，尤其miR394直接参与了拟南芥冷胁迫应答，可见CaICE1可能与橄榄逆境胁迫密切相关。进一步的qRT-PCR分析表明，-3℃处理后CaICE1的表达量急剧上升，说明冻害后CaICE1介导的抗寒调控网络迅速启动以维持橄榄正常生理代谢。此外，橄榄CaICE1在不同组织器官中均维持一定的表达水平以随时应对外界低温胁迫。由此看来，CaICE1可能在橄榄低温胁迫过程中发挥了重要的调控作用。

图 6(Fig. 6)

图 6 CaICE1在低温胁迫下的表达 Fig. 6 Expression of CaICE1 under low temperature stress

物种或基因在长期进化过程中往往形成特定的密码子偏好性规律，密码子偏好性分析可为揭示基因的分子功能和进化规律提供科学依据^[26-27]。本研究中，橄榄CaICE1的密码子偏好性较弱，但偏好使用含有A和T并以A或T结尾的密码子，这与对茶树(Camellia sinensis) ICE1^[28]的研究结果一致，且符合双子叶植物^[29]基本特征，但橄榄CaICE1密码子的具体进化过程、进化方式和关键作用力等仍需进一步研究。