2018, Vol. 26
2. 福建省农业科学院作物研究所, 福州 350013
2. Crop Sciences Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China
叶片正面绿色、背面紫色的紫背天葵(Cynura bicolor)，俗称紫背菜、红凤菜、观音菜及血皮菜等[1], 为菊科(Asteraceae)三七草属植物。其嫩茎叶除含有叶绿素外还富含花青素，可做保健蔬菜、观叶植物及天然花青素来源[2-4]。植物花青素兼具营养、药理以及在基因工程中改良花色等[5-7]作用，具有重要的研究及应用价值。花青素合成代谢途径涉及结构及调控两类基因[8]，其中结构基因编码花青素合成代谢途径中所需的酶，花青素合成特有的酶主要有DFR、ANS和3GT等3种[9-10]。而花青素合成代谢调节基因编码转录因子，主要通过与结构基因的启动子结合来调控表达，从而影响花青素的时空积累。花青素调控的转录因子主要包括MYB、bHLH和WD40等3种[11]，其中MYB转录因子是一类DNA结合蛋白，由MYB结构域构成，这些结构域都是由高度保守的氨基酸连续或间隔的序列拼接后再通过折叠成HHTH结构(螺旋-螺旋-转角-螺旋)来识别DNA并与之结合，达到调控基因表达的目的[12-13]。MYB是花青素合成代谢中涉及最广泛的调控因子，依据R基序的数量，MYB一般分为4类，以含有2个基序的R2R3-MYB最多[14-15]，此外还包括R3-MYB、R1R2R3-MYB和R1R2R1R2-MYB等[16]。bHLH (碱性螺旋-环-螺旋，也作MYC)转录因子也是由一系列保守的bHLH氨基酰序列构成，通过N末端碱性氨基酸区域结合DNA来调控基因表达[17]。WD40也是一类由一段高度保守的氨基酸序列串联重复的蛋白，这些序列都是从N端GH二肽开始到C端WD结尾，该蛋白不能直接作用DNA，只是通过形成蛋白质骨架参与多个蛋白基因的相互作用[18]。研究表明，花青素生物合成一般由bHLH和R2R3-MYB[19-21]或由MYB、bHLH和WD40形成MBW三聚复合体[22-23]来调节和影响结构基因表达。
近年来，二代高通量转录组测序技术已广泛应用于多种生物特定状态下全转录功能基因组测序, 大量新的功能基因被发现甚至被利用[24-25]。本研究以Illumina HiSeq 2500技术进行紫背天葵嫩茎叶高通量测序，通过多种生物信息学方法进行大量的基因簇(Unigene)功能注释，然后再通过Pfam、Swiss-Prot和Nr等3个公共数据库进行花青素相关调控基因MBW (MYB、bHLH和WD40)搜索及相关信息分析，为紫背天葵或其他植物花青素合成代谢相关调控因子的研究奠定基础。
1 材料和方法 1.1 材料和转录组测序从福建省农业科学院亚热带农业研究所野特菜资源圃选取紫背天葵健壮枝条扦插于穴盘，约45 d后将整盆植株小苗送至北京百迈克测序公司进行Illumina HiSeq 2500测序平台测序，参照张少平等[26]的方法，对3株紫背天葵嫩茎叶进行总RNA提取、等量组合RNA池、mRNA富集及反转录成cDNA、测序文库制备等，最后进行测序数据拼接。
1.2 功能注释及MBW相关数据分析将测序拼接获取的紫背天葵Unigene通过非冗余蛋白数据库(Nr)、蛋白质序列数据库(SwissProt)、蛋白质家族域数据库(Pfam)、基因本体论数据库(GO)、蛋白质直系同源数据库(COG)以及东京基因与基金组百科全书(KEGG)等数据库进行注释分析。根据注释获取的结果，进一步进行MYB、bHLH和WD40等调控因子关键词搜索，根据是否与花青素合成代谢相关再进行归类，同时分别对获取的MBW相关调控因子进行FPKM及核苷酸序列长度等分析。
2 结果和分析 2.1 MYB相关的Unigene信息分析根据六大数据库注释，仅从Pfam、SwissProt和Nr等3个公共数据库中共获取不同MYB相关调控因子42个。从Nr数据库注释信息可知(表 1), 编码ID为c30845~c23218中共有11个MYB调控因子与花青素合成代谢相关，这些花青素合成相关调控因子的FPKM值为0~838.1，序列长度为219~ 2 261 bp。其中Nr数据库注释到的11个花青素合成代谢相关调控因子中，分别来自葡萄(Vitis vinifera, 3个Unigene)、非洲菊(Gerbera, 3个)、长春花(Catha-ranthus roseus, 3个)以及向日葵(Helianthus annuus)和甜菜(Beta vulgaris)各1个。这11个MYB相关调控因子在SwissProt数据库中共注释到9个Unigene, 来自拟南芥(Arabidopsis thaliana, 8个Unigene)和马铃薯(Solanum tuberosum, 1个)；此外，以上MYB相关调控因子在Pfam数据库中只注释到5个Unigene。
