盐分是影响植物生长与分布的重要环境因子之一。盐胁迫下，植物细胞内离子平衡被破坏，各条代谢途径产生大量的活性氧(ROS)，对细胞膜脂和蛋白质等生物大分子造成损伤，最终使膜的完整性受到破坏，导致一系列生理代谢紊乱^[1]。在遭受盐胁迫时，植物常常通过抗氧化系统中的酶类和非酶类抗氧化物质之间的协同作用来抵御盐胁迫引起的氧化胁迫^[2]。耐盐植物长期生活在高浓度盐环境中，在进化中形成了较强的抗氧化能力以有效清除ROS的伤害，对盐胁迫环境有较强的适应能力。红树植物是生长于热带亚热带海岸潮间带的典型木本耐盐植物，具有较强的耐盐性^[3]。因此研究红树植物抗氧化系统在抵御盐胁迫中的作用具有重要意义。

目前，关于抗氧化系统在红树植物耐盐中的作用已有一些研究报道。拉关木(Laguncularia race- mosa)和无瓣海桑(Sonneratia apetala)在盐胁迫下体内多种抗氧化酶活性均随盐浓度的升高而增加，但耐盐性更强的拉关木增加幅度更高^[4]。在盐胁迫下, 桐花树(Aegiceras corniculatum)^[5]和海滨木槿(Hibi- scus hamabo)^[6]叶片中过氧化氢(H₂O₂)含量和抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶活性均升高，而丙二醛(MDA)含量却没有变化，表明抗氧化酶通过及时清除ROS减轻其对膜脂的伤害。秋茄(Kandelia candel)是福建乃至全国最普遍的一种红树植物，是红树植物人工造林的主要物种。盐分是影响秋茄幼苗成活的主要因素之一^[7]。目前，关于盐胁迫引起秋茄根系抗氧化系统的研究较少^[8-9]，缺乏从抗氧化酶和抗氧化剂两个方面的综合研究。根是植物逆境反应中最为敏感的部位，已有研究表明，根系在短期(1~7 d)胁迫下就会表现显著的生理响应^[10]。本文以秋茄幼苗为供试材料，通过测定不同浓度、不同时间NaCl处理的根系活性氧含量、抗氧化酶活性和抗氧化物含量等生理生化指标的变化，探索秋茄根系抗氧化系统在耐盐中的生理响应，揭示其耐盐特性，为提高红树植物秋茄育苗成活率和扩大红树植物分布提供理论依据。

供试的秋茄胚轴采自福建省漳州市漳江口红树林自然保护区。挑选大小与成熟度相近、无损伤和病虫害、生活力强的胚轴植于45 cm×35 cm×25 cm的塑料盆中并加入Hogland营养液沙培，每盆种植20棵，每天傍晚用自来水补充散失的水分。每3 d更换1次营养液。待植株长至4叶后，用含有不同浓度NaCl [0 (对照)、200、400、600 mmol L^–1]的Hoagland营养液浇灌秋茄幼苗，每天傍晚补充损失的水分。分别在处理1、3、5和7 d后采集秋茄幼苗根系，每个处理取20株苗，自来水清洗2次，再用蒸馏水洗涤2次，剪取全部根系，滤纸吸干表面水分并混匀，按每份2 g左右用锡箔纸包裹置液氮冷冻，后放–80℃冰箱保存，进行各项指标的测定。

超氧阴离子(${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$)含量(nmol g^–1 FW)、H₂O₂含量(μmol g^–1 FW)、MDA含量(μmol g^–1 FW)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量(μg g^–1 FW)、SOD活性(U g^–1 FW)、过氧化物酶(POD)活性(U g^–1 FW)、过氧化氢酶(CAT)活性(U g^–1 FW)、APX活性(U g^–1 FW)参照李合生^[11]和李玲^[12]的方法测定。以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原的50%时所需的酶量作为1个SOD酶活性单位；以每分钟内A_{470 nm}变化0.01为1个POD酶活性单位；以1 min内A_{240 nm}减少0.01的酶量作为1个CAT酶活性单位；以1 min减少0.01为1个APX酶活性单位。参考Halliwell^[13]方法测定GR活性(U g^–1 FW), 以1 min内变化0.01为1个酶活性单位。采用Law等^[14]方法测定抗坏血酸(AsA)含量(μg g^–1 FW)。

所有生理生化指标测定均设3次重复。数据采用SPSS 19.0软件进行方差分析，应用最小显著差法(LSD)进行多重比较。应用Microsoft Excel 2007软件进行图表绘制。

