对于多年生植物，直接从田间植株或幼苗上切取外植体进行离体再生和遗传转化研究时，存在消毒困难和褐化严重等问题，因而，常从种子萌发的无菌苗上切取组织作为离体再生的外植体^[1]，这就使得离体再生和遗传转化研究常受制于具萌发能力种子的有效供应。

种子萌发受多种因素影响，包括成熟度和植物激素等内在因素以及温度、湿度等外界因素^[2-3]。前人研究表明，种子成熟程度影响种子萌发，过早采收果实可导致种子发芽不良，这在一年生作物上尤为明显^[4-6]。但接近完熟果实中的种子具有正常萌芽能力，如一年生作物水稻(Oryza sativa)^[4]和玉米(Zea mays)^[5]及木本植物青皮(Vatica mangachapoi)^[7]、毛叶山桐子(Idesia polycarpa)^[8]和桃(Amygdalus persica)^[9]。

根据贮藏性能的不同，种子分为正常性种子、顽拗性种子和中间性种子，其中顽拗性种子常不耐长期贮藏^{[2, 10]}。温度、湿度和贮藏时间等外界因素对顽拗性种子活力和寿命的影响较大^[2]，如银杏(Ginkgo biloba)种子的最适贮藏温度为4℃^[11]；坡垒(Hopea hainanensis)的为15℃~20℃^[12]。

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)是我国南方重要果树，开展枇杷离体再生和遗传转化研究具有重要意义。前人对枇杷种子萌发曾有研究，'解放钟'枇杷种子不耐贮藏，对脱水敏感，在15℃和种子含水量保持51%的条件下贮藏才能维持较佳的种子活力^[13]，因此，枇杷属于顽拗性种子^[13-14]。'解放钟'和'Advance'枇杷具有轻度休眠特性，适度低温、GA₃处理或低温结合GA₃处理可提高种子萌发率^[15-16]。对枇杷种子萌发研究尚不系统，所涉及的品种有限。转色期采收的枇杷果实的种子萌发能力、适宜贮藏温度和贮藏期在品种间是否存在差异、果实贮藏和种子贮藏在维持种子活力上是否不同等问题均有待研究。

本研究旨在探究枇杷果实采收成熟度和贮藏条件对种子萌发的影响，以明确果实于转色期提前采收以及果实采收后通过果实或种子贮藏延长具萌发能力的种子供应期的可行性。

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)的3个白肉品种('软条白沙'、'宁海白'、'塘科')和2个红肉品种('大房'、'大红袍')的转色期和完熟期果实取自浙江省农业科学院枇杷种质资源圃。另1个白肉品种('太平白')和另2个红肉品种('洛阳青'、'早钟6号')完熟期果实分别采自浙江省台州市、福建省福清市和浙江省丽水市产区。

'洛阳青'枇杷完熟期果实或种子于4℃下分别贮藏0 d、5 d、10 d、20 d、30 d、40 d后取种子播种。'早钟6号'和'太平白'完熟期果实的种子分别于4℃、15℃、25℃下贮藏0 d、15 d、30 d、45 d后播种。

以未贮藏的种子为对照，每处理设置3个生物学重复，以15粒种子为1个重复。

枇杷种子从果实中取出用流水冲洗2 h，然后用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗，再用2% NaClO溶液消毒10 min，无菌水冲洗3~5次，用无菌滤纸吸干表面水分后置于1/2MS培养基上，于24℃黑暗条件下培养15 d，再转入16 h/8 h光/暗周期下培养。播种后每隔10 d统计萌发率和苗高。未萌发的种子不参与苗高统计。

使用Excel和SPSS软件对种子萌发率和苗高进行方差分析和多重比较。

萌发试验结果表明，'软条白沙'和'宁海白'完熟期果实的种子在播后10 d萌发，而'塘科白沙'和'大房'完熟期果实的种子在播后20 d萌发，均比转色期果实的种子提前10 d萌发，但'大红袍'则是转色期果实的种子先萌发，也提前10 d (图 1)。除'大房'外，'软条白沙'、'宁海白'、'塘科'和'大红袍'播种80 d的种子萌发率并不受果实成熟度的影响(图 1)。在苗高方面，'软条白沙'完熟期果实的种子萌发后的苗高显著高于转色期果实的(高43.3%)，而其余4个品种完熟期和转色期果实的种子在播后80 d的苗高无显著差异(表 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 果实成熟度对枇杷种子萌发率的影响 Fig. 1 Effect of fruit maturity on germination rate of loquat seeds

表 1(Table 1)

表 1 果实成熟度对播种80 d枇杷苗高(cm)的影响 Table 1 Effect of fruit maturity on seedling height (cm) of loquat after sowing 80 days '软条白沙' 'Ruantiaobaisha' '宁海白' 'Ninghaibai' '塘科白沙' 'Tangkebaisha' '大房' 'Oobusa' '大红袍' 'Dahongpao' 转色期Color turning stage 6.0±0.6b 3.5±0.8a 5.9±0.4a 4.3±0.7a 2.6±0.3a 成熟期Mature stage 8.6±0.5a 5.2±0.6a 5.5±0.7a 1.9±0.7a 3.5±1.1a 数据后不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下表同。 Data followed different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same is following Tables.

