铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科(Orchidaceae)石斛属多年生附生草本植物^[1]。作为我国传统的名贵中药材，铁皮石斛在《中华人民共和国药典》中收录，具有益胃生津, 滋阴清热的功效^[2]。现代药理研究证实，铁皮石斛能降血糖、抗氧化、提高机体免疫力，且对多种肿瘤细胞具有抑制作用^[3-6]。铁皮石斛的养生功效已越来越受到消费者的认可，市场需求日益增大，然而由于遭到人为的过度采挖，加上自然繁殖速度极其缓慢，野生铁皮石斛资源已濒临灭绝。为实现铁皮石斛产业的可持续发展，人工规模化种植是大势所趋，而优良品种的选育和种苗生产是人工规模化种植的前提条件之一。我国铁皮石斛种质资源分布广泛^[7]，遗传多样性丰富^[8]，且近年来，铁皮石斛种质资源的收集和评价研究已取得一定进展^[9-11], 这都为优良品种的选育创造了十分有利的条件。同时，人工辅助授粉技术的应用，使铁皮石斛座果率低的问题得到很大改善^[12-13]，为种苗生产提供了更为丰富的材料基础。据文献调查，在种质水平上对铁皮石斛人工授粉技术的研究仍鲜有报道，而这是铁皮石斛种质资源收集和评价研究中非常重要的一部分。

本研究分别在2013年和2016年，对种植于中国科学院华南植物园铁皮石斛种质圃中的不同产地来源的铁皮石斛种质，进行自花授粉、同株异花授粉、种质内异株授粉和种质间授粉等4种方式的人工授粉，观察比较授粉的成功率、座果率和种子萌发率，以期为铁皮石斛的良种选育和种苗生产提供参考。

试验材料取自中国科学院华南植物园铁皮石斛种质圃，该种质圃收集了来自湖南、广西、浙江、安徽、云南、四川、福建等多个省、市、地区的170余份铁皮石斛种质资源，包括野生种质、农家品种等。本研究随机选取了46个种质进行试验(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 试验材料 Table 1 Materials tested 种质 Germplasm 产地 Origin 来源 Source TH1 湖南Hunan 农家品种Native variety TH2 湖南Hunan 野生Wild TH3 湖南Hunan 农家品种Native variety TH4 湖南Hunan 农家品种Native variety TX1 广西Guangxi 野生Wild TX2 广西Guangxi 农家品种Native variety TX3 广西Guangxi 野生Wild TX4 广西Guangxi 农家品种Native variety TX5 广西Guangxi 农家品种Native variety TX6 广西Guangxi 农家品种Native variety TX7 广西Guangxi 野生Wild TX8 广西Guangxi 野生Wild TX9 广西Guangxi 野生Wild TX10 广西Guangxi 农家品种Native variety TX11 广西Guangxi 野生Wild TX12 广西Guangxi 野生Wild TX13 广西Guangxi 农家品种Native variety TZ1 浙江Zhejiang 农家品种Native variety TZ2 浙江Zhejiang 农家品种Native variety TZ3 浙江Zhejiang 农家品种Native variety TZ4 浙江Zhejiang 农家品种Native variety TA1 安徽Anhui 农家品种Native variety TA2 安徽Anhui 农家品种Native variety TD1 广东Guangdong 农家品种Native variety TD2 广东Guangdong 农家品种Native variety TY1 云南Yunnan 农家品种Native variety TY2 云南Yunnan 农家品种Native variety TY3 云南Yunnan 农家品种Native variety TY4 云南Yunnan 农家品种Native variety TY5 云南Yunnan 农家品种Native variety TY6 云南Yunnan 农家品种Native variety TY7 云南Yunnan 农家品种Native variety TY8 云南Yunnan 农家品种Native variety TY9 云南Yunnan 农家品种Native variety TY10 云南Yunnan 农家品种Native variety TY11 云南Yunnan 野生Wild TY12 云南Yunnan 农家品种Native variety TY13 云南Yunnan 野生Wild TS1 四川Sichuan 农家品种Native variety TS2 四川Sichuan 农家品种Native variety TF1 福建Fujian 农家品种Native variety TB1 不详Unkown 农家品种Native variety TB5 不详Unkown 农家品种Native variety TB7 不详Unkown 农家品种Native variety TB12 不详Unkown 农家品种Native variety TB14 不详Unkown 农家品种Native variety

