2018, Vol. 26
2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室, 海口 571101;
3. 海口市人民医院药学部, 海口 570208
2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China;
3. Department of Pharmacy, Haikou People's Hospital, Haikou 570208, China
黄皮[Clausena lansium (Lour.) Skeels]为芸香科(Rutaceae)黄皮属植物，是热带亚热带常绿果树，又名油皮，油梅，黄批，鸡皮果，黄罐子[1]。原产于我国南方，至今已有1 500年的历史, 在我国两广、海南、福建、台湾等地均有较广泛栽培，民间多用于治疗食积胀满，脘腹疼痛，疝疼，痰饮、咳喘等症[2]。迄今，国内外对黄皮化学成分及生物活性方面的研究主要集中于根、茎、叶上，对种子的研究较少。生物碱是黄皮中重要的特征性成分之一，具有保肝[3]、抗老年痴呆[4]、抗肿瘤[5]、抑菌[6]等活性，存在潜在的开发价值。在本次研究中通过分析黄皮种子的乙醇提取物发现，其中存在大量的生物碱, 而黄皮种子在日常生活中因其不可食用而往往被废弃。因此，研究黄皮种子中的生物碱及其生物活性既有利于对黄皮种子的再次利用，同时也能丰富黄皮中生物碱的结构类型及生物活性，为其临床应用及资源的合理开发奠定基础。本次试验结合色谱学与波谱学方法对黄皮种子中的酰胺类生物碱进行分离与鉴定，旨在筛选出黄皮种子中具有优良全齿复活线虫致死活性的酰胺类生物碱，为其创新农药的研制提供理论和物质基础。
1 材料和方法 1.1 试验材料试验材料 样品于2011年5月购自海南省儋州市，经中国热带农业科学院热带生物技术研究所王军博士鉴定为黄皮[Clausena lansium (Lour.) Skeels]。标本(CL20110501)现存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。
仪器 旋转蒸发仪(Heidolph公司)；安捷伦1260分析型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；戴安SUMMITP680A半制备高效液相色谱仪(戴安，美国)；质谱仪(Micromass Autospec-UitimaTOF)；核磁共振波谱仪(Brucker AV-500，以TMS为内标)；超净工作台(上海博讯实业有限公司); 万分之一电子秤(北京赛多利斯天平有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；超纯水装置(厦门锐思捷水纯化技术有限公司)。
填料 柱层析硅胶(200~300目，60~80目) (青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20和RP-18填料(德国Merck公司)；Dl01型大孔吸附树脂(山东鲁抗医药股份有限公司)。
试剂 常用分析纯有机溶剂购自广州化工和天津大茂等公司；PBS平衡盐溶液购自北京欣经科技公司；浓硫酸购自博滨岭化工有限公司; 氘代试剂(CD3OD和CDCl3)购自Merck公司；色谱溶剂购自天津四友和天津康科德等公司；其他试剂均为重蒸工业试剂。
1.2 提取和分离将黄皮种子晒干粉碎，室温下用95%乙醇浸提3次，每次7 d。所得浸提液过滤后经减压浓缩得乙醇粗浸膏，随后将其分散于水中成悬浊液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别经减压浓缩得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相4部分。
乙酸乙酯萃取物(84.6 g)重结晶得到大量黄色晶体即化合物5，剩余样品经大孔吸附树脂以甲醇-水(40%~100%)和丙酮先后进行洗脱，分段收集, 通过TLC薄层色谱检测，合并相同的部分，得到13个流份Fr.1~Fr.13。Fr.6 (7.2 g)经RP-18反相柱色谱，以甲醇-水(40%~100%)为流动相进行梯度洗脱得到7个流份Fr.6.1~Fr.6.7。
Fr.6.2 (30.1 mg)经半制备高效液相色谱(C18柱; 20%乙腈水；流速4 mL min–1；检测波长200，254 nm)恒梯度洗脱得到化合物1 (2.5 mg，保留时间19.1 min)。
Fr.6.4 (1.8 g)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)分离得到4个流份Fr.6.4.1~Fr.6.4.4，Fr.6.4.1经重结晶得到白色晶体即化合物2 (3.6 mg)；剩余样品经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯(10:1~0:1)为流动相梯度洗脱后，经TLC薄层色谱检测合并得到9个流份Fr.6.4.1.1~Fr.6.4.1.9。Fr.6.4.1.8经半制备高效液相色谱(C18柱；40%乙腈水；流速4 mL min–1；检测波长200，254 nm)恒梯度洗脱得到化合物3 (14.2 mg，保留时间9.3 min)。Fr.6.4.1.5经半制备高效液相色谱(C18柱；35%乙腈水；流速4 mL min–1；检测波长200，254 nm)恒梯度洗脱得到化合物7 (3.0 mg，保留时间34.9 min)和化合物8 (11.0 mg, 保留时间24.0 min)。Fr.6.4.1.6经半制备高效液相色谱(C18柱；35%乙腈水；流速4 mL min–1；检测波长200，254 nm)恒梯度洗脱得到化合物9 (2.4 mg，保留时间23.2 min)。Fr.6.4.2经半制备高效液相色谱(C18柱；60%甲醇水；流速4 mL min–1；检测波长200，254 nm)恒梯度洗脱得到化合物10 (3.0 mg, 保留时间15.3 min)。