表 1 果实成熟度对播种80 d枇杷苗高(cm)的影响 Table 1 Effect of fruit maturity on seedling height (cm) of loquat after sowing 80 days

将'洛阳青'枇杷种子或果实在4℃下贮藏5 d或10 d对种子萌发无不利影响，播后80 d的萌发率和苗高略高于或接近未贮藏的种子，且果实贮藏的种子有提前萌发(提前10 d)的效应。但贮藏期大于20 d，贮藏的种子在播后80 d的萌发率显著下降(仅约为10%)，特别是果实贮藏40 d后的种子播后80 d全部没有萌发；贮藏40 d后的种子播后80 d虽有9.5%的萌发率，但苗高显著低于未贮藏的种子(图 2，表 2)。

图 2(Fig. 2)

图 2 4℃下贮藏天数对'洛阳青'枇杷种子萌发率的影响 Fig. 2 Effects of storage days under 4℃ on germination rate of 'Luoyangqing' seeds

表 2(Table 2)

表 2 4℃下贮藏天数对'洛阳青'枇杷种子播种80 d后苗高(cm)的影响 Table 2 Effects of storage days under 4℃on seedling height (cm) of 'Luoyangqing' seeds after sowing 80 days 贮藏时间Storage days 0 5 10 20 30 40 果实贮藏Fruit storage 2.8±0.7cde 3.8±0.4bc 5.0±0.5ab 4.5±0.4abc 3.0±1.1cd 0.0±0.0e 种子贮藏Seed storage 2.8±0.7cde 4.1±0.9abc 5.7±0.3a 3.2±1.1bc 2.9±0.3cde 1.1±0.2e

表 2 4℃下贮藏天数对'洛阳青'枇杷种子播种80 d后苗高(cm)的影响 Table 2 Effects of storage days under 4℃on seedling height (cm) of 'Luoyangqing' seeds after sowing 80 days

以'早钟6号'和'太平白'枇杷为试材，研究了不同贮藏温度和时间对种子萌发率和苗高的影响(表 3)。'早钟6号'种子在4℃或15℃贮藏15 d对种子萌发没有明显影响；而25℃贮藏则不利于种子萌发，播后80 d的种子萌发率比对照降低了近1/3。'早钟6号'种子贮藏30 d的萌发率显著下降，随贮藏温度升高萌发率下降幅度更大，如25℃贮藏30 d后的种子在播后80 d的萌发率仅为13.9%，只为对照的1/6；种子经25℃贮藏30 d后再播种，在播后80 d的苗高也显著下降；'早钟6号'种子贮藏45 d完全丧失萌发能力(表 3)。贮藏对种子萌发的不利效应也在'太平白'枇杷上观察到，但相比'早钟6号'，这一效应相对较弱，在3个温度下贮藏45 d仍能维持约50%的萌发率(表 3)。不同温度对'太平白'萌发的影响存在差异，在15℃下贮藏30 d的种子在播后80 d的萌发率和苗高与对照相近，但在4℃和25℃贮藏的种子萌发率显著下降(约下降50%)。因此, 为保持一定的种子活力，'早钟6号'种子贮藏时间不宜超过15 d，'太平白'种子贮藏时间不宜超过30 d。

表 3(Table 3)

表 3 贮藏温度对播种80 d种子萌发率和苗高的影响 Table 3 Effect of storage temperature on germination rate and seedling height of loquat after sowing 80 days 品种Cultivar 时间Day 温度Temperature (℃) 萌发率Germination rate (%) 苗高Height (cm) '早钟6号''Zaozhong 6' 对照Control 82.4±13.6a 5.3±0.3b 15 4 76.7±6.7a 6.2±1.2ab 15 82.1±9.0a 5.6±0.4ab 25 51.0±5.0b 4.1±0.8bc 30 4 50.9±12.5bc 5.4±0.7ab 15 29.0±2.4cd 7.7±0.7a 25 13.9±7.4de 2.7±1.8c 45 4 0.0±0.0e 0.0±0.0d 15 0.0±0.0e 0.0±0.0d 25 0.0±0.0e 0.0±0.0d '太平白''Taipingbai' 对照Control 94.4±5.6a 6.4±0.4a 15 4 83.3±8.8ab 5.9±1.0ab 15 100.0±0.0a 7.0±0.1a 25 80.0±15.3abc 5.3±0.5abc 30 4 50.0±15.3cd 5.4±0.7abc 15 90.2±9.1a 5.4±0.2abc 25 46.7±3.3d 3.7±0.7cd 45 4 46.7±12.0d 4.3±0.3bcd 15 56.7±12.0bcd 3.2±0.7d 25 41.9±10.3d 6.1±1.2ab