表 1 试验材料 Table 1 Materials tested

人工授粉   铁皮石斛种质采用4种方式进行人工授粉, (1)自花授粉：用本花朵的花粉块进行授粉; (2)同株异花授粉：同株不同花朵间授粉；(3)种质内异株授粉：同一种质不同植株的花朵间授粉; (4)种质间授粉：不同种质的花朵间授粉。在5-6月盛花期, 随机选取各种质开花2~3 d的健康花朵参照王聪^[14]的方法进行授粉。授粉后及时挂牌, 标记授粉方法和日期，授粉后2周统计授粉成功率和座果率。

种子萌发率检测   授粉后120 d采收果实, 参照钱文林等^[15]的方法将果实进行无菌播种。每个果实播7瓶，每个处理重复3次。培养温度(27±2)℃，荧光灯光源，光照周期12 h d^–1，光照强度30~ 40 μmol m^–2s^–1。培养基配方：1/2MS培养基(大量元素减半)附加0.5 mg L^–1 NAA，活性炭0.3 g L^–1，香蕉50 g L^–1，苹果10 g L^–1，琼脂4.6 g L^–1，pH调至5.4。在播种后第5天开始每天观察种子萌发情况, 在播种后第30天统计种子萌发率。观察时，每个处理随机取3瓶，每瓶取3个视野，于体视显微镜下观察统计。铁皮石斛种子萌发成苗的生长时期划分参照叶秀粦等^[16]和Zeng等^[17]的方法。

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0软件进行数据处理和分析。

授粉未成功的花朵会在授粉后的2~3 d枯萎凋落，授粉成功的花朵则花瓣逐渐萎蔫，子房逐渐膨大。从表 2可以看出，不同授粉方式的授粉成功率不同，其中不同种质间的授粉成功率最高，可达100%，其次分别为种质内异株授粉和同株异花授粉，自花授粉成功率最低，仅为31.3%。表明铁皮石斛具有较高的杂交亲和性，同时存在自交不亲和现象。采用不同种质作为双亲的授粉方式，可提高铁皮石斛人工授粉的成功率。

表 2(Table 2)

表 2 授粉成功率 Table 2 Pollination success rate 授粉方式 Pollination type 种质数量 Number of germplasms 授粉成功种质数量 Number of germplasms successfully pollinated % 自花授粉Autogamy 32 10 31.3 同株异花授粉Geitonogamy 8 3 37.5 种质内异株授粉Crossing within germplasm 8 4 50.0 种质间授粉Crossing between germplasms 21 21 100.0

表 2 授粉成功率 Table 2 Pollination success rate

从表 3可看出，对TX3等32个种质进行自花授粉，不同种质的自花授粉座果率相差很大，其中TX3种质的座果率较高，达90%，TX1等9个种质的座果率为7.3%~36.4%，其余22个种质的座果率均为0。对TX10等8个种质进行同株异花授粉, 其中TX10、TS1、TF1种质的座果率分别达到35.0%、8.7%和6.7%，其余5个种质的座果率均为0。对TS1等8个种质进行种质内异株授粉，其中TS1、TX10、TF1、TH3种质的座果率分别为68.4%、61.9%、60.0%、57.1%，其余4个种质的座果率均为0。对TY4等21个种质进行种质间授粉，座果率为7.7%~100%，其中有21组处理的座果率超过70%，有16组处理的座果率高达100%。

表 3(Table 3)