Fr.6.5 (3.2 g)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)分离得到4个流份Fr.6.5.1~Fr.6.5.4。Fr.6.5.2经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯(10:1~0:1)梯度洗脱后，通过TLC薄层色谱检测合并得到10个流份(Fr.6.5.2.1~Fr.6.5.2.10)。Fr.6.5.2.5经半制备高效液相色谱(C18柱；45%乙腈水；流速4 mL min–1；检测波长200，254 nm)恒梯度洗脱得到化合物4 (14.2 mg, 保留时间18.3 min)。Fr.6.5.4经半制备高效液相色谱(C18柱；50%甲醇水；流速4 mL min–1；检测波长200，254 nm)恒梯度洗脱得到化合物6 (5.9 mg, 保留时间41.6 min)。
1.3 全齿复活线虫致死活性测试全齿复活线虫致死活性测定方法参照马青云等[7]。全齿复活线虫接种于燕麦培养基上，28℃下培养7~10 d。按贝曼漏斗法，利用多层擦镜纸于无菌水中过滤线虫3次，获得线虫悬浮液。将1 mg待测样品溶于20 μL DMSO中配制成待测样品。于96孔板中分别配制以下反应体系：5 μL待测样品(终浓度为2.5 mg mL–1)+30 μL线虫悬浮液(约200~300条线虫)+无菌水65 μL作为实验组；5 μL DMSO+ 30 μL线虫悬浮液(约200~300条线虫)+无菌水65 μL作为阴性对照组；5 μL除线磷(终浓度为2.5 mg mL–1)+30 μL线虫悬浮液(约200~300条线虫)+无菌水65 μL作为阳性对照组，混匀后于室温条件下培养24 h，在解剖镜下观察并统计线虫死亡数，统计的线虫数量不少于100条。每个处理均设3次重复。线虫死亡率(%)=死亡线虫数/计数线虫总数×100%；线虫校正死亡率(%)=(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)× 100%。
1.4 结构鉴定N-甲基桂皮酰胺(1) 淡黄色晶体(CH3OH); ESI-MS m/z: 184.3 [M + Na]+; 分子式为C10H11NO; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.62 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-3), 7.46 (2H, dd, J = 6.7, 2.2 Hz, H-5, 9), 7.32 (3H, m, H-6, 7, 8), 6.44 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-2), 6.16 (1H, br s, NH), 2.93 (3H, d, J = 4.9 Hz, N-CH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 166.9 (C-1), 120.8 (C-2), 140.8 (C-3), 134.9 (C-4), 127.9 (C-5, 9), 128.9 (C-6, 8), 129.7 (C-7), 26.6 (N-CH3)。以上波谱数据与文献[8]报道的一致，故鉴定为N-甲基桂皮酰胺。
Clausenalansamide A (2) 白色晶体(CH3OH); ESI-MS m/z: 320.2 [M + Na]+; 分子式为C18H19NO3; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.12~7.32 (10H, m, Ar-CH), 6.11 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-1′), 5.97 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-2′), 4.92 (1H, dd, J = 5.0 Hz, H-3), 4.66 (1H, dd, J = 9.0, 5.0 Hz, H-2), 3.53 (1H, d, J = 7.1 Hz, 3-OH), 3.32 (1H, d, J = 9.0 Hz, 2-OH), 2.87 (3H, s, N-CH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 172.5 (C-1), 72.1 (C-2), 75.9 (C-3), 139.5 (C-4), 126.4 (C-5, 9), 128.4~128.9 (C-6, 7, 8, 4′, 5′, 6′, 7′, 8′), 127.3 (C-1′), 126.2 (C-2′), 133.7 (C-3′), 34.8 (N-CH3)。以上波谱数据与文献[9]报道的一致，故鉴定为clausenalansamide A。
