磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)是一种变构调节酶, 它的主要功能是在Mg²⁺和HCO₃^-存在的情况下，催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)的β-C羧基化并生成草酰乙酸(oxaloacetate, OAA)和无机磷酸(inorganic phosphate, Pi)^[1-4]。除动物和真菌外，PEPC广泛存在于植物、藻类、蓝细菌、光合细菌及一些非光合细菌中^[5]。目前已有多个植物PEPC得到鉴定，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有Atppc1、Atppc2、Atppc3和Atppc4等4个编码基因^[6]，在玉米(Zea mays)^[7]、甘蔗(Saccharum spp.)^[8]、大豆(Glycine max)^[9]、水稻(Oryza sativa)^[5]等植物中也报道了多个PEPC基因。早期报道了大豆PEPC基因家族的GmPEPC1、GmPEPC4、GmPEPC7、GmPEPC16和GmPEPC17等5个成员，后续报道了10个GmPEPC家族成员，并对这些基因进行了重命名^{[4, 9]}。在栽培花生(Arachis hypogaea)品种‘E11’中也克隆得到AhPEPC1-5等5个成员^[10]。植物PEPC参与多种重要代谢途径，不仅作为光合作用的关键酶参与CO₂的固定^[11]，还参与氨基酸代谢中碳骨架的回补^[12-13]、氮元素的积累^[13-14]、油脂的合成与积累^[15-18]等过程，起到调控植物种子的形成与萌发、果实成熟、植物叶片气孔开闭，维持细胞酸碱平衡以及提高植物抗逆性等作用^{[12, 19]}。

花生是重要的油料作物之一，种子含油量高达45%~56%，蛋白质含量达到24%^[20-21]。四倍体的栽培品种花生基因组庞大而复杂，目前已经测序完成注释并公布的是2个二倍体花生祖先种野生蔓花生(Arachis duranensis)和A. ipaёnsis (即花生属A基因组和B基因组)的全基因组序列^[21-23]。本研究通过分析蔓花生的数据库信息，找到AdPEPC家族基因，并分析其结构、序列特征及进化关系，同时通过检测其不同成员在各种组织中的表达，为进一步探讨AdPEPC基因参与花生生长过程中物质积累和代谢调控的功能机制奠定基础。

本研究所用二倍体祖先种蔓花生(Arachis dura-nensis)新鲜根、茎、叶、花等材料，于2016年5月上旬采自广东省农业科学院白云区钟落潭种植基地，采集后立即用液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。AdPEPC基因序列信息从花生基因组数据库PeanutBase(http://peanutbase.org/)^[23]获得。

以拟南芥AtPPC1 (AT1G53310)、AtPPC2 (AT2-G42600)、AtPPC3 (AT3G14940)、AtPPC4 (AT1G-68750)等4个PEPC蛋白序列^[6]对花生基因组数据库PeanutBase (http://peanutbase.org/)进行搜索，在蔓花生基因组中查找同源蛋白的相应基因序列作为候选基因。将候选基因编码的蛋白序列在PFAM (http://pfam.xfam.org/)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)蛋白结构域在线分析预测网站上分析候选蛋白结构域，存在PEPcase (PF00311)结构域的确认为PEPC蛋白家族成员，将下载得到的所有核苷酸序列和氨基酸序列以FASTA格式保存。

用Gene Structure Display Server (GSDS)在线网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)^[24]进行基因外显子、内含子结构分析。使用MapInspect软件进行染色体定位分析。

使用DNAMAN软件进行多序列比对分析；用MEGA6.0软件对蔓花生的PEPC与不同物种的PEPC氨基酸序列进行同源比对后，使用N-J法(邻接法)构建系统进化树。使用在线工具ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)中的Prot-Param (http://web.expasy.org/protparam/)进行理化性质预测。