表 3 贮藏温度对播种80 d种子萌发率和苗高的影响 Table 3 Effect of storage temperature on germination rate and seedling height of loquat after sowing 80 days

种子发育需要果实提供营养，因此，过早将种子从果实中取出会导致种子发育不良而影响萌发, 但这并不意味着果实必须要达到完全成熟。近成熟的青皮果实与成熟果实的种子在萌发特征和幼苗生长方面不存在显著差异^[7]; 中熟桃品种的果实达八、九成熟时种子发芽率可达100%^[9]。毛叶山桐子(Idesia polycarpa)未完全成熟的深红色果实比完全成熟的黑褐色果实中的种子具有更高的发芽率^[8]。本研究结果表明，多数试验枇杷品种，可提早至转色期采收果实而获取同等萌发能力的种子，但'大房'枇杷完全成熟果实中的种子具有较高的萌发率, '大房'原产于日本，品种间的这种差异是否与品种的起源地有关值得探究。

枇杷属于顽拗性种子^[13-14]。顽拗性种子的特点是不耐脱水，其中热带植物的种子还大多对低温敏感，而温带植物的种子则相对较不敏感^{[2, 14]}。本研究采取了种子或果实保湿贮藏的措施避免了种子脱水，但较长时间的贮藏仍然影响种子的萌发能力，这与顽拗性种子易丧失活力，寿命通常只有数月的结论相符^[13-14]。贮藏温度影响枇杷种子活力的保持，然而，供试的2个枇杷品种种子对低温(4℃或15℃)并不敏感，相反'早钟6号'并不适于常温(25℃)贮藏(表 3)。陈俊松等^[13]以'解放钟'枇杷为试材，认为15℃是最佳贮藏温度，而5℃和25℃均不理想。因此，15℃可作为枇杷种子贮藏的首选试验温度, 但品种间存在较大差异。关于白肉类和红肉类枇杷是否普遍存在最佳贮藏温度差异现象，仍需进一步的探究。

顽拗性种子大多没有休眠特性，但也有一些种类有^[14]。本研究供试的8个品种中有5个品种('软条白沙'、'宁海白'、'塘科白沙'、'太平白'和'早钟6号')的种子随采随播可以获得80%以上的萌发率, 而另3个品种('大房'、'大红袍'和'洛阳青')则只有40%~80%。'洛阳青在4℃贮藏5 d或10 d有助于种子萌发，但4℃贮藏15 d对'早钟6号'和'太平白'的萌发率影响不大。'Advance'枇杷(埃及品种)经5℃低温处理3周或于250 mg L^-1 GA₃浸泡20 h后再于5℃处理1周可提高种子萌发率至80%左右，但未经处理的对照种子也仍有40%的萌发率^[16]。'解放钟'枇杷相类似，0.1~0.5 mmol L^-1 GA₃处理种子24 h可使种子接近全部萌发，但未经处理的种子也有85%左右的萌发率^[15]。可见，虽品种不同，枇杷种子没有或只有轻度的休眠特性。值得一提的是, 4个白肉品种种子随采随播80 d后的萌发率全部高于4个红肉品种(白肉和红肉品种平均萌发率分别为93.4%和63.5%)，其内在原因尚不清楚。前期研究中，我们观察到白肉品种果实类胡萝卜素含量较低^[17]，而类胡萝卜素是ABA合成的前体，这使得白肉品种种子ABA含量低于红肉品种成为可能, 从而利于种子萌发。白肉品种种子中的ABA含量是否确实低于红肉品种还值得进一步研究。

枇杷离体再生与遗传转化研究需要无菌苗用于制备外植体。本研究表明可以通过适度提前采收和适宜贮藏延长有萌发能力的种子的供应期。此外，还可以利用枇杷不同品种、不同产地和设施栽培条件下的不同成熟期以及我国南方一些地区枇杷一年多熟的特性进一步延长这一供应期。同时, 宜加强对枇杷种子丧失活力的机制研究，以期在此基础上探索出延长种子活力的贮藏措施。