3-Dehydroxy-3-methoxyl-clausenalansamide A (3) 无色油状物(CH3OH); ESI-MS m/z: 334.3 [M + Na]+; 推测分子式为C19H21NO3。对比化合物3与化合物2的碳氢谱数据及分子量，推测化合物3较化合物2少了1个羟基，而多了1个甲氧基，推测2位或3位碳上的羟基被替换成甲氧基。1H和13C NMR谱显示存在2个单取代苯环，1个顺式双键[δH 6.09 (d, J = 8.8 Hz)/δC 125.1; δH 6.31 (d, J = 8.8 Hz)/δC 128.1]，2个连氧取代的次甲基[δH 4.55 (dd, J = 9.4, 6.8 Hz)/δC 72.2; δH 4.20 (d, J = 6.8 Hz)/δC 86.2]，1个甲氧基[δH 3.11 (s)/δC 57.2]，1个氮甲基[δH 2.93 (s)/δC 35.20]。HMBC谱显示：H-1′与C-3′有相关; N-CH3与C-1′有相关，证明了CH3-N-CH=CH-Ph片段的存在；另外，N-CH3与酮羰基碳C-1有相关信号, H-2和H-3分别与C-1和C-4有相关信号，以及OCH3与C-3有相关信号，结合1H-1H COSY谱中的相关信号H-2/H-3，证明了CH3-N-C(O)-CH(OH)-CH(OCH3)-Ph片段的存在。综上所述，结合分子量，化合物3的结构鉴定为3-dehydroxy-3-methoxyl-clausenalansamide A[10]，为一新的天然产物。对化合物3的归属如下：1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.18~7.32 (10H, m, Ar-CH), 6.31 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-1′), 6.09 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-2′), 4.55 (1H, dd, J = 9.4, 6.8 Hz, H-2), 4.20 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-3), 3.11 (3H, s, OCH3), 3.03 (1H, d, J = 9.4 Hz, 2-OH), 2.93 (3H, s, N-CH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 173.3 (C-1), 72.2 (C-2), 86.2 (C-3), 137.9 (C-4), 128.1 (C-1′), 125.1 (C-2′), 134.2 (C-3′), 127.9-128.9 (Ar-CH), 57.2 (OCH3), 35.2 (N-CH3)。
Clausenalansamide B (4) 白色粉末(CH3OH); ESI-MS m/z: 304.3 [M + Na]+; 分子式为C18H19NO2; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.76 (1H, d, J = 15.4 Hz, H-3), 7.35~7.55 (10H, m, Ar-CH), 6.85 (1H, d, J = 15.4 Hz, H-2), 5.06 (1H, dd, J = 7.5, 2.4 Hz, H-2′), 4.82 (1H, br s, 2′-OH), 3.80 (1H, dd, J = 14.2, 7.5 Hz, H-1′a), 3.72 (1H, dd, J = 14.2, 2.4 Hz, H-1′b), 2.83 (3H, s, N-CH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 169.3 (C-1), 116.7 (C-2), 144.1 (C-3), 135.1 (C-4), 58.5 (C-1′), 74.0 (C-2′), 142.5 (C-3′), 126.0 (C-4′, 8′), 127.8~130.1 (C-5, 6, 7, 8, 9, 5′, 6′, 7′), 37.9 (N-CH3)。以上波谱数据与文献[11]报道的一致，故鉴定为clausenalansamide B。
黄皮新肉桂酰胺B (5) 淡黄色晶体(CH3OH); ESI-MS m/z: 286.3 [M + Na]+; 分子式为C18H17NO; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.58 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-3), 7.18~7.40 (10H, m, Ar-CH), 6.88 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-2), 6.44 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-1′), 6.19 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-2′), 3.04 (3H, s, N-CH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 166.5 (C-1), 118.4 (C-2), 142.8 (C-3), 128.8 (C-1′), 125.2 (C-2′), 134.5-135.3 (Ar-C), 128.0-129.8 (Ar-CH), 34.7 (N-CH3)。以上波谱数据与文献[12]报道的一致，故鉴定为黄皮新肉桂酰胺B。