表 3 不同授粉方式下的座果率 Table 3 Fruit setting under different pollination type 授粉方式 Pollination type 种质 Germplasm 授粉花朵数 Number of flowers pollinated 座果花朵数 Number of flowers setting % 自花授粉 Autogamy TX3 40 36 90.0 TX1 31 11 35.5 TX5 21 6 28.6 TX10 36 10 27.8 TH1 33 12 36.4 TH3 25 4 16.0 TA1 25 5 20.0 TZ1 27 6 22.2 TD2 34 4 11.8 TY1 41 3 7.3 TX2 34 0 0 TX4 28 0 0 TX6 27 0 0 TX7 26 0 0 TX8 30 0 0 TX9 21 0 0 TH2 30 0 0 TZ2 22 0 0 TZ3 50 0 0 TZ4 26 0 0 TY2 39 0 0 TY3 30 0 0 TY4 53 0 0 TY5 29 0 0 TY6 31 0 0 TY7 21 0 0 TY8 29 0 0 TY9 51 0 0 TY10 45 0 0 TY11 24 0 0 TS1 30 0 0 TF1 32 0 0 同株异花授粉 Geitonogamy TX10 20 7 35.0 TS1 23 2 8.7 TF1 30 2 6.7 TY4 22 0 0 TH2 22 0 0 TX7 21 0 0 TX9 20 0 0 TZ4 22 0 0 种质内异株授粉 Crossing within germplasm TS1 19 13 68.4 TX10 21 13 61.9 TF1 35 21 60.0 TH3 21 12 57.1 TY4 21 0 0 TH2 26 0 0 TX9 30 0 0 TZ4 22 0 0 种质间授粉 Crossing between germplasms TY4×TY9 31 31 100.0 TY9×TY4 30 30 100.0 TX6×TY5 26 26 100.0 TY5×TX6 26 26 100.0 TX6×TY6 30 30 100.0 TY6×TX6 30 30 100.0 TY12×TX3 23 19 82.6 种质间授粉 Crossing between germplasms TX3×TY12 24 22 91.7 TY9×TY11 35 11 31.4 TY11×TY9 34 5 14.7 TB1×TY4 31 31 100.0 TY4×TB1 31 31 100.0 TB7×TX3 23 23 100.0 TX3×TB7 23 23 100.0 TH2×TS1 30 30 100.0 TS1×TH2 30 30 100.0 TB7×TY11 28 28 100.0 TY11×TB7 29 29 100.0 TX7×TS1 33 33 100.0 TS1×TX7 33 33 100.0 TH3×TS2 30 21 70.0 TS2×TH3 29 23 79.3 TX5×TX3 30 24 80.0 TX9×TB14 31 9 29.0 TX10×TB14 28 18 64.3 TZ4×TB12 26 2 7.7

表 3 不同授粉方式下的座果率 Table 3 Fruit setting under different pollination type

同时，对比同一种质在不同授粉方式下的座果率，TX10种质在自花授粉、同株异花授粉、种质内异株授粉和种质间授粉的座果率分别为27.8%、35.0%、61.9%和64.3%，而TS1种质相应的座果率分别为0、8.7%、68.4%和100%，均呈现依次递增的现象，其余种质虽未能同时完成4种授粉方式，但也表现出一致的趋势。这表明在铁皮石斛种质中存在明显的自交不亲和现象，大多数种质的自交不亲和程度较高。

另外，种质间授粉处理中，双亲正反交组合的座果率较为一致，说明细胞质对座果率基本没有影响。

对TX5等4个种质在不同授粉方式下所得果实进行无菌播种。从表 4可见，TX5和TA1种质通过种质间授粉后种子的萌发率均显著高于自花授粉(P < 0.05，下同)，且在萌发速度方面，TX5通过种质间授粉所得的种子，在播种第30天时萌发进入3期的种子比例显著高于自花授粉，而TA1通过种质间授粉所得的种子萌发进入2期的比例显著高于自花授粉，表明这两个种质通过种质间授粉后，种子的萌发速度均快于自花授粉。同样的，TF1通过种质内异株授粉后种子的萌发率显著高于同株异花授粉，且前者种子的萌发速度也显著快于后者。TS1通过种质间授粉后种子的萌发率显著高于种质内异株授粉和同株异花授粉，且种质内异株授粉高于其他3种授粉方式得到的铁皮石斛种子具有更强的萌发能力。

表 4(Table 4)

表 4 不同授粉方式下的种子萌发率 Table 4 Seed germination rate under different pollination type 种质 Germplasm 授粉方式 Pollination type 萌发时期 Germination stage 萌发率/% Germination rate 0 1 2 3 4 5 TX5 自花授粉 Autogamy 29.3±4.4a 2.3±0.9a 67.7±5.2a 0b 0a 0a 70.7±4.4b TX5×TX3 0.7±0.7b 0.7±0.7a 67.7±8.1a 31.3±8.7a 0a 0a 99.3±0.7a TA1 自花授粉 Autogamy 77.7±5.6a 3.3± 3.3a 19.0±7.1b 0a 0a 0a 22.3±5.6b TA1×TZ3 33.7±3.7b 2.7±0.9a 62.3± 3.3a 1.0± 0.6a 0a 0a 66.3±3.7a TF1 同株异花 Geitonogamy 39.7±3.7a 20.7±1.7a 39.3±3.3b 0.3±0.3b 0a 0a 60.3±3.7b 种质内异株 Crossing within germplasm 13.0±1.5b 5.0±1.5b 53.3±3.4a 28.3± 3.3a 0a 0a 87.0±1.5a TS1 同株异花 Geitonogamy 44.0±12.5a 6.3± 0.9a 39.7±13.2a 10.0± 3.6a 0a 0a 56.0±12.5b 种质内异株 Crossing within germplasm 24.3±1.8ab 13.7±3.8a 57.0±6.0a 5.0± 3.6a 0a 0a 75.7±1.8ab TS1×TH2 11.0±1.5b 7.3±2.8a 65.7±6.0a 16.0±7.0a 0a 0a 89.0±1.5a TS1×TX7 8.7±4.2b 6.0± 1.0a 64.3±3.5a 21.0±4.6a 0a 0a 91.3±4.2a 相同种质同列数据后不同字母表示差异显著(P < 0.05)。 Data followed different letters within column of the same germplasm indicate significant difference at 0.05 level.