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表 1 MYB相关Unigene信息分析 Table 1 Information of MYB-related Unigene |
编码ID为c6955~c20765的共31个MYB相关调控因子中，目前还未见报道与花青素合成代谢相关，因此其功能代谢调控还有待进一步深入研究。所有这些MYB调控因子的FPKM值为2.32~ 185.63，序列长度为205~1 891 bp，主要来自拟南芥、马铃薯及芝麻(Sesamum indicum)等。
2.2 bHLH相关的Unigene信息分析从Pfam、SwissProt和Nr等3个公共数据库中，共获得67个bHLH相关调控因子。从Nr数据库注释信息可知(表 2)，编码ID为c36981~c20263中共有33个bHLH调控因子与花青素合成代谢相关, 其FPKM为1.03~244.34，序列长度为202~1 708 bp。这些调控因子分别来自葡萄(14个Unigene)、桃(Prunus persica, 3个)、柑橘(Citrus sinensis, 2个)、大丽花(Dahlia pinnata, 2个)、莲(Nelumbo nucifera, 2个)以及猴面花(Erythranthe guttata)、甜菜、苹果(Malus domestica)、番茄(Lycopersicon esculentum)、草莓(Fragaria vesca)和川桑(Citrus clementina)各1个。这些调控因子在SwissProt数据库中共注释到30个Unigene，来自拟南芥(28个Unigene)和豌豆(Pisum sativum, 2个)。此外，以上bHLH相关调控因子在Pfam数据库中共注释到了18个Unigene。
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表 2 bHLH相关的Unigene信息分析 Table 2 Information of bHLH-related Unigenes |
编码ID为c37200~c18704中共有34个bHLH相关调控因子，目前还未见报道与花青素合成代谢相关，其FPKM值为0.64~89.51，序列长度为239~ 1 713 bp，主要来自拟南芥、烟草(Nicotiana sylvestri)、马铃薯和可可(Theobroma cacao)等。
2.3 MYB和bHLH结合蛋白相关的Unigene信息在Pfam公共数据库中，共注释到15个bHLH和R2R3-MYB相关结合蛋白，这些结合蛋白在Nr和SwissProt数据库中大多注释为bHLH或相应的基因别称。从Nr数据库注释信息可知(表 3)，c9372、c6720、c15452、c24314、c24516和c23161等6个Unigene与花青素合成代谢相关，其FPKM值为2.39~67.68，序列长度为360~2 664 bp。Nr数据库注释到的6个花青素合成代谢相关调控因子，涉及到的植物有大丽花(2个Unigene)以及莲、紫背天葵(Gynura bicolor)、葡萄和甘野菊(Chrysanthemum boreale)各1个。这6个调控因子在SwissProt数据库中共注释到5个Unigene，涉及植物有拟南芥(3个Unigene)和豌豆(2个)。
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表 3 bHLH及R2R3-MYB相关Unigene信息分析 Table 3 Information of bHLH and R2R3-MYB-related Unigenes |
编码ID为c33892~c21592中共有9个相关结合蛋白调控因子，目前还未见报道与花青素合成代谢相关，因此还有待进一步深入研究。从全转录功能基因组测序分析可知，这些调控因子的FPKM值为2.44~55.9，序列长度为215~2 330 bp，涉及的植物主要有拟南芥，此外还有梨(Pyrus)、马铃薯、杨树(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)和烟草等。