N-(2-苯乙基)肉桂酰胺(6) 白色晶体(CH3OH); ESI-MS m/z: 274.3 [M + Na]+; 分子式为C17H17NO; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.53 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-3), 7.14~7.40 (10H, m, Ar-CH), 6.23 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-2), 5.54 (1H, br s, NH), 3.58 (2H, q, J = 6.6 Hz, H-1′), 2.81 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-2′)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 166.0 (C-1), 120.7 (C-2), 141.2 (C-3), 139.0 (C-4), 128.8~129.8 (C-5, 6, 7, 8, 9, 4′, 8′), 40.9 (C-1′), 35.8 (C-2′), 134.9 (C-3′), 127.9 (C-5′, 7′), 126.7 (C-6′)。以上波谱数据与文献[13]报道的一致，故鉴定化合物为N-(2-苯乙基)肉桂酰胺。
2′-Dehydroxy-2′-oxo-clausenalansamide B (7) 白色粉末(CH3OH); ESI-MS m/z: 302.3 [M + Na]+; 推测分子式为C18H17NO2。对比化合物7与化合物4的碳氢谱及分子量，发现化合物7较化合物4仅少了1个连氧次甲基，但多了一个羰基，推测4中2′位羟基被氧化成酮羰基。1H和13C NMR谱显示存在2个单取代苯环，1个反式双键[δH 7.61 (d, J = 15.5 Hz)/δC 143.6; δH 6.88 (d, J = 15.5 Hz)/δC 116.9], 1个亚甲基[δH 4.85 (s)/δC 54.8]，1个氮甲基[δH 3.16 (s)/δC 37.0]。HMBC谱显示：H-2，H-3和N-CH3与C-1有相关信号，H-3与C-4有相关信号，证实了CH3-N-C(O)-CH=CH-Ph片段的存在；另外, N-CH3与C-1′有相关信号，H-1′与C-2′，H-4′/H-8′与C-2′有相关信号，由此推测CH3-N-CH2-C(O)-Ph片段的存在。结合分子量，化合物7的结构鉴定为2′-dehydroxy-2′-oxo-clausenalansamide B[14], 为一新的天然产物。对化合物7的归属如下：1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.88 (2H, dd, J = 7.2, 1.2 Hz, H-4′, 8′), 7.61 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-3), 7.49 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-6′), 7.43 (2H, dd, J = 7.6, 1.5 Hz, H-5, 9), 7.37 (2H, t, J = 7.7 Hz, H-5′, 7′), 7.27 (3H, m, H-6, 7, 8), 6.88 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-2), 4.85 (2H, s, H-1′), 3.16 (3H, s, N-CH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 167.5 (C-1), 116.9 (C-2), 143.6 (C-3), 135.4 (C-4), 128.1 (C-5, 9), 128.9 (C-6, 8), 129.9 (C-7), 54.8 (C-1′), 194.6 (C-2′), 135.3 (C-3′), 128.1 (C-4′, 8′), 128.9 (C-5′, 7′), 133.8 (C-6′), 37.0 (N-CH3)。
Lansamide-7 (8) 白色晶体(CH3OH); ESI-MS m/z: 304.3 [M + Na]+; 分子式为C18H19NO2; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.21~7.28 (6H, m, H-3′, 4′, 5′, 3'', 4'', 5''), 6.89 (2H, dd, J = 8.2, 1.6 Hz, H-2′, 6′), 6.82 (2H, br d, J = 7.2 Hz, H-2'', 6''), 4.57 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-3), 3.82 (1H, dd, J = 10.1, 6.7 Hz, H-6a), 3.28 (1H, d, J = 10.1 Hz, H-6b), 3.23 (1H, dd, J = 10.0, 8.8 Hz, H-4), 3.14 (1H, dd, J = 8.8, 6.7 Hz, H-5), 3.04 (3H, s, N-CH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 176.6 (C-2), 72.8 (C-3), 51.3 (C-4), 40.5 (C-5), 56.1 (C-6), 140.3 (C-1′), 127.6~128.6 (Ar-CH), 140.7 (C-1''), 29.9 (N-CH3)。以上波谱数据与文献[15]报道的一致，故鉴定为lansamide-7。