取蔓花生生长旺盛期的根、茎、叶、花等组织材料，采用OMEGA公司的Plant RNA Kit试剂盒提取总RNA。提取的RNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整度，并用核酸仪测定浓度及纯度。使用TIANGEN公司的Fast Quant RT Kit (with gDNase)试剂盒进行反转录得到cDNA。荧光定量反应体系及程序参照天根公司的Fast Quant RT Kit (with gDNase)试剂盒说明书，在LightCycler480Ⅱ(Roche)仪器上进行。反应体系总体积为20 μL, 包含10 μL的PCR Mix (SYBR Green)，正反向引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，H₂O 6.4 μL。反应程序为95℃预变性3 min；然后95℃变性10 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸20 s，共45个循环。AdPEPC基因特异引物及18S rRNA内参引物见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for fluorescent quantitative PCR 引物Primer 序列Sequence (5′~3′) AdPEPC1;1 F: CCACCTTAGAGCACGGTATGA R: ACTCCTCTGTGGCAATGACG AdPEPC1;2 F: TCCAAGCTGCCTTCCGTAC R: CTGTATCCAGCCGACGTAGAA AdPEPC1;3 F: ACCGCTAAGGGTCGTGCC R: CCAAGCCGCAGAAAGACG AdPEPC1;4 F: TGCGGCAAGTTTCCACCT R: GTTCCTCGGACCATTCTCG AdPEPC4;1 F: ATTCCCCGTTGCCATTCA R: AGTGGTGAAAGAGTTGTGAGGG AdPEPC4;2 F: AACAATGACAGACACCACAGATG R: ACATCGTTGAAGAGATTGGCA AdPEPC3 F: TAACACTGCCCGCTACTGG R: GGTATTCTTTCCAGGCGTTG AdPEPC1;5 F: TGCGGTCTTTATCCCTGTATCT R: GGCTGTCCTCTTTCGCTTG AdPEPC2 F: CAACTTTTGTGCTGTCAGAGAA R: CAACTTTGCCCAAATAACCAT 18S rRNA F: ATTCCTAGTAAGCGCGAGTCATCAG R: CAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC

表 1 荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for fluorescent quantitative PCR

利用拟南芥PEPC蛋白序列搜索蔓花生基因组数据库，共获得9个AdPEPC基因序列，基因座位号分别为Aradu.TPI8X、Aradu.H5W76、Aradu. A52DW、Aradu.H2SP1、Aradu.3E0D8、Aradu.5IN8U、Aradu.2E0TL、Aradu.HLF4L和Aradu.D77KI，根据基因组数据库中的注释分别命名(表 2)。这9个AdPEPC分别分布在第3、5、7、8、9、10号染色体上(图 1: A)。基因结构分析显示，这些基因的序列长度差异较大，总长度为3 584~1 2956 bp，包含多个外显子和内含子，ORF长度为702~3 168 bp (图 1: B)。

图 1(Fig. 1)

图 1 蔓花生AdPEPC家族基因的染色体分布(A)和基因结构(B) Fig. 1 Chromosome distribution (A) and structure (B) of AdPEPC family genes in Arachis duranensis

表 2(Table 2)

表 2 蔓花生AdPEPC基因结构 Table 2 Structure of AdPEPC genes in Arachis duranensis 基因 Gene 类群 Group 基因座位 Locus 序列长度 Sequence length (bp) 转录长度 Transcription length (bp) 编码序列长度 CDS length (bp) 内含子数量 Number of intron AdPEPC1;1 Ⅰ Aradu.TPI8X 5 550 3 487 2 061 6 AdPEPC1;2 Ⅰ Aradu.H5W76 7 425 3 531 2 943 9 AdPEPC1;3 Ⅰ Aradu.A52DW 5 509 3 320 2 907 9 AdPEPC1;4 Ⅰ Aradu.H2SP1 6 309 3 290 2 901 9 AdPEPC4;1 Ⅱ Aradu.3E0D8 7 174 3 893 3 168 20 AdPEPC4;2 Ⅱ Aradu.5IN8U 12 956 3 596 3 141 19 AdPEPC3 Ⅲ Aradu.2E0TL 4 570 702 702 9 AdPEPC1;5 Ⅲ Aradu.HLF4L 3 619 1 627 1 341 9 AdPEPC2 Ⅲ Aradu.D77KI 3 584 1 714 1 428 10