大量研究表明，盐胁迫会使植物体内自由基大量积累，引起膜脂过氧化，从而破坏细胞的完整性及其功能，最终使植物受害^[15]。NaCl胁迫对秋茄根系中ROS (${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$和H₂O₂)和MDA含量均有影响(图 1)，随NaCl浓度的增大，${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$含量总体呈升高趋势。与对照相比，低浓度(200 mmol L^–1 NaCl)胁迫处理的${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$含量无显著变化，而中浓度(400 mmol L^–1 NaCl)和高浓度(600 mmol L^–1 NaCl)处理的均明显高于对照，且随处理时间的延长而增加，以高浓度胁迫处理7 d的含量达最大值(是对照的5.43倍)。H₂O₂是生物体内活性氧的另一种存在形式，也常作为植物受到环境胁迫的一个标志^[16]。秋茄根系中H₂O₂含量的变化趋势与${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$类似，且以高浓度胁迫处理7 d的含量达到最大值，高于对照的127.5%。这表明中低浓度或短时间(1、3、5 d)胁迫下，秋茄根系内ROS含量处于较低水平，而高浓度胁迫下，秋茄根系细胞内ROS大量积累。

图 1(Fig. 1)

图 1 NaCl胁迫对秋茄根系中ROS与MDA含量的影响。同一时间下柱子上不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下图同。 Fig. 1 Effect of NaCl stress on ROS and MDA contents in Kandelia candel roots. Different letters upon column at the same time indicate significant difference at 0.05 level. The same is the following figures.

MDA含量是衡量逆境下植物细胞膜脂过氧化程度的常用指标^[17]。秋茄根系中MDA含量随NaCl浓度的增加总体呈上升趋势。除了中浓度处理1 d外，低浓度和中浓度胁迫短时间处理的MDA含量与对照均不存在显著变化；而高浓度胁迫处理的MDA含量均显著高于对照，处理7 d的MDA含量是对照的2.18倍。这表明，中低浓度或短时间盐胁迫对秋茄根系膜脂过氧化伤害较小，而高浓度胁迫给根系细胞膜脂带来严重的过氧化伤害。

盐胁迫对秋茄根系中抗氧化酶的活性产生影响(图 2)，与对照相比，胁迫处理1 d，随NaCl浓度的增加，SOD活性下降，中浓度和高浓度处理的SOD活性分别下降了27.9%和42.0%，差异显著; 胁迫处理3和5 d，SOD活性随NaCl浓度的增加而显著升高；胁迫处理7 d，随着NaCl浓度的增加，SOD的活性先升高后下降，即低浓度和中浓度处理的SOD活性显著升高，而高浓度处理的活性显著降低。SOD是细胞中将${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$转化为H₂O₂的主要酶类, 其活性与组织中${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$的含量有一定的相关性。盐胁迫下秋茄根系中SOD活性变化特征与${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$含量的变化趋势基本吻合。

图 2(Fig. 2)

图 2 NaCl胁迫对秋茄根系中抗氧化酶活性的影响 Fig. 2 Effect of NaCl stress on antioxidant enzyme activities in Kandelia candel roots

从图 2可以看出，相比于对照，低浓度胁迫处理1 d的POD活性无明显差异，而中浓度和高浓度处理的活性显著下降了18.0%和15.0%；胁迫处理3、5和7 d的POD活性随着NaCl浓度的增加呈先升高后降低的趋势，均显著高于对照，即中浓度胁迫处理的POD活性最高。虽然高浓度胁迫处理也使POD活性提高，但低于中浓度胁迫处理，这不利于有效地清除高浓度胁迫所导致的ROS大量累积。

从图 2可以看出，与对照相比，胁迫处理1 d的CAT活性随着NaCl浓度的升高而降低；胁迫处理3、5和7 d的CAT活性变化趋势与POD的类似，也是随着NaCl浓度的升高呈先升高后降低的趋势，即中浓度胁迫处理的CAT活性最高。但值得注意的是，高浓度胁迫处理7 d的CAT活性显著降低。这表明CAT活性受盐度的影响较大，在高浓度盐胁迫下其活性随处理时间的延长而持续降低。

