随着全球气候变暖，干旱已经成为植物面临的主要非生物胁迫之一。在漫长的进化过程中，植物形成了一套复杂的抗旱机制来应对干旱，包括形态适应、生理生化响应及基因表达调控等^[1]。杜鹃(Rhododendron sp.)是中国的十大名花之一，素有“花中西施”的美誉，但由于其对水分比较敏感，再加上城市土壤水分缺失，在园林绿化中经常受到干旱胁迫的影响，进而限制了在园林中的进一步推广, 因此，对于杜鹃花干旱响应机理的研究已显得尤为迫切。目前，对杜鹃花干旱胁迫的研究主要集中在种子萌发^[2]和植株生理生化水平的适应性调节^[3-5], 而相关分子水平的研究鲜有报道。

植物体内的转录因子(transcription factor, TF)是通过与靶基因启动子区的特定DNA序列(顺式作用元件)结合，从而提高或抑制靶基因转录水平的调控基因^[6]。在植物基因组中，大约7%的编码序列被注释为TFs^[7]，而且常常是以基因家族的形式出现。这些转录因子家族，如MYB^[8]、bHLH^[9]、NAC^[10]、WRKY^[11]、bZIP^[12]和ERF^[13]等对于构建植物应对外界生物或非生物胁迫刺激的转录调控网络至关重要。因此，基因工程中可以运用转录因子来提高植物的抗逆性^[14]，而挖掘抗逆转录因子则成为了基因工程的基础工作之一。

本研究在杜鹃花转录组测序研究的基础上，深入挖掘杜鹃花应答不同水分条件的转录因子，为阐明杜鹃花抗旱的分子机理及培育抗旱新品种奠定基础。

1 材料和方法 1.1 材料和处理

以长势良好的2年生杜鹃花‘白凤4号’ (Rhodo- dendron pulchurum ‘Baifeng 4’)盆栽扦插苗为试验材料，在人工气候室内进行处理，以正常浇灌为对照(CK)，土壤含水量为(70±5)%; 停止浇水2 d为中等干旱(middle drought，MD)，土壤含水量为(60± 5)%; 停止浇水3 d为严重干旱(severe drought, SD), 土壤含水量为(45±5)%; 然后恢复正常浇水3 d设为复水处理(rewatering, RW)，土壤含水量为(70±5)%, 每个处理30株。人工气候室的光/暗为12 h/12 h, 白天温度25℃，晚上温度15℃，空气相对湿度为65%。每个处理摘取从上往下第2~4片成熟功能叶进行RNA提取，用于转录组测序。

1.2 转录组测序

杜鹃花叶片的RNA提取和转录组序列测定及分析参考WU等^[1]的方法，获得Clean reads后通过De novo组装得到基因序列，然后，对差异表达的基因进行分析。本研究中，基因的表达量用RPKM值来统计，且界定Log₂Ratio绝对值≥1、FDR≤0.01的基因为差异表达基因。在此基础上，通过BLAST与Nr库进行比对，筛选出差异表达的转录因子。

1.3 差异表达转录因子Real-time PCR验证

转录组测序数据的有效性和准确性用实时荧光定量(RT-qPCR)法来验证。随机挑选6个差异表达的转录因子，用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR引物(表 1)，以杜鹃叶片的cDNA为模板，以Actin基因为内参，并参考WU等^[1]的方法分析基因的相对表达量。RPKM值用于统计基因的表达量, 是表示10⁶个reads中来自于某基因1 kb长度的reads。每个样品4次重复。

2 结果和分析 2.1 差异表达基因和转录因子数据统计

以杜鹃花‘白凤4号’在4种处理下的植株叶片混合样本转录组数据构建参照文库，分析叶片的转录组表达谱信息，不同处理间共得到了962~12 558个差异表达基因(differential expression genes, DEGs) (表 2)，其中对照与中等干旱处理间的DEGs最少，而严重干旱和复水处理间的DEGs最多。

将这些差异表达基因通过BLAST与Nr库进行比对，总共有505个转录因子(图 1)，其中含有转录因子最多的是严重干旱与复水处理间(161个，占本组DEGs总数的1.3%)，其次是对照和严重干旱处理间(101个，占2.6%)，最少的是对照与中等干旱处理间(34个，占3.7%)。进一步分析表明，与对照相比，随着干旱程度加深直至复水，转录因子的数量呈先上升后下降的趋势，且转录因子都以上调表达为主。与中等干旱相比，从严重干旱到复水，转录因子数量下降，但仍以上调表达为主。特别值得关注的是，复水与严重干旱相比，转录因子数量骤然增加，且以下调表达为主。

2.2 转录因子家族统计分析

在获得转录因子数量基本信息后，进一步统计分析转录因子家族及其成员的数量关系。差异表达基因数量排前5位的家族共有254个转录因子，占转录因子总数(505个)的一半以上(图 2)，其中ERF家族(75个)、WRKY家族(56个)、bHLH家族(50个)、MYB家族(42个)和bZIP家族(13个)占92.9%，且干旱处理的差异表达转录因子都比复水处理的多, 而NAC和PLATZ家族转录因子只在干旱处理中差异表达，GATA家族转录因子则只在复水处理中差异表达。