表 2 蔓花生AdPEPC基因结构 Table 2 Structure of AdPEPC genes in Arachis duranensis

对9个蔓花生AdPEPC基因、4个拟南芥AtPEPC基因、10个大豆GmPEPC基因和来自大肠杆菌的PEPC编码的氨基酸序列构建进化树(图 2)。结果表明，AdPEPC基因可以分为3类，第一类基因(AdPEPC1;1、AdPEPC1;2、AdPEPC1;3和AdPEPC1;4)编码的氨基酸序列同源性较高，达60.91%~91.53%, 进化关系上与拟南芥和大豆中的植物型PEPC聚为一支，属于植物型PEPC；第二类的AdPEPC4;1和AdPEPC4;2基因编码的氨基酸序列间的同源性为78.41%，进化关系上与拟南芥和大豆中的细菌型PEPC以及大肠杆菌中的PEPC聚为一支，属于细菌型PEPC；第三类基因(AdPEPC3、AdPEPC1;5和AdPEPC2)编码的氨基酸序列与上述两个分支进化距离较远，与植物型和细菌型PEPC的氨基酸序列同源性不足20%，这类基因编码的蛋白明显比前两类小很多，因此将其归为序列较短的PEPC类型。

图 2(Fig. 2)

图 2 蔓花生和其它物种24个PEPC蛋白的进化树。分支上的数字为自展值。 Fig. 2 Phylogenetic tree of 24 PEPC proteins in Arachis duranensis and other species. Numbers on branches present bootstrap values.

对不同物种PEPC的氨基酸序列分析表明这些蛋白有多个保守的功能结构域^{[4, 6, 25-26]}，包括N-末端磷酸化位点、PEP结合位点、葡萄糖-6-磷酸结合位点、Mg²⁺结合位点、HCO₃^-结合位点和天冬氨酸结合位点等。分析表明，蔓花生的第一类AdPEPC蛋白C-末端具有QNTG序列，其中大部分在N-端有1个反向磷酸化位点(-SIDAQL-)，符合植物型PEPC的序列特征^{[4, 25-26]}；第二类AdPEPC蛋白C-末端为R/KNTG序列，属于细菌型PEPC^{[3, 25]}，这两种类型AdPEPC都含有主要的保守结构域(图 3)。而序列较短的第三类AdPEPC蛋白无反向磷酸化位点以及C-末端保守域，既不属于细菌型PEPC，也不属于植物型PEPC，只含有HCO₃^-结合位点和部分PEP结合位点，多个关键保守序列缺失。其中AdPEPC1;5和AdPEPC2的C-末端3个氨基酸序列中含有不带N的LG同源序列，可能属于古细菌型PEPC^[26]。

图 3(Fig. 3)

图 3 AdPEPC蛋白家族成员的多序列比对及保守结构域分析。保守结构域：VLTAHPT (Box Ⅰ); DXRQE (Box Ⅱ); GYSDSG/AKDAG (Box Ⅲ); FHGRGGXXGRGG (Box Ⅳ); GSRPXXR (Box Ⅴ)。 Fig. 3 Multiple alignment and conserved domain analysis of AdPEPC in Arachis duranensis. Conserved domains: VLTAHPT (Box Ⅰ); DXRQE (Box Ⅱ); GYSDSG/AKDAG (Box Ⅲ); FHGRGGXXGRGG (Box Ⅳ); GSRPXXR (Box Ⅴ).

对9个AdPEPC的理化性质进行预测分析, 结果表明(表 3)，植物型AdPEPC分子量为78.4~ 112.29 kD，细菌型AdPEPC分子量为117.32~ 118.48 kD, 序列较短类型AdPEPC的分子量为25.25~54.66 kD。大部分AdPEPC蛋白的等电点为4.94~6.85，为带负电荷蛋白，只有细菌型的AdPEPC4;2等电点为8.2，带正电荷。大部分AdPEPC蛋白的不稳定系数小于40，预测为稳定蛋白，只有植物型的AdPEPC1;1和序列较短的AdPEPC3预测为不稳定蛋白。对蛋白进行亲/疏水性预测，9个AdPEPC的GEAVY值均为负值，说明这些蛋白均为亲水性蛋白。

表 3(Table 3)