Homoclausenamide (9) 白色晶体(CH3OH); ESI-MS m/z: 302.2 [M + Na]+; 分子式C18H17NO2; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7.06~7.21 (10H, m, Ar-CH), 6.41 (1H, s, H-6), 4.36 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-3), 4.21 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-4), 3.25 (3H, s, NCH3)；13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 169.4 (C-2), 73.4 (C-3), 49.7 (C-4), 120.9 (C-5), 128.4 (C-6), 139.3 (C-1′), 137.7 (C-1''), 126.3~128.8 (Ar-CH), 34.5 (NCH3)。以上波谱数据与文献[16]报道的一致，故鉴定化合物为homoclausenamide。
1, 5-Dihydro-5-hydroxy-1-methyl-3, 5-diphenyl-2H-pyrrol-2-one (10) 白色油状物(CH3OH); ESI-MS m/z: 288.3 [M + Na]+; 推测分子式为C17H15NO2, 不饱和度为11。1H和13C NMR谱显示存在2个单取代苯环，1个双键上的质子[δH 7.18 (s)/δC 145.5]，1个连氧季碳[δC 90.9]，1个氮甲基[δH 2.73 (s)/δC 24.3]。HMBC谱显示：N-CH3与酮羰基C-2和C-5有相关信号，H-4与酮羰基C-2、C-3和C-5有相关信号，结合不饱和度及分子量，推测5-hydroxy-1-methyl-1, 5-dihydro-2H-pyrrol-2-one骨架的存在。另外，Ar-CH与C-3和C-5均有相关信号，证实两个单取代苯环应分别连在C-3和C-5上。综上所述, 化合物10的结构鉴定为1, 5-dihydro-5-hydroxy-1-methyl-3, 5-diphenyl-2H-pyrrol-2-one[17]，为一新的天然产物。对化合物10的归属如下：1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7.86 (2H, dd, J = 7.3, 2.1 Hz, H-2'', 6''), 7.34~7.41 (8H, m, C-2′, 3′, 4′, 5′, 6′, 3'', 4'', 5''), 7.18 (1H, s, H-4), 2.78 (3H, s, N-CH3)；13C NMR (CD3OD, 125 MHz): δC 171.1 (C-2), 138.9 (C-3), 145.5 (C-4), 90.9 (C-5), 132.4 (C-1′), 135.4 (C-1''), 127.0~130.0 (Ar-CH), 24.3 (N-CH3)。
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图 1 化合物1~10的结构 Fig. 1 Structures of compounds 1-10 |
对化合物2~8进行全齿复活线虫致死活性的测试，结果表明，所有化合物均有一定的致死活性, 其中，化合物2, 3, 5和8对全齿复活线虫的致死活性均优于阳性对照除线磷, 2.5 mg mL–1的化合物致死率分别为56.48%、79.58%、71.49%和46.14% (表 1)。
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表 1 化合物2~8 (2.5 mg mL–1)的全齿复活线虫致死活性 Table 1 Nematicidal activities of compounds 2-8 (2.5 mg mL–1) against Panagrellus redivivusl |
本课题组前期从黄皮果皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分发现了大量的咔唑类生物碱[18]，而本研究从黄皮种子中分离得到10个化合物，分别为：N-甲基桂皮酰胺(1)，clausenalansamide A (2), 3-dehydroxy-3-methoxyl-clausenalansamide A (3), clausenalansamide B (4)，黄皮新肉桂酰胺B (5)，N-(2-senamide (9)和1, 5-dihydro-5-hydroxy-1-methyl-3, 5-diphenyl-2H-pyrrol-2-one (10)。其中大部分化合物为酰胺类生物碱，尚未发现咔唑类生物碱，与黄皮果实的化学成分存在一定的差异。同时，本研究首次对黄皮种子中的酰胺类生物碱进行全齿复活线虫致死活性的研究，结果显示，所测酰胺类生物碱均有一定的致死活性，部分酰胺类生物碱有较强的致死活性，甚至优于阳性对照除线磷。相比化合物2和化合物3，二者的区别仅在于3位的取代基，但化合物3的活性明显优于化合物2，推测结构中3位羟基甲氧化有助于提高活性。对比化合物4、5和7，三者结构上的区别在于1′和2′位的取代基不同，但对比其活性发现化合物4和化合物7的活性均较弱，说明2′位的羟基或羰基取代对活性影响不大，但当1′，2′形成双键时即化合物5，其活性则有较大的提高，说明该双键对杀全齿复活线虫活性有着重要意义。本研究为进一步开发黄皮种子中的酰胺类生物碱为新型的低毒且高效的农药提供了新的思路。
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