2.3 转录因子表达情况统计分析

由表 3可知，ERF、bHLH和MYB等3个家族在干旱和复水处理都有上调和下调表达的基因, WRKY和PLATZ家族基因在干旱胁迫中只上调表达，且PLATZ家族基因只在中等干旱时差异表达, bZIP家族基因在干旱和复水处理都只上调表达, GATA则通过基因的上调和下调响应旱后复水的刺激。

2.4 高表达转录因子分析

从表 4可见，差异表达基因在干旱处理和复水处理中的表达量(|log₂(Fold change)|≥4)分别为-4.707~13.216、-4.545~10.749和-11.911~4.357, 且在干旱处理中以上调表达为主，在复水处理中以下调表达为主。其中，上调表达最显著的是NF-Y家族基因；其次是ERF家族基因。下调表达最显著的是ERF类转录因子，在复水处理中下调最为显著。此外，在干旱处理中bZIP家族基因的上调表达及热应激转录因子HsF家族基因的差异表达也比较显著。

2.5 差异表达转录因子Real-time PCR验证

随机选取2个上调表达和4个下调表达的转录因子，用Real-time PCR方法验证测序数据的有效性(表 5)。结果表明，6个转录因子在不同处理中的表达趋势与转录组结果一致，从而验证了转录组测序数据的有效性。

3 结论和讨论

随着转录组测序技术的飞速发展和多个生物信息平台的加入，即使在没有基因组数据的前提下，转录组测序结果也可以为明确植物特定生理功能相关的代谢途径、挖掘未知基因及明晰基因调控机制提供大量信息。利用该技术，前人已挖掘了陆地棉(Gossypium hirsutum)^[15]、枇杷(Eriobotrya japo- nica)^[16]和梭梭(Haloxylon ammodendron)^[17]等作物中的抗逆基因，并分析了相关基因的调控机制。

本研究中，杜鹃花协同调动了ERF、bHLH、MYB基因的差异表达来响应干旱胁迫和水分刺激，而在面临干旱胁迫时，增加NAC的差异表达和WRKY、bZIP、PLATZ上调表达来协同响应；在水分刺激下, 则偏向于增加GATA的差异表达来协同调节。同时, 在不同水分条件下，NF-Y家族基因的差异表达尤其明显，这说明这些转录因子在杜鹃花在应对干旱胁迫和水分刺激中具有重要调节作用。

PLATZ和GATA同属锌指蛋白，前者含有2个锌指结构域：C-X₂-H-X₁₁-C-X₂-C-X_(4-5)-C-X₂-CX_(3-7)- H-X₂-H和C-X₂-C-X_(10-11)-C-X₃-C^[18]，而后者在大多数植物中只含有1个锌指结构域C-X₂-C-X₁₈-C-X₂- C^[19]。这两类基因在植物抗逆中的作用研究相对较少，但其调控作用已得到验证。有研究表明，大豆(Glycine max)中GmPLATZ1可以被干旱、盐和ABA诱导表达^[20]，水稻(Oryza sativa)中的GATA响应冷处理^[21]并能被ABA诱导表达^[22]，茉莉酸甲酯处理的穇(Eleusine coracana)中GATA基因可以通过与JAZ互作调控茉莉酸信号的转导^[23]。

NF-Y类转录因子，含有3个亚基(NF-YA、NF- YB和NF-YC)，这3个亚基形成异源三聚体后特异地结合真核生物启动子元件CCAAT盒，从而调控基因的转录，行使复杂的调控作用^[24]。NF-Y三聚体及其亚基参与抗旱调节已在拟南芥(Arabidopsis)、大豆、大白菜(Brassica pekinensis)和小麦(Triticum aestivum)等植物中得到了验证。而且这种调控作用可能是通过参与ABA的合成和信号转导^[25]、调控植物叶片的气孔开度^[26]、促进脯氨酸的积累^[27]、增加叶片叶绿素和可溶性蛋白含量^[28]以及提高植物抗氧化能力^[29]来实现的。同时，在植物抗旱中，NF-Y转录因子的转录还受到MicroRNAs的调节^[25]和bZIP转录因子的协调作用^[30]。

由此可见，ERF、bHLH、MYB、WRKY、NAC及bZIP等转录因子在杜鹃花干旱胁迫和水分刺激应答中可能起着主导作用，同时这些转录因子与PLATZ、GATA以及NF-Y等其他家族转录因子之间可能存在共表达性或协同作用，从而形成复杂且精细的调控网络来响应不同水分条件的刺激。

综上所述，本研究借助转录组测序技术，分析了干旱和复水处理中杜鹃‘白凤4号’叶的转录因子种类和表达规律，将为下一步筛选杜鹃花抗旱关键基因、研究杜鹃花干旱胁迫应答调控网络和分子育种等提供理论依据。