表 3 蔓花生9个PEPC家族成员蛋白的理化性质 Table 3 Physical and chemical properties of 9 PEPCs in Arachis duranensis 蛋白 Protein 氨基酸数量 Number of amino acid 分子量 MW (kD) 等电点 pI 带负电荷残基数目 Number of negative charged residues (Asp+Glu) 带正电荷残基数目 Number of positive charged residues (Arg+Lys) 稳定性 Stability 总平均亲水性 Average of hydropathicity (GRAVY) 脂溶指数 Aliphatic index AdPEPC1;1 686 78.40 6.33 95 90 稳定Stable -0.355 88.44 AdPEPC1;2 980 112.29 5.92 145 127 不稳定Unstable -0.386 91.46 AdPEPC1;3 968 110.74 5.91 144 128 不稳定Unstable -0.399 89.29 AdPEPC1;4 966 110.30 5.65 144 122 不稳定Unstable -0.387 89.15 AdPEPC4;1 1 055 118.48 6.25 144 132 不稳定Unstable -0.384 92.26 AdPEPC4;2 1 046 117.32 8.30 128 133 不稳定Unstable -0.405 97.93 AdPEPC3 233 26.53 6.85 27 27 稳定Stable -0.485 77.81 AdPEPC1;5 446 51.08 4.94 67 47 不稳定Unstable -0.135 95.54 AdPEPC2 475 54.60 5.29 70 56 不稳定Unstable -0.150 100.15

表 3 蔓花生9个PEPC家族成员蛋白的理化性质 Table 3 Physical and chemical properties of 9 PEPCs in Arachis duranensis

对蔓花生根、茎、叶、花等组织中AdPEPC基因进行实时荧光定量PCR分析，结果表明(图 4), 除AdPEPC1;2和AdPEPC4;2在茎中的表达量较高外，其他基因尤其是AdPEPC2、AdPEPC1;5和AdPEPC1;3在花中的表达量明显高于其他组织；除AdPEPC1;1、AdPEPC1;2、AdPEPC4;1和AdPEPC1;3在叶中的表达量略高于根之外，其他基因在根中的表达量高于叶片；AdPEPC1;5基因在叶中未检测到表达；AdPEPC3在根、茎、叶、花中均检测不到表达。

图 4(Fig. 4)

图 4 AdPEPC基因家族在蔓花生不同组织中的表达。18S rRNA为内参基因; R:根; S:茎; L:叶; F:花。 Fig. 4 Expression of family genes in different tissues of Arachis duranensis. 18S rRNA was used as reference gene; R: Root; S: Stem; L: Leaf; F: Flower.

植物PEPC的保守功能结构域是影响PEPC活性的关键区域，本研究结果表明，大部分AdPEPC具有与大肠杆菌、拟南芥、水稻、甘蔗和大豆等物种PEPC相似的N-末端、C-末端和BoxⅠ~Ⅴ等典型保守序列特征^{[4, 6-8, 25]}，大部分AdPEPC含有在大豆PEPC中经实验验证的功能结合位点^[4](图 3)。除植物型和细菌型AdPEPC外，在蔓花生中存在3个序列较短的AdPEPC，由于大段序列的缺失，与植物型和细菌型AdPEPC的氨基酸序列同源性很低。这些差异可预示不同的家族成员可能具有不同的功能和作用模式。

有研究比较了栽培花生品种中5个AhPEPC基因在组织中的表达情况，不同基因在不同的花生品种中表达模式存在较大差异，部分成员在根、叶或种子发育部分时期表达量较高，但未对花中的表达进行检测^{[10, 27]}。本研究结果表明，AdPEPC家族基因大部分成员在花和茎中的表达量较高，这可能与蔓花生生长缓慢、叶片细小而蔓生茎较发达等生长特点有关，同时盛花期的花组织也处于代谢相关基因表达活跃的发育阶段。值得注意的是，AdPEPC1;5和AdPEPC2在花中的表达量远高于其他组织，这2个基因编码的氨基酸序列特征与进化上较保守的古细菌型PEPC相似^{[26, 28]}。古细菌型PEPC通常分子量较小，具有不同于其他PEPC的变构调节特征^[28], 但催化机制与其他PEPC相同^[28]。有研究表明，一些细菌型PEPC基因在高等植物花粉等组织中有明显高于根、茎、叶等组织的表达模式，推测这些基因的功能对于花粉发育具有重要意义^[29]，蔓花生中在花组织高表达的AdPEPC也可能在花发育过程具有较专一的特殊功能。序列最短的AdPEPC3在4种组织中均检测不到表达，该基因编码的氨基酸序列中多个保守序列及末端特征序列缺失，基因组数据注释中无上游5′非翻译区(5′ UTR)起始调控序列, 推测该基因为假基因。关于这些基因的功能需要在后续的研究中进行更为深入的分析。