AsA-GSH循环是植物体内清除ROS的重要代谢途径，包括APX、GR等抗氧化酶和AsA、GSH等抗氧化剂^[18]。与对照相比(图 3)，胁迫处理1 d, 随NaCl浓度的增加，APX活性呈下降趋势；胁迫处理3、5 d，APX活性随NaCl浓度的增加呈先升高后降低的趋势；胁迫处理7 d的APX活性变化趋势与处理1 d的相同。低浓度胁迫处理不同时间的APX活性与对照间无显著差异；当NaCl浓度为400 mmol L^–1时，APX活性随处理时间的延长表现出先升后降的变化趋势，处理3 d的活性最高(是对照的2.17倍)；高浓度胁迫处理的APX活性也表现为先升后降的变化趋势，但与中浓度胁迫处理不同的是，除处理3 d时升高外，其余处理时间均低于对照。这表明APX活性对NaCl浓度较为敏感，随NaCl浓度的升高，其活性迅速下降，当高浓度胁迫处理7 d的活性降至最低。

图 3(Fig. 3)

图 3 NaCl胁迫对秋茄根系中AsA-GSH循环的影响 Fig. 3 Effect of NaCl stress on AsA-GSH cycle in Kandelia candel roots

从图 3可以看出，与对照相比，胁迫处理1 d的GR活性随NaCl浓度的增加先变化不大然后降低；胁迫处理3、5、7 d，GR活性随着NaCl浓度的增加均表现出先升后降的变化趋势，而且中低浓度胁迫处理的GR活性均显著高于对照，以400 mmol L^–1 NaCl浓度处理5 d的最高，为对照的2.12倍，但高浓度胁迫处理7 d时GR活性下降了112.1%，表明中低浓度胁迫处理可激活GR的活性，但是高浓度胁迫处理会抑制GR的活性。

AsA含量总体上随着NaCl浓度的升高而增加(图 3)。与低浓度和高浓度胁迫处理相比，中浓度胁迫处理下的AsA含量比对照增加的幅度最大，尤其是在胁迫处理5 d的AsA含量达到峰值(是对照的2.78倍)；低浓度胁迫处理的AsA含量随处理时间的延长而不断升高，而高浓度胁迫处理的则相反。这些结果表明，AsA在低浓度胁迫下可以诱导合成, 且在较长时间内其含量可以维持在较高的水平，但长时间高浓度胁迫不利于AsA的合成。GSH是AsA- GSH循环中另一个重要的抗氧化剂，可以直接与ROS自由基反应以清除ROS^[18]。在低浓度和中浓度胁迫处理下，GSH含量随处理时间的延长呈上升趋势(图 3)，且都显著高于对照；而高浓度胁迫的GSH含量随着处理时间的延长呈下降趋势, 处理7 d的GSH含量与对照无显著差异。这说明, 当NaCl大于400 mmol L^–1时，随着胁迫时间的延长，秋茄根系中GSH的产生不断减少，不利于生长。

众所周知，盐胁迫打破了植物体内ROS产生和清除的动态平衡，导致ROS大量积累，超过了植物的耐受阈值，破坏细胞膜脂、蛋白、核酸等大分子物质，最终造成细胞功能紊乱而引起伤害^[19]。MDA是活性氧对细胞膜脂过氧化伤害的最终产物之一，其含量变化可以反映出组织受氧化胁迫的伤害程度。大量研究结果表明，在盐胁迫条件下，植物膜透性和MDA含量均随盐浓度的增加而提高^[20-21]。秋茄幼苗在中低浓度(200和400 mmol L^–1 NaCl)短期胁迫下，根系内ROS (${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$和H₂O₂)含量虽有增加但仍处于较低水平，MDA含量变化不显著，脂膜未受到明显的过氧化伤害，而高浓度(600 mmol L^–1 NaCl)胁迫处理，ROS大量积累，MDA含量也显著升高，表明秋茄根系细胞脂膜受到严重的过氧化伤害。我们前期研究表明，秋茄幼苗用500 mmol L^–1 NaCl处理60 d后仍然存活，而且200 mmol L^–1 NaCl促进秋茄幼苗的生长^[22]，这与林鹏^[23]等的研究结果相一致。这表明秋茄幼苗根系中存在一套功能较强的抗氧化系统，可以清除过多的ROS从而减轻ROS对机体的伤害。