表 4 不同授粉方式下的种子萌发率 Table 4 Seed germination rate under different pollination type

狭义上的自交是指同一花朵内的花粉传粉，而广义上，同一花朵内花粉传粉、同一植株上的花朵传粉、同一品种内或同一基因型不同个体间传粉等均称为自交^[18]。植物的自交不亲和性是植株的雌蕊对自身花粉和异体花粉进行识别，并能抑制自身花粉或同一品系内的异株花粉在自身的柱头上萌发或生长的现象，是植物在长期进化过程中形成的有利于异花授粉的一种生殖隔离^[19]。自交不亲和现象普遍存在于自然界中，兰科石斛属的大多数植物是自交不亲和的，而不同种的石斛自交不亲和程度各异^[20-23]。在本研究中，自花授粉、同株异花授粉和种质内异株授粉均为广义上的自交，3种授粉方式因花粉是否来源于母本花朵或母本植株而异。研究结果表明，大多数铁皮石斛种质自花授粉不成功或座果率低，种质间授粉均能成功且座果率高，而同株异花授粉和种质内异株授粉的成功率和座果率均介于二者之间，这从种质水平证实，铁皮石斛中存在自交不亲和现象，且不同种质自交不亲和程度不同，但种质间似乎不存在交配不亲和现象，通过种质间授粉可大大提高铁皮石斛授粉成功率和座果率。

繁育系统对物种进化和遗传多样性起着至关重要的作用，而交配系统被认为是繁育系统的核心^[24]。高等植物的繁育系统非常复杂，有以自花授粉为主的，自交异交混合的，也有完全异交的^[25]。异交更有利于物种的生存和进化，而自交也有许多优势，如占据新生境、克服传粉媒介的短缺、维持种群的局部适应以及直接获得亲本的优良性状等^[26]。一般来说，恶劣的传粉条件会导致自交率的上升^[27]，铁皮石斛种质生境的多样性应该是造成不同种质自花授粉座果率差异的原因。朱波等^[12]报道铁皮石斛自交结实率为7.3%，且推测前人报道的药用石斛自交结实率为25.0%~75.0%是种内杂交所致。本研究中，铁皮石斛TX3种质的自花授粉座果率可高达90.0%，且TD2、TH1等8个种质的座果率也达11.8%~36.4%，表明较高的自花授粉座果率是可以达到的，前提是选择座果率较高的种质。

自交使种群内纯合体的比例增加，不可避免地会导致种群内有害基因的积累，进而导致近交衰退^[27]。近交衰退主要表现为个体间遗传多样性和后代适合度的损失，而后代适合度主要体现在结实率、种子数量和质量，以及种子萌发和后代生长等方面^[24]。近交衰退在兰科植物中较常见，Tremblay等^[28]报道兰科植物通过自花授粉会降低有活力胚的种子量，王晓静等^[29]对流苏石斛(Dendrobium fimbriatum)的研究也证实了这一点。本研究中，不同铁皮石斛种质自花授粉、同株异花授粉、种质内异株授粉和种质间授粉下种子的萌发率和萌发速度均呈现依次递增的趋势，表明近交衰退也存在于铁皮石斛中，因此种质间授粉可作为铁皮石斛良种选育的主要技术手段。

本研究结果初步表明，有28.6%的野生种质可成功自花授粉，32.0%的农家品种成功自花授粉, 野生种质和农家品种在自花授粉座果率上不存在明显差别。57.1%的以农家品种为母本、野生种质为父本的种质间授粉组合座果率达100%，同时也有57.1%的以野生种质为母本、农家品种为父本的种质间授粉组合座果率达100%，且此二者恰是对应的正反交关系，这表明亲本的正反交方式，即细胞质对种质间授粉的座果率影响不大。目前，匮乏的铁皮石斛野生种质资源已很难支撑优良品种的选育，而农家品种因已经过一定的人工选择，具有许多优良性状，是今后铁皮石斛良种选育的主要亲本资源。因此，在铁皮石斛种质资源收集和评价研究工作中，对铁皮石斛野生种质和农家品种的人工授粉特性进行系统研究显得很有必要。