2.4 WD40相关的Unigene信息分析在Pfam、SwissProt及Nr等3个公共数据库中, 共注释到14种WD40相关调控因子。从Nr数据库注释信息可知(表 4)，有c7535、c23326和c20388等3个Unigene与花青素合成代谢相关，其中c7535序列长度为562 bp，FPKM值为6.64，在Nr数据库中来自葡萄，而在Pfam数据库中来自拟南芥; c23326序列长度为2 438 bp，FPKM值为113.28, 在Nr数据库中来自柑橘，而在Pfam数据库中未注释到；而c20388序列长度为1 672 bp，FPKM值为130.54，在Nr数据库中来自莲，而在Pfam数据库中来自拟南芥。
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表 4 WD40相关Unigene信息分析 Table 4 Information of WD40-related Unigenes |
在编码ID为c30814~c23391中共有11个WD40相关调控因子，还未见报道与花青素合成代谢相关。从全转录功能基因组测序分析可知，FPKM值为3.09~190.22，序列长度为296~3 872 bp，在Nr及SwissProt数据库中所有Unigene主要来自可可和拟南芥，此外还有胡杨(Populus euphratica)、烟草、马铃薯以及紫草(Lithospermum erythrorhizon)、衣藻(Chlamydomonas smithii)和苜蓿(Medicago sativa)等。
3 结论和讨论植物花青素具有突出的药用和营养价值，同时在基因工程改良花色中具有重要的经济效益。因此，对花青素代谢途径及其分子调控机理的研究一直是现代分子生物学领域的热点[27]。多年来，关于植物花青素合成代谢途径的研究大多集中在结构基因上，而有关调控基因的研究也主要是在少量模式植物中[28]，从其他高等植物中分离到的MBW (MYB、bHLH、WD40)相关调控因子成员相对单一，因此，大多成员的特征特性及相关功能未能得到进一步分析。本研究采用二代高通量测序技术对紫背天葵全转录功能基因组进行测序，再分别通过Pfam、SwissProt及Nr等3个公共数据库进行MYB、bHLH、WD40等关键词搜素，其中Pfam注释到MBW相关基因共83个，包括23个MYB、34个bHLH、15个bHLH-MYB及11个WD40或相关基因别称；SwissProt注释到MBW相关基因共115个，包括34个MYB、60个bHLH、13个bHLH-MYB和8个WD40或相关基因别称；Nr共注释到MBW相关基因共118个，包括26个MYB、67个bHLH、11个bHLH-MYB和14个WD40或相关基因别称。从3大数据库中共获得138个MBW相关Unigene，包括42个MYB、67个bHLH、15个bHLH-MYB和14个WD40，以上注释到MBW相关调控因子Unigene以来自拟南芥的最多。
在所有138个MBW相关调控因子中，目前已报道与花青素合成代谢相关的MYB、bHLH、bHLH-MYB和WD40分别为11、33、6和3个, 分别来自葡萄、大丽花、非洲菊、长春花、桃、柑橘、向日葵、甜菜、猴面花等近20种植物。植物花青素合成代谢相关调控基因的研究已引起广泛关注，在紫背天葵中也有少量报道[29-30]，但有关MBW相关调控因子的系统研究仍集中在少量模式植物。目前从拟南芥中分离克隆出MYB家族成员339个，bHLH家族成员150个，WD家族成员237个，而从水稻中分离克隆出的MYB家族成员也达到230个[31]。本研究从紫背天葵转录功能基因组测序中获得的MBW相关调控基因较之偏少，这可能是由于不同植物的本质特征决定，同时，也可能是由于MBW相关调控因子在参与植物合成代谢过程中受到光照、低温、干旱、激素以及病原感染等逆境胁迫的影响，同一植物在不同状态下MBW相关调控因子表达量不同甚至存在变异，从而导致不同MBW相关调控因子家族基因数量差异明显。本研究所获得的138个MBW相关Unigene，通过进一步鉴定和分析，可了解紫背天葵花青素合成调控机理，为进一步利用基因工程开展植物遗传改良等具有重要的理论指导意义。
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