植物体内的抗氧化系统含有多种抗氧化酶，可以保护细胞膜结构的完整性，稳定膜的透性。已有研究表明，盐生植物在遭受盐胁迫时，SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性明显增强^{[6, 24]}。SOD属于金属酶类，是生物体中普遍存在的一种抗氧化酶, 在抗氧化酶体系中处在核心地位。SOD可以通过歧化反应将${\rm{O}}_2^{\mathop-\limits_. }$转变为H₂O₂和O₂^[25]。CAT是植物体中数量较多、分布较广的一类抗氧化酶，可以催化H₂O₂生成H₂O，其活性受H₂O₂诱导^[26]。POD主要催化H₂O₂生成H₂O，也可催化有机过氧化物和无机物的氧化分解^[27]。一般情况下，植物体可以通过这3种抗氧化酶的协同作用有效地清除过多的ROS以抵抗ROS带来的伤害。秋茄根系SOD、POD和CAT等抗氧化酶在NaCl胁迫下产生明显响应。这3种酶活性在胁迫处理1 d时未发生明显变化或低于对照，可能因为胁迫时间较短，其活性尚未被完全激活^[28]。然而，随着处理时间的延长，这3种酶活性总体上随NaCl浓度的升高而呈现先增强后减弱的变化趋势，这是因为秋茄根系中的各种抗盐代谢途径大量启动，需要这3种酶参与反应以减轻盐伤害。从表型来看，在600 mmol L^–1 NaCl浓度处理下，1 d后接近1/3植株的叶片出现萎蔫，且早晚可恢复，根系颜色正常；3 d后全部植株的叶片出现萎蔫，且不能恢复，大约2/5植株的根尖变黑；7 d后茎和叶全部萎蔫，且不可恢复，所有植株根系均有不同程度的变黑，于是我们推测600 mmol L^–1 NaCl浓度已经达到或超过秋茄根系所能忍受的盐度上限。这3种抗氧化酶的活性随处理时间的延长而显著降低，这与高浓度盐胁迫下的植株表型变化相一致，也与Wang等^[29]的研究结果相似。

AsA-GSH循环是植物抗氧化系统的重要组成部分。植物体内产生的H₂O₂会被AsA-GSH循环中的重要抗氧化剂AsA和GSH所直接清除^[29]。APX以AsA为底物，可将H₂O₂转变成H₂O，以达到清除的目的，而且GSH可以直接与ROS自由基反应转变为GSSG，GSSG可以在GR的催化反应下被NADPH还原为GSH，进入下一轮循环，这样可以实现对自由基的持续清除，以提高抗逆性。有研究表明，酸枣(Ziziphus acidojujuba)实生苗在NaCl胁迫下，根和叶片中AsA和GSH含量显著增加，APX活性随NaCl浓度的增加而逐渐下降，GR活性在根中变化不明显，而在叶片中随NaCl浓度的增加而升高^{[18, 30]}。NaCl胁迫处理引起盐生植物黄花补血草(Limonium aureum)幼苗叶片中GR活性的增强, 50 mmol L^–1 NaCl胁迫处理的AsA和GSH含量均显著增加，而150 mmol L^–1 NaCl胁迫处理的AsA含量仍继续增加，但GSH含量却明显下降^[31]；在NaCl胁迫处理下，葡萄(Vitis vinifera)叶片中AsA与GSH含量显著下降，而APX、GR等的活性却显著升高^[32]。与前人的研究类似，本研究也表明，NaCl胁迫处理不同时间，秋茄根系中AsA和GSH含量总体上均显著高于对照，而APX和GR活性整体上表现出先升高后降低的变化趋势，中低浓度胁迫处理下的活性均显著高于对照，这说明秋茄根系可以通过AsA-GSH循环系统中AsA和GSH的循环来清除ROS，从而提高耐盐能力。

综上所述，秋茄根系在中低浓度胁迫(200和400 mmol L^–1 NaCl)处理下可以通过提高抗氧化系统活性来提升ROS的清除效率，维持细胞内ROS的动态平衡，避免NaCl胁迫对细胞的伤害。虽然高浓度(600 mmol L^–1 NaCl)胁迫造成秋茄根系ROS的急剧增加，但是在短时间(少于5 d)内，秋茄可以通过自身较强的抗氧化系统减轻ROS造成的伤害。因此，本研究认为红树植物秋茄幼苗可以在中低浓度下正常生长，并能抵御短时间的高浓度胁迫。本文所设置的0、200、400、600 mmol L^–1 NaCl相当于海水的0‰、11.6‰、23.4‰、35.1‰的盐度，这与谭芳林等^[7]的盐度设计相类似，研究结果也可以作为指导秋茄幼苗滩涂种植的实验参考依据。